文摘gydF4y2Ba
呼吸系统是一个复杂的网络,许多细胞类型,包括子集的巨噬细胞和树突细胞共同维持稳态呼吸。由于限制在获取人类肺细胞的健康,这些转录和表型特征子集仍然不佳。我们系统地识别这些子集在人类航空公司通过开发一个模式的分离大量的细胞全部肺支气管肺泡灌洗。6吞噬APC的子集(HLA-DRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba持续观察。除了肺泡巨噬细胞,Langerin的子集gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞识别。这些不同子集的能力内化gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba粒子。所有子集都更有效地内化gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba相比之下,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba。肺泡巨噬细胞和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞整体更有效率的粒子内化与其他四个人口。子集被进一步分成两组根据他们的固有能力移植表面CD83、CD86和CCR7表达水平。全基因组转录分析显示“真正的树突细胞”的进化枝Langerin组成gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞。树突细胞分化枝是不同于单核细胞/巨噬细胞分化枝,作为支持多个树突细胞相关基因的信使rna表达水平较高,包括gydF4y2BaCD1gydF4y2Ba,gydF4y2BaFLT3gydF4y2Ba,gydF4y2BaCX3CR1gydF4y2Ba,gydF4y2BaCCR6gydF4y2Ba。每个分支,和每个成员的演化支,看见了特定调节基因,为未来的研究可以作为标记在健康和患病的状态。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
巨噬细胞(Mϕ)和树突细胞(DC)是人类单核吞噬细胞中发现的最外围组织,包括肺(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。然而,异质性明显存在以下两种白细胞分类(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。此外,肺气道的微环境,而不是间隙空间,增加了复杂性水平未见人体的其他地方。呼吸时通过一个复杂的系统覆盖肺泡的薄壁毛细血管网络允许扩散之间的氧气和二氧化碳吸入空气和血液中。鉴于脆弱的基础设施的呼吸区,炎症在这个地区对稳态呼吸构成严重的威胁。因此,人类更低的航空公司必须保持一个整体抗炎环境引导宽容日常空气颗粒,以及特定的微生物。最近的研究涉及16 s rRNA基因的测序不育的范式转移健康降低航空公司对不同的居民细菌微生物的存在(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。虽然总体细菌密度降低航空公司的几倍低于水平上观察到皮肤或肠道(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba),几门已确定健康的捐赠者军团之间的共同点,包括壁厚菌门、拟杆菌,变形菌门,Fusobacteria和放线菌(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。居民气道细胞必须防止这些细菌过度生长而不引起炎症反应。支气管和肺泡上皮细胞起到了很大的作用在促进抗炎稳态的条件通过本构生产il - 10和TGF-β(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba15gydF4y2Ba)。在这些耐受性条件下,吸入微粒,致病微生物,不致病的微生物,仍然必须清除死细胞,防止呼吸道梗阻和感染。直流和内化Mϕ服务于这个目的,处理,并提出遇到Ags,从而保持宽容或调制精度,力量,和随后的免疫反应的方向。gydF4y2Ba
获得人类肺组织限制的困难调查罕见的居民白细胞子集。已经取得了一些进展确定肺直流通过使用外科切除术(gydF4y2Ba16gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba19gydF4y2Ba)。虽然切除组织有可能产生大细胞数量的消化过程是残酷的,它会导致污染lung-resident吞噬细胞与细胞肺毛细血管。相比之下,孤立细胞直接从航空公司快速绕过循环系统。研究显示人类直流健康的航空公司从细支气管肺泡上皮细胞(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba),尽管他们并没有区分直流子集。几组收集了Mϕ和直流支气管肺泡灌洗(BAL)的志愿者,紧随其后的是不同程度的歧视(子集gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。BAL Mϕ首次分开直流仅仅基于其高和低自发荧光(AF),分别为(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。这些结果表明∼95%的BAL细胞大肺泡Mϕ(AM),而小细胞低AF分数大多是单核细胞的外观。gydF4y2Ba
血直流Ags (BDCA)识别三个特定子集的DC在人类血液血统排斥(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba)。这些标记,BDCA-1 (CD1c), 2 (CD303)和3 (CD141),后来被检测特异性BAL细胞(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。Tsoumakidou et al。(gydF4y2Ba24gydF4y2BaBDCA-1)能够孤立小种群gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和BDCA-3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba骨髓,以及BDCA-2gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血浆直流(pDC)从BAL流体(BALF)。然而,他们的研究显示细胞收集由BAL固有的局限性。找到健康的志愿者BAL可以耗时和昂贵的,迫使研究人员将病人需要基本医疗条件的过程(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。此外,病人BAL并不总是产生显著的细胞总数,可以进行进一步分析,与值低至7×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba之前任何浓缩(gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
差距在人类呼吸道的表征和alveolar-resident吞噬细胞(aarp)也来自缺乏标准化的标记区分细胞类型。尽管BDCA标记识别已知的直流子集的血液,他们不区分所有气道子集。例如,多个组已经确定CD1agydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流子集BALF中建议的lung-equivalent朗格汉斯细胞(LC) (gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。然而,深入流动仪的调查从整个人类的肺血管外的吞噬细胞已经确定了三个细胞表达BDCA1子集,其中两个还表示CD1a (gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。此外,真皮LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流被证明是不同于在人类皮肤表皮LC等效LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(但不是LC)被发现在肺部进行(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)。这些LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba肺也BDCA1直流gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,但他们BDCA1分开gydF4y2Ba+gydF4y2BaLangeringydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流和高度CD1a变量的表达式(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)。因此,使用Langerin (CD207),结合CD1a BDCA标记,直流歧视的范围可以确定真正的吞噬细胞肺气道的子集。gydF4y2Ba
