抽象的gydF4y2Ba
背景gydF4y2Ba肺酸性松病是一种炎症疾病,其特征在于肉芽肿形成和异质临床结果。肿瘤坏死因子(TNF)是促进肉芽肿形成的促炎细胞因子,并且已经显示出高水平的TNF与渐进性疾病相关联。单核吞噬细胞(MNP)是TNF的有效生产者,对炎症高度响应。在结节病时,肺泡巨噬细胞已经很好地研究过。然而,尽管它们在炎症中作用,但MnPS还包括单核细胞/单核细胞衍生的细胞和树突细胞,其在炎症中的核心作用。gydF4y2Ba
客观的gydF4y2Ba探讨结节病中肺单核细胞来源细胞和树突状细胞的作用。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba从108患者和30例健康对照,我们对血液和支气管肺泡灌洗(BAL)流体的MNP子集进行了深入的表型,功能和转录组分析。我们遵循患者的临床开发,并评估了MNP子集在诊断中的曲目和功能如何与2年疾病结果相关。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba与健康对照相比,单核细胞/单核细胞衍生的细胞在血液和血液中增加了血液和血栓血症。有趣的是,诊断时血液中间单核细胞高频患者与慢性疾病发育相关。RNA测序分析显示出在结节病患者BAL中的高炎症MNP。此外,在诊断时在诊断时不会在没有外源刺激的情况下产生TNF的Bal单核细胞/单核细胞衍生细胞的频率。与肺泡巨噬细胞相比,在诊断时在诊断时产生TNF的BAL单核细胞/单核细胞衍生细胞的频率在开发疾病的顺节病变患者中最高。gydF4y2Ba
结论gydF4y2Ba我们的数据显示,肺单核细胞/单核细胞衍生的细胞是高度炎症的,可用作结节病症患者的疾病结果的预测因子。gydF4y2Ba
抽象的gydF4y2Ba
血液病变患者血液和肺单核吞噬细胞的表型,转录组和功能映射,发现诊断时肺单核细胞的频率和功能预测了结节病的2年结果gydF4y2Bahttps://bit.ly/2jx8fhr.gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
结节病是一种多系统T细胞驱动的炎症性炎症性,具有广泛的临床异质性。结节病的标志是形成最常影响肺部的肉芽肿。结节病在2年内以30-40%的病例解决[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba].在瑞典,三分之一的结节病患者患有急性疾病发病,称为Löfgren的综合征(LS),伴随着良好的预后。但是,三分之二的患者患有逐渐发作(非LS)结节病,这些患者更有可能发展慢性疾病[gydF4y2Ba5gydF4y2Ba].疾病严重程度尚不清楚,但除了遗传和环境因素之外,疾病发展早期的局部免疫事件可能会设定疾病进展的阶段[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
t细胞已经得到了最好的研究,t细胞驱动的疾病病理生理学机制已经被确定,而结节病的先天免疫机制还不太清楚[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba].已经鉴定了预测疾病严重程度的几种生物学标记,例如血清白细胞介素(IL)-2受体,血清淀粉样蛋白A和肿瘤坏死因子(TNF),而预测疾病结果的候选者仍然缺乏[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].TNF是一种由多种细胞产生的多功能细胞因子,对肉芽肿的诱导和维持具有重要作用[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba,gydF4y2Ba10gydF4y2Ba].gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba培养的肺泡巨噬细胞来自患者是TNF的主要生产商[gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba12gydF4y2Ba].在结节病中,肺泡巨噬细胞产生TNF而没有外源刺激,并且在患有渐进性疾病的患者中测量最高水平的TNF [gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].因此,靶向TNF的药物用作非LS患者的第三线治疗,导致治疗患者的亚组中临床改善[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