先前的研究人类的航空公司可能排除了一些由于CD14包容在天堂排斥(AARP子集gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba24gydF4y2Ba)。而CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血液单核细胞污染是由组织担忧当孤立细胞消化、矿山提供了一个方法,定位孤立CD14的来源gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞气道。居民CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,最初分为直流(在我们的研究和描述的一致性),已确定在人类真皮由几组(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。这个群体转录对齐与单核细胞和真皮Mϕ密切合作而不是真皮直流(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。事实上,居民CD14的数量gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞存在于肺消化准备(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba),最近的分析BALF健康志愿者一直CD14标识gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba−gydF4y2Ba“古典单核细胞CD14的第二子集gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba“中间单核细胞”(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。在老鼠中,单核细胞的稳态进入肺和迁移回排水LN没有收购Mϕ表型特征(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。在人类中,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流前面描述的可能相当于细胞这些子集的频繁更迭单核细胞。尽管存在一些白细胞子集在人类肺癌、吞噬细胞的下呼吸道没有系统化的特征或分类。每一个子集可能功能专业化,因此理解整个气道免疫反应的任何病变首先需要识别和分类的潜在贡献组件。gydF4y2Ba
因此,我们开发的技术来分离和保存大量aarp落下帷幕的功能(以临床试验)整个人类肺部。子集组成和频率与健康BAL的志愿者。我们可以确定地六AARP子集基于表面标记表达式。我们测试了这些子集进行早期功能响应基于能力内化细菌粒子,并随后移植标记的激活,成熟,和迁移。这些结果表明,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流功能彼此相关但Langerin分开gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流。排序细胞的转录分析支持了这一结论,分裂前的“Mϕ-like”进化枝从后者“真正的直流”进化枝。气道子集都是转录远离monocyte-derived Mϕ(mo-Mϕ)和直流(mo-DC)。最后,我们确定独特的基因签名,确认Mϕ和直流演化支,以及每个六AARP的子集。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
BAL细胞从志愿者的集合gydF4y2Ba
人类呼吸道细胞是通过支气管镜检查显示受试者的知情同意签署协议批准俄克拉荷马大学健康科学中心制度审查委员会和生物安全委员会制度。志愿者最初筛查近期或当前免疫抑制和抗炎药物的使用。所有志愿者健康不吸烟的话题,享年18-40 y (gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba),没有历史或症状符合呼吸,心血管疾病、自身免疫性疾病或近期感染。当前健康状况是由一个完整的体格检查验证关注呼吸,心血管和胃肠道系统。gydF4y2Ba
落下帷幕,为静脉输液前访问了过程和测量生命体征。航空公司是麻醉喷雾和直接灌输局部利多卡因。镇静是通过静脉输液咪达唑仑、芬太尼。落下帷幕了通过三个独立的口腔支气管肺的段(前的右上叶,内侧段中部叶,伪劣的小舌的部分左肺上叶)。对于每一个部分,一个25 ml整除无菌生理盐水的灌输和返回丢弃,之前收集回来的滴剂四30 ml整除的无菌生理盐水。集合是汇集和活细胞数量是由血细胞计数器和台盼蓝排斥。细胞在300×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,上层清液吸气,在1×PBS和丸resuspended 1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba在冰上20分钟。所有的样品都在300×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟,洗两次1×PBS-2。样品与流式细胞术之前2%多聚甲醛固定。gydF4y2Ba
肺细胞隔离和保护gydF4y2Ba
整个人类供体肺通过国际发展医学研究所(新泽西爱迪生;gydF4y2Bahttp://www.iiam.org/gydF4y2Ba),一个非营利部门的肌肉骨骼移植的基础。肺被认为nontransplantable组织相容性不匹配等原因,肺的大小,确定药物使用,或监禁。我们的肺验收标准包括:18 - 70 y的年龄,不吸烟至少2 y,没有肺部疾病史,PaO)非心血管死亡gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/ FiOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba最小比例> 200,正常肺不张基于胸部x光片的结果,没有任何证据表明并发感染(gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba)。货到后,威斯康辛州的解决方案和残留血液从血管用无菌生理盐水洗0.9% (w / v)。盐泵在低压H(∼20厘米gydF4y2Ba2gydF4y2BaO)到叶的主要生产可见支气管肿胀。合成BAL收集池,和细胞被离心浓缩为300×gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟,resuspended 1×10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba在冻结中细胞/毫升(RPMI 1640年的40%,50%的边后卫,10% DMSO) (gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),冷冻∼1°C /分钟的速度在−80°C,并存储在液态氮蒸气在−190°C。gydF4y2Ba
HLA打字gydF4y2Ba
高分辨率HLA打字了,如前所述gydF4y2Ba37gydF4y2Ba),基于输入俄克拉荷马大学健康科学中心临床实验室改进修正/美国社会组织相容性和Immunogenetics-accredited HLA打字实验室内部使用的方法。短暂,基因组DNA提取使用QIAamp肺细胞DNA血液工具包(试剂盒)。确认后,PCR产物纯化使用ExoSAP-IT工具包(USB)和测序使用BigDye终结者v3.1化学(应用生物系统公司)。染料的去除是由乙醇沉淀。3730毛细管电泳测序反应进行DNA测序器(应用生物系统公司)。四位数的HLA类型确定使用HLA打字程序分配序列输入(Conexio基因组学)。gydF4y2Ba