除了肺泡巨噬细胞,单核细胞/单核细胞来源的细胞和树突状细胞,统称单核吞噬细胞(MNPs),也被发现排列在呼吸道粘膜[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba].来自健康对照的肺单核细胞/单核细胞衍生的细胞是刺激后TNF的有效生产者gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba].然而,目前无法获得来自鼻窦病患者的肺单核细胞/单核细胞衍生细胞的功能数据。我们以前报告了非LS和LS患者的肺单核细胞/单核细胞衍生细胞的分布没有差异,但与来自健康对照的肺单核细胞/单核细胞衍生细胞的比较仍然缺失[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba].然而,血液单核细胞被证明是在结节病的影响。CD14.gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba中间单核细胞是单核细胞的一组,在结节病症患者的循环中扩增,可能是由于在其他炎症疾病中观察到的全身炎症[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].此外,在抗tnf治疗反应的患者中,循环中间单核细胞的频率较高[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba].与单核细胞相比,树突细胞的分布在结节病病人的血液或支气管肺泡(BAL)中没有改变[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
在本研究中,我们旨在确定肺单核细胞/单核细胞衍生细胞在多大程度上有助于在结节病中炎症有助于炎症。在一个详细的纵向研究中,我们表明单核细胞/单核细胞衍生的细胞通过TNF生产积极促进炎症,并与非LS结节病中的疾病进展相关。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
研究设计与患者特征gydF4y2Ba
该研究由斯德哥尔摩和瑞典·乌斯诺,瑞典区域道德审查委员会批准,并根据赫尔辛基宣言进行。108患者和30名健康志愿者被列入研究并提供书面知情同意(gydF4y2Ba表格1gydF4y2Ba).支气管镜检查在斯德哥尔摩的卡罗林斯卡大学医院进行,或在大学医院,Umeå,如前所述[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].所有患者都被新诊断出患有肺结气,如世界顺节病和其他肉芽肿障碍指南所定义的肺酸性松病程[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba基于临床征象、胸片检查结果、组织活检中BAL或非干酪性肉芽肿CD4/CD8 t细胞比值升高(gydF4y2Ba表格1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充图S1A-CgydF4y2Ba).20例患者根据临床体征(急性病发作、双肺门淋巴结肿大、结节性红斑和/或关节周围腱鞘炎)诊断为LS。gydF4y2Ba
在九个非LS患者的群组中,作为受控运动的研究的一部分[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba],第二个支气管镜检查在第一个后第一次进行6个月后进行纵向遵循患者(gydF4y2Ba表2.gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
建立诊断后2年评估疾病结果。在这项研究中,69名患者通过了2年的标记,并以下列疾病结果之一进行了特征:1)缓解(无症状和胸部放射症);2)慢性稳定(肺部表现稳定而没有恶化,实验室参数没有炎症活性的迹象;没有或较小的胸部放射性变化与先前的评估相比,无需全身治疗);3)慢性进行(胸部放射性症状的恶化与先前的评估相比,需要全身治疗)。gydF4y2Ba
来自血液和BAL和流式细胞术的单细胞制剂gydF4y2Ba
取血和BAL后1小时内进行处理,以便进一步应用。采用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞。BAL样本保存在冰中,通过100 μm尼龙过滤器(Syntab Therapeutics, Würselen, Germany)过滤,并在400×离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在下游应用前15分钟。将细胞悬浮液与Live / Dead™可固定的Aqua / Blue Dear Cell染色套件(Life Technologies,Waltham,MA,USA)和FC受体一起孵育使用FCR块(Miltenyi,Bergisch Gladbach,德国),然后用针对表面分子的抗体染色(gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba).对于细胞内染色,使用Foxp3 /转录因子染色缓冲液(Invitrogen,Waltham,Ma,USA)固定细胞。简而言之,在室温下将细胞固定20分钟,然后用针对细胞内分子的抗体染色(gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba).使用LSRII或LSR Fortessa流式细胞仪(BD, Franklin Lakes, NJ, USA)分析细胞,使用FlowJo X软件(BD)分析数据。gydF4y2Ba