流式细胞仪和流式细胞术gydF4y2Ba
细胞分类进行BD FACSAria (BD生物科学),而其他数据获得BD LSR II。所有数据使用FlowJo v10软件进行了分析。马伯,列出可行性染料使用gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba。盖茨细胞测定使用荧光- 1控制对于每一个污点,负染色是充满标记同形像控制占非特异性结合。gydF4y2Ba
的制备gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba孢子gydF4y2Ba
起动器的文化gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba(Sterne应变34 f2∆蒙古包)是由菲利普·汉纳博士的实验室(密歇根大学安阿伯分校MI)。如前所述(创建孢子股票gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)。短暂,细菌生长与连续震动Luria-Bertani介质在一夜之间在37°C。第二天,细菌在正义与发展党有琼脂形成孢子菜肴和孵化3周30°C。在收割的时候,每道菜被移液洗冷冻5毫升,无菌,去离子水驱逐孢子。孢子收集在10000×旋转gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟和resuspended 1毫升的冷冻水。孢子悬浮液在65°C 60分钟加热杀死任何营养细菌。热处理后,孢子被离心机在10000×10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba,上层的丢弃。颗粒在1毫升的冷冻水和离心机resuspended 10000×10分钟gydF4y2BaggydF4y2Ba。产生的孢子球洗的上层吸管清除污染细菌细胞碎片。上层清液和颗粒表层的吸气和丢弃。清洗过程是重复总共五次,最后的孢子制剂冷冻resuspended,无菌、去离子水和汇集。孢子数量由血细胞计数器和股票被储存在4°C。孢子在实验中都收获< 30 d之前使用。gydF4y2Ba
粒子内化化验gydF4y2Ba
粒子pHrodo -gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(k - 12株)和pHrodo -gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba(木株没有蛋白质)prelabeled制造商,而gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba
保存BAL细胞迅速解冻在37°C, resuspended RPMI 1640年有10%的边后卫(RPMI-10),并在300×离心机gydF4y2BaggydF4y2Ba10分钟。上层清液被丢弃和细胞颗粒耗尽死亡/死亡细胞使用死细胞去除工具包(Miltenyi研究)与mac女士分离列(Miltenyi研究)根据制造商的指示。活细胞计数是由台盼蓝排斥和细胞resuspended RPMI-10含100单位/毫升青霉素、链霉素100μg /毫升、和2.5μg /毫升两性霉素B 1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/毫升。细胞被镀在组织培养板1 h 37°C。1 h后,细胞暴露于感染的多样性(MOI) 1:1和10:1的细菌粒子用pHrodo红色标记(50μl培养基)中2 h时间进程(30、60和120分钟)37°C。gydF4y2Ba
在每个时间点,细胞被重复移液,收获离心机300×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟,resuspended 1×1×10 PBSgydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/ 100μl。细胞被染色的可行性和表面标记(gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba前)流式细胞术作为志愿者描述灌洗细胞。gydF4y2Ba
显微镜gydF4y2Ba
细胞暴露在10:1的莫伊pHrodo -gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba在2 h粒子如上所述时间进程(30、60和120分钟)。固定细胞按流式细胞仪和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba
金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba粒子。背景荧光粒子成像之前被减去。细胞被手动分析粒子积极性,粒子总数在阳性细胞是由视觉计数。gydF4y2Ba激活、成熟和迁移化验gydF4y2Ba
BAL细胞解冻和镀1 h在37°C如上所述。1小时后,细胞暴露在1:1的莫伊和heat-killed 10:1gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(0111:B4应变;InvivoGen), heat-killedgydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba(InvivoGen)和germination-nullgydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba孢子,控制井接收粒子稀释剂。暴露期间进行4 h(0到240分钟)37°C。0 h时间点细胞收获之前暴露于细菌。细胞收获在每个时间点,染色和流式细胞仪分析了。Abs用于激活的措施(CD83)、成熟(CD86)和迁移(CCR7)所示gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
PBMC收集和单核细胞浓缩gydF4y2Ba
原料为所有人类血液细胞采集的新鲜巴菲俄克拉荷马血液研究所提供的外套。献血者的身体健康和消极期间感染检测标准的捐赠。年龄和吸烟史在献血者并不可用。使用Lymphoprep PBMC被立即隔离梯度离心(干细胞技术)根据制造商的指示。导致1×PBMC要么是resuspended PBS后续染色和流式细胞仪或1包含0.5% BSA和2毫米×PBS EDTA对单核细胞浓缩。单核细胞进行的积极选择使用anti-CD14微磁分离女士一起列(Miltenyi研究)后,制造商的指示。gydF4y2Ba
代mo-Mϕmo-DCgydF4y2Ba
单核细胞分离如上所述在RPMI-10 resuspended含100单位/毫升青霉素、链霉素100μg /毫升、和2.5μg /毫升两性霉素B 1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba。染色细胞被洗两次1×PBS-2和resuspended PBS-2活细胞排序。成熟,剩下的培养细胞暴露在有限合伙人(Invivogen) 1μg /毫升新鲜中对3 d。第九天,成熟的Mϕ和直流收获和染色流式细胞仪进行排序。gydF4y2Ba
ggydF4y2Ba10分钟,resuspended 1×10gydF4y2Ba6gydF4y2BaRNA加工gydF4y2Ba
肺癌和monocyte-derived细胞数量按流式细胞仪直接进入QIAzol裂解试剂(试剂盒)≤5×10gydF4y2Ba4gydF4y2Ba细胞/ 600μl和冻结在−80°C。解冻时,样本纯化使用QIAcube系统结合miRNeasy迷你包(从试剂盒)制造商的指示。RNA的产量和纯度测定使用NanoDrop 2000 c(热科学)。RNA是反向转录cDNA,放大后使用Ovation Pico WTA系统V2 (NuGEN)制造商的指示。最后放大互补脱氧核糖核酸纯化使用Agencourt RNAClean XP珠子。产量和纯度NanoDrop测定。基于这些价值观,每个样本5μg cDNA分散,生物素化的(安可生物素模块;NuGEN)后,制造商的指示与微阵列杂交。杂交鸡尾酒使用组件创建GeneChip杂交,洗,染色工具包(Affymetrix)和孵化GeneChip人类基因组U133 + 2.0数组(Affymetrix) 18 h与旋转45°C。使用组件的数组被洗,染色GeneChip杂交,洗,染色设备。 Arrays were scanned using a GeneChip scanner 3000 7G (Affymetrix). Fluorescence intensities were log2gydF4y2BaRMA总结给基因表达值R编程语言上使用Bioconductor v3.1 v3.2,与总结具体完成了affy v1.46.1 R包。gydF4y2Ba
微阵列分析gydF4y2Ba
因为微阵列数据是在两个不同的批次,批处理的效果与“removeBatchEffect”功能删除从limma v3.26.5 R包。主成分分析(PCA)结果可视化使用scatterplot3d v0.3-36 R包。median-averaged细胞类型特异性基因表达谱的相关图是使用“欧几里得”创建的距离和“病房。D”层次聚类指标,成对的皮尔森相关系数是覆盖。细胞类型特异性基因表达谱的系统树图是创建使用皮尔逊相关系数作为距离度量。gydF4y2Ba
比较分析基因定义细胞特定类型的基因签名,成对差异表达基因(度)被确定使用limma v3.26.5 R包。短暂,探测器被过滤使用“nsFilter”函数的默认设置genefilter v1.52.0 R包。的重要gydF4y2BapgydF4y2Ba使用Benjamini-Hochberg值调整为多个测试程序,和度调整gydF4y2BapgydF4y2Ba值< 0.1的报道。所有的数据进行了处理和分析使用R编程语言v3.2.2 (gydF4y2Bahttp://www.r-project.orggydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
度肺AARP演化支或列表的子集被聪明才智用于识别丰富规范途径途径分析。分析标准被限制到特定的组织:真皮,表皮,肺、淋巴结、皮肤、脾脏。过滤器也放在物种只包括老鼠,老鼠,和人类,细胞从骨髓中只包含数据和免疫细胞。重要的途径是由α= 0.05的right-tailed Fisher精确检验。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
所有统计分析,除了涉及微阵列数据,进行使用Prism 6.0 (GraphPad软件)。具体适用的测试表明,与每个图和表。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
捐赠者人口表现出各种各样的肺捐助者gydF4y2Ba
双肺功能(标准中描述gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba)从七个捐助者获得年龄在29 - 68 y的年龄。移植排斥反应并不可用,虽然具体原因接受每一对肺是基于PaO仔细确定gydF4y2Ba2gydF4y2Ba/ FiOgydF4y2Ba2gydF4y2Ba比率的可用性(前一段时间最终读数)结合x射线结果(gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba)。没有肺捐助者超过最小的肺不张及/或浸润在胸部x光检查接受。捐助者与任何并发感染被排除在外的证据。四个肺的捐助者曾经抽过烟至少5 y器官捐赠之前,和三个捐助者没有吸烟史。细胞总收益率由外植体灌洗不与吸烟史。平均细胞产生一对从肺灌洗是5.43×10gydF4y2Ba9gydF4y2Ba总细胞。一些研究表明,HLA I型(A、B和C)和II型(博士、DQ和DP)变异与自身免疫性疾病和感染的发病机制(gydF4y2Ba39gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba42gydF4y2Ba),我们的基因供体肺HLA等位基因。观察高多样性在HLA变异抗原,b和c位点7捐助者,只有一个捐赠者携带纯合性。在二类位点多样性也很高,尽管纯合性更常见(gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba)。这些人口统计数据表明,我们获得了广泛抽样地区的成年人口的年龄、性别、吸烟史、和HLA类I和II基因型。gydF4y2Ba
六个不同的AARP子集是居民对人类航空公司gydF4y2Ba
流式细胞仪的细胞全部肺灌洗了六AARP子集后排除死亡,血统gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(CD3、CD19 CD20、CD56)细胞(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。证实了APC地位高表面HLA-DR的表情。很大,高复杂性细胞与房颤和表达的整合素CD11c(子集1)。我发现Diff-Quik染色后根据大小和高cytoplasmic-to-nuclear比率。最初的歧视的大型,高复杂性细胞从小型、低复杂性细胞减少的可能性是直流分数改变房颤会下跌。小、低复杂度、低高HLA-DR AF细胞也表达了。在这个分数是Langerin的一个小子集gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,进一步引用LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(2)子集LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流cytoplasmic-to-nuclear比例较低,与我相比,以及独特的膜树突可视化。从LangeringydF4y2Ba−gydF4y2Ba池,我们基于CD11c积极性,把剩余的细胞CD14、BDCA1 (CD1c)。从CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD11cgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,一小群BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(3)子集,CD14的同时还有一个更大的子集gydF4y2Ba+gydF4y2BaBDCA1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流(4)子集。两个子集cytoplasmic-to-nuclear比率较低与Langerin相提并论gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流专门有二小叶的核与单核细胞相似。类似CD11c的部门gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba池透露BDCA1的一个小子集gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流(5)子集和CD14的一个更大的子集gydF4y2Ba−gydF4y2BaBDCA1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流(6)子集。CD14的二小叶的细胞核gydF4y2Ba+gydF4y2Ba华盛顿是唯一这些CD14之间的视觉特点gydF4y2Ba−gydF4y2Ba和他们的CD14子集gydF4y2Ba+gydF4y2Ba同行。不同的人群BDCA3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流和CD123gydF4y2Ba+gydF4y2BapDC没有观察到。BDCA3表达变量的子集描述(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba),因此我们没有使用它进一步定义标记的细胞全部肺灌洗。gydF4y2Ba
频率的直流子集是一贯很低(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba),因为大多数的aarp预计将。CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流显示最高平均频率的七大肺(∼4.5%)和BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流平均最低的频率(∼0.25%)。罕见的肺直流子集,我们还测试了是否在文化(AARP频率随着时间的推移而改变gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)。这样的观测结果表明死亡的特定子集或upregulation的差别或对这些标记用于识别它们。LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流频率显著下降了4 h文化。因此,我们进一步研究有限4 h包括所有的直流子集在我们的分析。gydF4y2Ba