荧光激活的细胞分选gydF4y2Ba
对于细胞分选,血细胞使用玫瑰蕾丝人单核细胞浓缩鸡尾酒(STEMCELL Technologies,Vancouver,BC,加拿大)富集。从研究受试者检索后1小时内使用血液和BAL细胞并用验证的抗体面板染色(gydF4y2Ba补充表S1gydF4y2Ba).细胞分选采用FACS Aria Fusion或AriaIII(两种BD)。分选的细胞随后在Qiazol Lysis试剂(Qiagen, Venlo, Netherlands)中重悬,并在−80°C下保存,直到进一步使用。gydF4y2Ba
RNA分离和测序gydF4y2Ba
有关RNA分离和RNA测序的详细信息,请参阅gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
刺激PBMC和BAL细胞gydF4y2Ba
PBMCS和BAL细胞在1×10培养gydF4y2Ba6gydF4y2Ba cells·mL−1gydF4y2Ba在RPMI 1640(Merck,德国Darmstadt,德国)含有10%胎牛血清(Invitrogen)。将细胞培养3小时,无刺激或1μg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2Ba脂多糖(LPS)(默克公司;gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba加入O111:B4,L4391)。10μg·mLgydF4y2Ba−1gydF4y2BaBrefeldin A(Merck)已添加。gydF4y2Ba
埃莉莎gydF4y2Ba
有关使用ELISA的细胞因子分析的详细信息,请参阅gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
除非另有说明,否则数字数据总结了中位数。使用Mann-Whitney U-Test进行统计分析,使用DUNN的试验进行DUNNETRIC Kruskal-Wallis试验进行DUNN的校正多重比较,以及配对的Wilcoxon签名秩检验。Spearman的等级相关系数用于相关分析。用Logistic回归估计预测模型。结果变量被定义为缓解gydF4y2Ba相对gydF4y2Ba没有缓解(慢性稳定和慢性进行)以及慢性稳定gydF4y2Ba相对gydF4y2Ba慢性渐进。预测者一次一个地进入模型。通过虚拟变量引入分类预测因子。使用GraphPad Prism 8.0版本(GraphPad Software, San Diego, CA, USA)和Stata (StataCorp, College Station, TX, USA)对数据进行分析。结果被认为在p<0.05水平上有统计学意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
CD14.gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba单核细胞/单核细胞衍生的细胞在血液和结节病患者的血液和BAL中增加gydF4y2Ba
为了探讨LS和非LS结节病的MNP子集的频率与健康对照相比,我们在匹配的BAL和血液样本上进行了多色流量细胞仪。在非LS和LS患者中,基于高侧散射和自发荧光鉴定的肺泡巨噬细胞的频率在非LS和LS患者中减少了与健康对照(gydF4y2Ba图1B.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S1d.gydF4y2Ba).在血液和BAL中,MNP被鉴定为人白细胞抗原(HLA)-DRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba和谱系消极(gydF4y2Ba图1AgydF4y2Ba- b和gydF4y2Ba补充图S1E和F.gydF4y2Ba).此外,还鉴定了3个单核细胞亚群以及浆细胞样树突状细胞(PDC)和常规树突状细胞(cDC)1和cDC2 (gydF4y2Ba图1C.gydF4y2Ba).总体而言,MNP亚群的分布因其来源为血液或BAL而差异最大(gydF4y2Ba图1DgydF4y2Ba-我和gydF4y2Ba补充图S2a和bgydF4y2Ba).仍然,在CD14中观察到显着差异gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba中间体单核细胞,在非LS和LS患者和非LS患者的血液中增加,与健康对照相比(gydF4y2Ba图1E.gydF4y2Ba).与健康对照相比,CDC2和CDC1分别在非LS患者中分别在BAL和血液中显着降低(gydF4y2Ba图1G.gydF4y2Ba和h)。关于MNP的成熟状态,最明显的差异是通过Upregulation HLA-DR和CD86的血液MNP更加成熟。然而,与来自每种解剖室内的健康对照组相比,来自非LS患者的非LS患者的MNP和BAL表达了更高水平的HLA-DR和CD86(gydF4y2Ba补充图S2C和D.gydF4y2Ba).总之,基于流式细胞术分析,我们记录了树突状细胞和单核细胞和单核细胞/单核细胞衍生细胞的频率和成熟的有限的有限,并且在结节病患者中血液中的单核细胞/单核细胞衍生细胞。gydF4y2Ba