落下帷幕的六个健康志愿者(gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba)验证了居住权和低频率的五个直流子集的小气道和肺泡空间(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba),与类似的百分比衡量全部肺灌洗(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。为了描绘任何额外的白细胞子集发现在正常航空公司,我们也分析了CD1a BDCA3, CLEC9A (CD370)表达的五直流子集BAL三个志愿者(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba)。CD1a一直作为直流子集的差异化结合BDCA1或Langerin几组(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)。然而,它的coexpression没有同时测量BDCA1和Langerin气道细胞。没有五个直流子集一致表示CD1a (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba,最高)。此外,CD1a表达了从消极到积极的而不是在这些类别的双峰,除了LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba(左)。只有∼CD14的20%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流和CD14的15%gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流表示表面CD1a (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba,最高)。相比之下,几乎60%的BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba这个标记直流是积极的。明显高于Langerin的75%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流CD1a表达,但是这些CD1a较小的一部分gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞CD1agydF4y2BaintgydF4y2Ba。总的来说,我们认为CD1a积极性不与任何六AARP子集的身份,和它的表达是不习惯进一步明确独立的额外的子集。高表达的BDCA3和CLEC9A与识别真正的有关cross-presenting DC在人类血液和外围组织(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba46gydF4y2Ba)。表达BDCA3新鲜BAL细胞健康志愿者透露,而大多数(∼75 - 100%)的五个直流子集并表达这种标记(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba、中),只有20 - 45%表示CLEC9A (gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba,底部)。有趣的是,表面的表达BDCA3和CLEC9A广泛,但BDCA3截然不同gydF4y2Ba嗨gydF4y2BaCLEC9AgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba细胞只有CD14的一小群gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流人口(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。这些结果从志愿者建议BDCA3 CLEC9A表达式并没有统一,因此不会进一步区分六子集确定全部肺灌洗,除了一个明确的CD14但相当稀缺gydF4y2Ba−gydF4y2BaBDCA3gydF4y2Ba嗨gydF4y2BaCLEC9AgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba人口。gydF4y2Ba
我们也想确保我们的活力全部肺灌洗并没有导致血液直流污染气道细胞。分析从三个人PBMC(一男两女),遵循同样的控制策略用于识别肺子集(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba),显示肺和血液HLA-DR之间的明显差异gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞群(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。PBMC冻结和解冻以同样的方式作为BAL细胞折扣的可能性保存的方法是消除易感细胞类型。房颤细胞和Langerin PBMC缺乏高gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞,但他们确实包含不同的BDCA3人口gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流和CD123gydF4y2Ba+gydF4y2Ba没有出现在BALF pDC (gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。在血液中,大多数HLA-DR (∼80%)gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞是单核细胞(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。总的来说,这些结果表明,六AARP子集通常和人工繁殖人类的下呼吸道,和我们的研究结果并不由于污染PBMC。gydF4y2Ba
肺直流子集不同内化细菌病原体的效率gydF4y2Ba
我们下一个寻找AARP子集之间的功能差异,开始能够内化细菌粒子。三种不同的细菌进行了测试在两个不同的莫伊2 h时间进程(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba):gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba(孢子)。每个病原体与pH-sensitive染料标记pHrodo歧视从外部粒子内部。在1:1的比例,我们假定所有的细胞均暴露于细菌粒子。有趣的是,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba粒子没有内化一样有效gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba或gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。我表现出更大的吗gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba积极与Langerin相比gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba,但这只发生在120分钟的曝光。在我最低的gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba,所有子集都更好地内化与CD14相比gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流120分钟的曝光。观察是如此,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流的60分钟gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba接触,但不是gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba曝光。总体而言,细菌内化在1:1的效率gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba孢子>gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba>gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba所有时间点(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
梳理出内部化的差异在更高的莫伊10:1的低频直流子集,我们计算标准吞噬指数(PI)的变化,基于流式细胞术。我们计算流仪π乘以比例给定子集阳性颗粒的pHrodo particle-positive细胞的平均荧光强度(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba,gydF4y2Ba4摄氏度gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba内化在10:1相似的所有子集,直到60分钟的接触,当我表现出更高水平的内化与CD14相比gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流。缺乏其他内化子集之间的差异在10:1的早期时间点gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba接触表明我没有有效地内化的细菌相比gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。120分钟,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba内化是高于所有的直流子集。然而,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流显示低内化比其他直流子集,包括LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流。这与我和CD14模式gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流10:1的举行gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba早些时候,除了更戏剧化,出现后曝光(30分钟gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba和60分钟gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba)和更大的值的差异。还在10:1,CD14的内化gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流峰值与第二高的π值是所有病原体后,虽然这事件只是重要的120分钟(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。总的来说,病原体内化的动力学和大小各不相同,gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba孢子>gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba>gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaAARP的子集。gydF4y2Ba
我们比较测量π标准的手工计算,使用点和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流10:1 pHrodogydF4y2Ba- s。葡萄球菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba)。这些子集选择因为他们更高频率内总灌洗池,也更内化的CD14很感兴趣gydF4y2Ba+gydF4y2Ba与其他的直流子集(相比直流gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba被选中,是因为它下降之间的整体内化在中间gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba当比较所有AARP子集(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。排序,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba分析了直流共焦显微镜的每个子集(至少100个细胞gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba,对吧)。尽管可比,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流给略高于平均π值比是通过手动计数(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba中心)。观察的结果相同三肺捐助者的流动仪π,平均值略高于CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba(左)。因为pHrodo pH敏感,流仪π可能内化和酸化而不是纯粹的内化,是衡量人工计数。整体而言,这些结果表明,很可能是更有效地酸化但CD14可比gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流内化。gydF4y2Ba
LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流本质上移植CD83、CD86和CCR7gydF4y2Ba
基于早期的内化的差异,我们下决定的某些子集是否容易快速激活(CD83)、成熟(CD86),或迁移(CCR7)。BAL细胞暴露于heat-killedgydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba或gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba,或者germination-nullgydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba萌发孢子,从而消除干扰,毒素生产,或固定。曝光时间延长到4 h允许任何早期标志表达变化明显。我们开始通过测量CD83,因为它被认为激活成熟之前会发生和迁移。Langerin最有趣的结果gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,尤其是BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流,显著调节CD83时间仅在文化(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba),这表明这两个子集快速激活由于轻微的扰动很敏感。相比之下,CD83水平上,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流保持稳定或仅略有增加文化(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。CD83很少针对细菌增加了4 h曝光,只有显著增加CD83 BDCA1而没有控制gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba,LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaDC在10:1gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba,gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba分别为(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。虽然我们没有观察到许多CD83变化依赖于病原体接触,我们想测试是否成熟发生在没有激活。观察与CD83 BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流自发调节CD86和增加文化。