来自酸松病变患者的MNP呈现炎症基因签名gydF4y2Ba
为了进一步检查在结节病中的MNP中,我们将血液和黑树枝状细胞和单核细胞/单核细胞衍生的细胞以及来自非LS患者的BAL的肺泡巨噬细胞和健康对照组,并在总九种不同群体中进行RNA测序(gydF4y2Ba图2AgydF4y2Ba).主成分分析显示,样本是根据组织来源和细胞亚群分布的,而不是来自非ls患者或健康对照者(gydF4y2Ba图2B.gydF4y2Ba).我们发现基因在与细胞成熟相关的Bal MNP中上调(gydF4y2BaCD40.gydF4y2Ba,gydF4y2BaCD80.gydF4y2Ba,gydF4y2BaCD83.gydF4y2Ba),炎症反应(gydF4y2BaTLR3.gydF4y2Ba,gydF4y2BaTLR7.gydF4y2Ba),细胞因子信号(gydF4y2BaTNF.gydF4y2Ba,gydF4y2Bail1b.gydF4y2Ba,gydF4y2BaCSF1.gydF4y2Ba,gydF4y2BaTGFβgydF4y2Ba)和趋化性(gydF4y2BaCCR6.gydF4y2Ba,gydF4y2BaCCR7.gydF4y2Ba也gydF4y2BaCCL2.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba和gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)与非LS患者和健康对照中的血液MNP相比(gydF4y2Ba图2CgydF4y2Ba).mRNA表达的差异gydF4y2BaCCR6.gydF4y2Ba,gydF4y2BaCCR7.gydF4y2Ba,gydF4y2BaCD207.gydF4y2Ba和gydF4y2BaPD-L1gydF4y2Ba,对于MNP的功能至关重要,在蛋白质水平上确认(gydF4y2Ba图2DgydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S2C-EgydF4y2Ba).重要的是,我们在比较非LS患者和健康对照的细胞亚集中分析了基因签名。我们观察到与TNF,IL-17和Toll样受体(TLR)信号传导相关的基因的上调(gydF4y2Ba图2E.gydF4y2Ba)在非LS患者中,与健康对照相比。每个测序的MNP子集的基因设定浓缩分析验证了与TNF途径相关的基因的高表达(例如gydF4y2BaTNF.gydF4y2Ba,gydF4y2Bail1b.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba白细胞介素6gydF4y2Ba,gydF4y2Banr4a1.gydF4y2Ba和gydF4y2Barel.gydF4y2Ba)以及与健康对照组相比的非ls患者样本中的其他免疫相关途径(gydF4y2Ba图2f.gydF4y2Ba).总之,利用RNA测序揭示了非ls患者与健康对照组相比,在MNP亚群中上调的细胞因子信号传递方面的明显差异,特别是与TNF信号传递相关的差异。gydF4y2Ba
来自非LS患者的单核细胞/单核细胞衍生的细胞在诊断和疾病发展期间显示出高TNF基因和蛋白质表达gydF4y2Ba
接下来,我们分析了非LS患者的各个MNP子集中的富集的TNF信号通路是否具有功能影响。相对表达gydF4y2BaTNF.gydF4y2Ba与血液相比,BAL MNPs中MNPs的基因转录本总体上更高(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba).此外,gydF4y2BaTNF.gydF4y2Ba在非LS患者的每个子集中与健康对照MNP(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba).为了确认这一点,我们可以使用细胞内细胞因子染色和流式细胞术中单个MNP中的TNF蛋白质gydF4y2Ba离体gydF4y2Ba或3小时后有没有刺激的文化(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba).在所有受试者的血液中,只有在单核细胞的LPS刺激后才能检测到TNF(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S4agydF4y2Ba).相比之下,BAL单核细胞/单核细胞源性细胞在没有刺激的情况下,TNF在细胞内聚集(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba和c)。在一些患者中,添加LPS不会导致TNF表达细胞的频率高于未刺激的条件(gydF4y2Ba补充图S4agydF4y2Ba).与健康对照和LS患者相比,非LS患者的未刺激TNF表达的MNP的频率显着较高(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba).与树突细胞相比,表达单核细胞/单核细胞衍生细胞的未刺激TNF的频率较高(gydF4y2Ba补充图S4B.gydF4y2Ba).产生的TNF的单核细胞/单核细胞衍生细胞的较高频率正相关,具有较高频率的TNF产生的TNF产生巨噬细胞或同一患者的树突细胞(gydF4y2Ba补充图S4CgydF4y2Ba).TNF可在等离子体和BAL流体中检测;然而,在分泌的TNF和未刺激的TNF表达的BAL单核细胞/单核细胞衍生细胞的频率之间没有观察到相关性(gydF4y2Ba补充图S4D和E.gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
IL-6信号传导途径还富集来自非LS患者的MNP的RNA测序分析,并且我们确认了IL-6的类似转录和蛋白表达模式,如TNF所示(gydF4y2Ba补充图S5A-F.gydF4y2Ba).与非LS患者和健康对照组相比,LS患者在未刺激的BAL MNP中显示出较高频率的IL-6表达频率。TNF-和IL-6的频率表达未刺激的BAL单核细胞/单核细胞衍生的细胞在健康对照和非LS患者中具有正相关,但显示出LS患者的负相关趋势(gydF4y2Ba补充图S5GgydF4y2Ba).此外,与健康对照或LS患者相比,IL-1β在血浆中显着增加,但非LS患者的BAL流体(gydF4y2Ba补充图S6gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
为了评估BAL中tnf -产生MNPs的升高是否在疾病发展期间维持,我们分析了一项研究的样本,其中新诊断的结节病患者遵循受控的体育锻炼计划,但没有接受任何治疗[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba].我们观察到,来自非LS患者的TNF表达未刺激的MNP的频率随着时间的推移而增加(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba).在此期间,不会改变表达MNP的IL-6的频率以及MNP分布(gydF4y2Ba图3 dgydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S7A-CgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
我们的数据表明,在LS患者和HS患者和健康对照的诊断时,在BAL中产生TNF的单核细胞/单核细胞衍生细胞的升高频率,无需额外刺激,标志着非LS患者的重要免疫差异。gydF4y2Ba
单核细胞/单核细胞衍生的细胞和树突细胞是结节病的疾病结果的预测因子gydF4y2Ba
为了确定诊断时MNP表型、细胞因子水平或mRNA表达是否与两年的疾病结局相关,我们使用了预测模型。在纳入研究的108例患者中,69例在分析时超过了2年。18例缓解,51例发展为慢性疾病:32例为慢性稳定,19例为慢性进展(gydF4y2Ba图4AgydF4y2Ba).符合以前的报告[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba],当Vα2.3的频率较高时,2年后复发的可能性较高(OR 1.32)gydF4y2Ba+gydF4y2BaT细胞在BAL中高,并且当患者携带HLA-DRB1 * 03等位基因(或39.4),这主要归因于LS患者(gydF4y2Ba图4B.gydF4y2Ba).有趣的是,CD14频率较高的患者gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在诊断时血液中的中间单核细胞在2岁以下(或0.89)后不太可能显示缓解(gydF4y2Ba图4C.gydF4y2Ba).相比之下,在诊断时,BAL中的CDC2的频率较高,表明2年后延长疾病的机会更高(或1.15)(gydF4y2Ba图4D.gydF4y2Ba).此外,BAL中cDC1 (OR 0.54)和PDCs (OR 1.34)频率较高的患者更有可能在2年后病情不进展或病情清晰(gydF4y2Ba补充图S8AgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
在我们的数据集中,肺泡巨噬细胞和CD14的TNF表达gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba-gydF4y2Ba单核细胞/单核细胞来源的细胞不能预测疾病结局;然而,表达tnf的非刺激CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba诊断时单核细胞/单核细胞衍生的细胞预测渐进性疾病发展(gydF4y2Ba图4E.gydF4y2Ba).血浆和BAL流体中的可溶性TNF和IL-6浓度也不是从患者预测疾病结果的SARCOITIOS病患者BAL产生的IL-6产生MNPS(gydF4y2Ba图4f.gydF4y2Ba和gydF4y2Ba补充图S8b和cgydF4y2Ba).gydF4y2Ba