水平的CD86子集,尤其是我,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba,在4 h(没有自发地改变gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)。细菌暴露导致CD86无显著增加。CCR7 upregulation促进迁移的外围组织直流通过传入淋巴管引流淋巴结(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)。人类的时间框架AARP子集可以上调CCR7病原体暴露是未知的。唯一显著增加CCR7细菌暴露在Langerin所致gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流10:1接触后gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba)。这表明一个特定的早期迁徙Langerin的潜力gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流4 h,但只有当病原体暴露于高剂量(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。与CD83、CD86 LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流子集显示最大的upregulation CCR7与次文化(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba),而我,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流显示最小程度的变化。前分组AARP CCR7 upregulation暗示这三个子集的固有经验稳态迁移到区域淋巴结。上述结果CD83、CD86和建议Langerin CCR7在一起gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba活化DC具有一种内在的敏感性,成熟,和迁移,分组他们分开,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流。gydF4y2Ba
转录分析划定Mϕ和直流演化支肺gydF4y2Ba
接下来我们分析了稳态AARP子集的转录差异可以解释为细菌内化的变化(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)和一定的直流子集的内在倾向成熟和迁移(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。以前,moDC和mo-Mϕ标准调查各种刺激吞噬细胞反应(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba),很大程度上是由于人类血液单核细胞易于分离和区分。因此,我们还包括转录组的mo-DC和mo-Mϕ分析建立这些模型的强度代表肺细胞的子集。CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba单核细胞从三男三女献血者受到gm - csf单独生成mo-Mϕ,或结合生成mo-DC il - 4。6 d后在文化、CD14gydF4y2Ba−gydF4y2BaDC-SIGNgydF4y2Ba+gydF4y2Bamo-DC和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaDC-SIGNgydF4y2Ba−gydF4y2Bamo-Mϕ(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)纯化了流式细胞仪,如前面描述的(gydF4y2Ba48gydF4y2Ba)。细胞还测试了CD1a,表达了直流为主。基于内在upregulation CD83、CD86在一些肺子集(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba与有限合伙人),剩余monocyte-derived细胞成熟比较。CD1a选择性地表达了在直流和LPS成熟后显著增加(gydF4y2Ba补充图1 bgydF4y2Ba)。CD80增加直流和MϕLPS成熟,尽管它只是由Mϕ显著增加(gydF4y2Ba补充图1 cgydF4y2Ba)。CD86显著增加两个有限合伙人曝光后的细胞类型(gydF4y2Ba补充图1 dgydF4y2Ba)。CD83也增加了在两个人群有限合伙人曝光后,尽管意义只是观察Mϕ(gydF4y2Ba补充图1 egydF4y2Ba)。这些结果累计证明我们有不同的不成熟和成熟的mo-DC和mo-Mϕ派生而来。gydF4y2Ba
转录组的六个肺子集,以及不成熟和成熟mo-DC mo-Mϕ,通过全基因组转录分析比较(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。使用前三个主成分分析电脑占总变异的62.26%在所有基因表达(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。三维之间的最大距离是monocyte-derived细胞和六AARP子集,除了成熟mo-DC PC1。不成熟和成熟mo-DC相对较近,mo-Mϕ是不成熟和成熟。Mo-DC Langerin地所做的那样gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流PC2和生物,而mo-Mϕ排序是和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流沿着这两个电脑。肺内的子集,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流组合在一起,特别是在PC1生物,而LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流组合在一起这三个电脑(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。这些肺关系同意我们的研究结果建议的不同程度的CD83、CD86和CCR7 (gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。皮尔逊相关性肺子集之间的值一般都高,价值最低的0.83我和BDCA1之间发生gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba和0.97的最高价值Langerin之间发生gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。点,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流密切相关在0.93到-0.95之间。同样,LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流收益率相关系数在0.95到-0.97之间。比较monocyte-derived细胞肺子集产生更低的值,最高的点和不成熟的mo-Mϕ之间相关性,在0.84 (gydF4y2Ba图6 bgydF4y2Ba)。层次聚类显示monocyte-derived分开人群聚集肺子集的相对高度(最大的区别gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)。在肺的子集,是我和CD14之间最亲密的关系gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,然后与CD14有关gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流。另一组是Langerin之间gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流,然后与BDCA1有关gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba)。总的来说,这些结果暗示mo-DC和mo-Mϕ是可怜的模型主要肺AARP的子集。他们还表明,在AARP子集,,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流形成转录和功能性Mϕ进化枝,可以分开Langerin直流进化枝gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流。gydF4y2Ba