集体,我们的数据表明,单核细胞/单核细胞衍生的细胞受到非LS患者中的炎症的影响和贡献。此外,在诊断时评估单核细胞/单核细胞衍生的细胞可以预测非LS结节病的疾病课程。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
MnPs在顺序病变中可能是中枢性,因为它们激活T细胞并产生促进鼻窦炎炎症的促炎细胞因子[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba].在目前的研究中,我们揭示了血液和BAL诊断时单核细胞和树突状细胞的频率和分布可能预测疾病结局。此外,单核细胞/单核细胞来源的细胞是产生局部和全身炎症的有效TNF的细胞,高频率的产生TNF的单核细胞/单核细胞来源的细胞与结节病的进展性疾病发展有关。gydF4y2Ba
CD14.gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba中间体单核细胞表明系统性炎症,并在几种炎症性疾病中升高[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba].此外,我们和其他人发现,在非ls结节病患者中,中间单核细胞的频率升高[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba32gydF4y2Ba].中间体单核细胞区分CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba-gydF4y2Ba血液中的古典单核细胞和该过程在炎症条件下加速[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba].血液中的细胞因子可能会驱使这种分化。关于TNF或IL-6升高的血浆浓度的报告无法在我们的队列中确认(gydF4y2Ba补充图S4D和S5FgydF4y2Ba)[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba,gydF4y2Ba35gydF4y2Ba].然而,其他细胞因子可能有助于炎症。随着我们的RNA测序数据,gydF4y2BaIL-1β.gydF4y2Ba或gydF4y2BaCSF-1gydF4y2BaBAL MNPs中的基因上调,这些基因可以释放到循环中,并促进炎症,导致CD14的增加gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba中间单核细胞。表达的增加gydF4y2BaIL-1β.gydF4y2BaBy Bab Mnps表示如前所述在结节病中被激活的炎症NLRP3途径的上调[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba].在BAL中,与表明局部炎症的健康对照相比,在基因表达和蛋白质水平上观察到TNF和IL-6水平增加,并可解释CD14的扩张gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba非ls患者肺中的单核细胞/单核细胞来源的细胞。之前观察结节病患者肺部的促炎细胞因子[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba].CD14扩展的另一个解释gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2BaBAL中的单核细胞/单核细胞衍生的细胞可以增加CD14的迁移gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba-gydF4y2Ba随后将肺部的古典单核细胞分化为CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba单核细胞/ monocyte-derived细胞。RNA测序数据显示增加gydF4y2BaCCL2.gydF4y2BaBAL MNP的基因表达。CCL2是CCR2的配体,其在CD14上高表达gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba-gydF4y2Ba古典单核细胞。迁移到肺部,CD14的差异化gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba-gydF4y2Ba进入CD14.gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba已知单核细胞/单核细胞衍生的细胞受组织环境的影响[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba].由于健康控制队的年龄较小,我们不能排除与年龄相关的效果影响CD14的存在gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba非LS患者的单核细胞/单核细胞衍生细胞与健康对照相比。gydF4y2Ba
在目前的研究中,我们表明肺单核细胞/单核细胞衍生的细胞本身通过生产促炎TNF产生炎症显着贡献。我们以前表明,肺单核细胞/单核细胞衍生的细胞可以通过产生TNF来响应TLR刺激[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba].然而,这里我们发现即使没有刺激,我们发现即使没有刺激,也发现高频的TNF产生肺单核细胞/单核细胞衍生细胞。我们的数据补充说,除了肺泡巨噬细胞作为结节病患者的TNF主要生产商gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,其他产生tnf的免疫细胞也参与了结节病的炎症。大多数研究结节病单核细胞的报道仅限于血液。一项对血液单核细胞的研究表明,与健康对照组相比,结节病患者的il -10产生调节单核细胞减少,进一步加强了单核细胞的促炎作用[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba].单核细胞产生的IL-10较少,导致t细胞增殖抑制受损,可能导致结节病中观察到的t细胞肺泡炎夸张[gydF4y2Ba39gydF4y2Ba].此外,Sarcoidosis病患者的血单核细胞在刺激后患有更高的TNF和IL-6产生,与对照相比[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba].这支持我们的RNA测序数据,即血单核细胞是高度炎症的,尽管在不同程度上为自发释放TNF的BAL单核细胞/单核细胞衍生细胞。虽然肺泡巨噬细胞在Bal流体中众多,但无疑在顺节病中发挥着重要作用,但是散装小细胞的分析可能掩盖较少频繁的单核细胞/单核细胞衍生细胞和树突细胞的贡献[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba].通过研究单个MNP亚群的转录组,我们还可以识别肺泡巨噬细胞、单核细胞/单核细胞来源细胞和树突状细胞之间的基因表达差异(gydF4y2Ba图2f.gydF4y2Ba).肺泡巨噬细胞显示出与反应性氧物质途径相关的上调基因,转化生长因子(TGF)-β或脂肪酸代谢。有趣的是,在非LS患者的BAL中,菌落刺激因子-1由MNP上调,有利于可选择激活的巨噬细胞的分化[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba].为了支持这一点,与对照相比,非LS患者BAL中的MNP也表达了高水平的TGF-β,也有利于可选择活化的巨噬细胞极化[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba].单细胞RNA测序可能能更好地揭示结节病中经典活化和交替活化肺泡巨噬细胞的异质性。可能是促炎巨噬细胞和抗炎巨噬细胞之间的平衡促进了疾病的进展和解决。总的来说,这些发现表明结节病患者肺中的肺泡巨噬细胞和单核细胞/单核细胞来源的细胞之间存在显著差异。gydF4y2Ba
血清淀粉样蛋白A(SAA)和可溶性IL-2受体是患者患者中患者的标记[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].我们的RNA数据证实,与健康对照组相比,非ls患者SAA增加。除了疾病严重程度标志物外,还需要预后因素来确定患者的疾病结局,以便及早干预症状恶化。我们发现,在诊断时,血液单核细胞的高频率和BAL树突状细胞的低频率是疾病结局的预测因子,因为患者在2年后不太可能治愈疾病。为了评估单核细胞的频率是否可以作为临床预测工具,一项前瞻性多中心研究将是可取的,以获得更多的患者数量,以考虑位置、年龄、性别和种族的差异。在功能上,未刺激的产生tnf的BAL单核细胞/单核细胞来源的细胞,而不是肺泡巨噬细胞,预测慢性进行性疾病的发展。这是对以前在进展性疾病患者中观察到肺泡巨噬细胞产生TNF的观察的补充[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].我们的研究的一个优势是使用流式细胞术和细胞内细胞因子染色,与ELISA测定总分泌的TNF而不揭示细胞因子产生的来源相比,它允许在单细胞水平上鉴定TNF的表达。此外,我们使用短3-h的TNF培养来积累,其优势是主要在MNPs而不是t细胞中诱导细胞因子的产生。因为CD14的频率gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba诊断时的中间单核细胞与2年后的慢性疾病病程相关,通过靶向CCR2-CCL2信号轴抑制或调节单核细胞迁移是否可以作为新的治疗靶点值得关注[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba,gydF4y2Ba43gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
集体,我们的数据揭示了单核细胞/单核细胞衍生细胞在顺序病中的重要作用。虽然单核细胞是促炎,但肺泡巨噬细胞对于再生以及组织修复和树突状细胞最有可能在进一步研究中阐明的T细胞反应中必不可少。对MNP的持续深入分析可能有助于更好地理解临床异质性,并且可以铺平鉴定生物标志物和治疗方案的方法,以帮助结节病变患者清除疾病。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
可分享的PDF.gydF4y2Ba
致谢gydF4y2Ba
我们感谢所有患者和志愿者为这项研究提供了临床材料。还感谢FridaHolmström和公共卫生和临床医学部的工作人员,医学/呼吸医学部门(Umeå,瑞典),以及Margitha Dahl,HeléneBlomquist,Sussi Schedin和Benita DahlbergKarolinska大学医院(瑞典斯德哥尔摩大学医院的肺部研究单位,在采样和准备方面提供了良好的技术援助。我们还感谢Diana Ekman来自国家生物信息学基础设施瑞典(NBIS; Scilife Lab,Sweden)的生物信息学建议,以及来自Smed-Sörensen实验室(Karolinska Institutet,Karolinska大学医院)的Sara Falck-Jones和Roosa Vaitiniemi,有助于帮助收集临床数据。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
本文提供了补充材料gydF4y2Bawww.qdcxjkg.com.gydF4y2Ba
本手稿中产生的数据可在Gene表达式Omnibus(Geo)上获得加入号GSE174659。可以找到用于分析的所有脚本gydF4y2Bahttps://github.com/czarnewski/lung_mnp_sarcoidosy_rnaseq.gydF4y2Ba
作者贡献:R. Lepzien,A. Eklund,A. Blomberg,J.Grunewald和A. Smed-Sörensen计划了这项研究。S. Kullberg,A. Eklund,A.Blomberg和J.Grunewald包括患者,进行了支气管镜和B.Österberg检索临床信息。R. Lepzien,S. Liu,M. Nie,F. Baharom,J.Putazar和G. Rankin进行了实验。R. Lepzien和A. Smed-Sörensen分析了实验数据。P. Czarnewski进行了生物信息学分析。M. Bottai进行了统计分析。R. Lepzien和A.Smed-Sörensen共同写道,所有合一的共同作者都编辑了稿件。gydF4y2Ba
利益冲突:R. Lepzien没有什么可披露的。gydF4y2Ba
利益冲突:刘没有披露。gydF4y2Ba
利益冲突:P. Czarnewski无需披露。gydF4y2Ba
利益冲突:聂先生没有什么可透露的。gydF4y2Ba
利益冲突:B.Österberg无需披露。gydF4y2Ba
利益冲突:F. Baharom没有披露。gydF4y2Ba
利益冲突:J.Puleazar没有披露。gydF4y2Ba
利益冲突:G. Rankin没有什么可披露的。gydF4y2Ba
利益冲突:A.埃克隆没有什么可披露的。gydF4y2Ba
利益冲突:M. Bottai无需披露。gydF4y2Ba
利益冲突:KULLBERG无需披露。gydF4y2Ba
利益冲突:A. Blomberg无需披露。gydF4y2Ba
利益冲突:J. Grunewald没有什么可披露的。gydF4y2Ba
兴趣冲突:A. Smed-Sörensen在研究期间报道瑞典心灵基金会,瑞典研究委员会和Karolinska Institutet的赠款。gydF4y2Ba
支持声明:从瑞典心灵龙基金会,瑞典研究委员会和卡罗西克学院的瑞典心肺基金会的A. Smed-Sörensen提供支持。J. Grunewald是瑞典研究委员会的瑞典心灵基金会,通过斯德哥尔摩市议会和Karolinska Institutet,King Gustaf V和女王的弗里蒙斯·弗里马森基金会的区域协议,瑞典研究委员会(瑞典研究委员会)支持瑞典的心肺基金会(ALF)。和karolinska institutet。P. Czarnewski由Knut和Alice Wallenberg基金会的经济支持,作为Scilifelab国家生物信息学基础设施瑞典国家生物信息学基础设施的一部分。本文的资金信息已存入gydF4y2BaCrossRef Resder注册表gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
- 已收到gydF4y2Ba2020年9月11日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2020年12月17日。gydF4y2Ba
- 版权所有©作者2021gydF4y2Ba
此版本在Creative Commons归因许可证4.0的条款下分发。gydF4y2Ba
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