我们下一个决定是否这些演化支核心基因签名可以绑定到直流或Mϕ已知属性。每个三个子集的进化枝与这三个子集的第二个进化枝阐明基因表达增加相对于相反的进化枝(gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba)。Mϕ进化枝有七个调节基因与DC分化枝相比,而DC分化枝54这样的基因与Mϕ进化枝(gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba)。基因在直流进化枝中,我们认识到几个与Ag)表示和DC成熟有关,包括gydF4y2BaCD1BgydF4y2Ba,gydF4y2BaCD1CgydF4y2Ba,gydF4y2BaCD1EgydF4y2Ba,gydF4y2BaCD86gydF4y2Ba。通路分析直流clade-specific度确定DC函数的规范化途径,与三大DC成熟(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.00178),脂质Ag)演示CD1 (gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.00193),形成吞噬体(gydF4y2BapgydF4y2Ba= 0.00407)。gydF4y2Ba
进一步检查的功能意义确定演化支,我们创建了一个表达式热图选择基因的已知与DC / Mϕ身份和功能在人类皮肤和肺(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)。正如前面提出的(gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba),gydF4y2BaCD1gydF4y2Ba分子高度表达的直流进化枝的成员相对于Mϕ进化枝。相反,分子表达由Mϕ著称,如gydF4y2BaMRC1gydF4y2Ba,gydF4y2BaSIRPβ1gydF4y2Ba,gydF4y2BaNR1H3gydF4y2Ba,gydF4y2BaCD36gydF4y2Ba,gydF4y2Ba马可gydF4y2Ba,都是高架Mϕ分支,特别是我和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流。令人惊讶的是,水平的gydF4y2BaCD163gydF4y2Ba和gydF4y2BaCD209gydF4y2Ba没有可用于区别肺Mϕ的肺,分别。然而,mRNA水平的这些分子可能从mo-DC mo-Mϕ分开。转录因子干扰素调节因子(gydF4y2BaIRFgydF4y2Ba)gydF4y2Ba4gydF4y2Ba是专门在BDCA1调节吗gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流,这是至关重要的人类血液的等效直流子集(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)。此外,gydF4y2BaFLT3gydF4y2Ba高度表达的直流进化枝的成员,支持这三个子集(“真正的特区”的本质gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。随着mRNA水平高gydF4y2BaCD83gydF4y2Ba,gydF4y2BaCD86gydF4y2Ba,gydF4y2BaCCR7gydF4y2Ba同意我们的功能数据(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba),我们还测量了高水平的gydF4y2BaCCR6gydF4y2Ba和gydF4y2BaCX3CR1gydF4y2Ba在直流进化枝。主要表达的分子都是高度肺直流子集,但不是通过monocyte-derived吞噬细胞,验证外围直流子集的迁徙的潜力,而不是mo-DC mo-Mϕ。我们也分析了具体的度成对比较识别路径子集,可以用来单独密切和远亲细胞类型。我们选择成对比较与当前重点领域tissue-resident Mϕ和直流。度的总数在这些比较赞同他们的整体程度的关联性,与我和BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流显示最多的度和BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流和LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流显示最小的号码(gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
作为CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流已被证明的居民关系紧密Mϕ在人类皮肤(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba),我们检查了两个等价的子集规范途径可以区分他们的航空公司(gydF4y2Ba表我gydF4y2Ba)。有趣的是,相对于CD14的四大点gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流强调退化,而生物合成和纤维化在CD14高亮显示gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流。之间的比较,包括直流进化枝的成员,调节通路包含直流成熟,吞噬体形成、Ag)表示,粒细胞/无颗粒白细胞粘附和血球渗出。在DC分化枝,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流显示特定upregulation IL-17A BDCA1信号通路与之相比gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba和LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba表我gydF4y2Ba)。然而,我们意识到通过包括多个物种和组织类型在我们的路径分析,一些规范化的路径识别,如“胆酸生物合成”和“多发性硬化的发病机制,“不会有生理与人类的肺。因此,我们还研究了特定基因调节的成对比较子集(gydF4y2Ba表我gydF4y2Ba)。几种趋化因子和趋化因子受体、细胞因子和细胞因子受体,通常,Ag)表示分子在重叠的规范化途径定期确认。这些差异使我们寻找度具体调节每个AARP的子集。gydF4y2Ba
独特的基因签名鉴别肺AARP的子集gydF4y2Ba
独特的度增加表达式被确定在每个AARP子集(gydF4y2Ba表二世gydF4y2Ba)。我给了最大数量的度相对于其他五个子集,78。我度分析表明这五个最大的upregulation规范途径:PXR / RXR激活,视黄醇生物合成,补充系统,组胺降解和氧化乙醇退化三世。其他五个AARP子集没有足够独特度通路分析,但度并提供洞察潜在的细胞功能。的14 CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流度,二肽酶,gydF4y2BaADAMTS2gydF4y2Ba和gydF4y2BaSERPINβ2gydF4y2Ba,增加了表达式。此外,gydF4y2Ba两栖的gydF4y2Ba,参与clathrin-mediated内吞作用,也是CD14表达的差异gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流。在直流分支,很少发现独特的度,反映这三个子集之间的亲密关系(gydF4y2Ba表二世gydF4y2Ba)。此外,我们严格高识别度(具体地说,删除捐赠效果比较之前子集)意味着上市APC基因调节的子集的七个捐助者。确认我们的控制策略,gydF4y2BaCD207gydF4y2Ba(gydF4y2BaLANGERINgydF4y2Ba)是唯一Langerin度gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流。在BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流,五度,包括四个蛋白产品本地化的质膜,因此可以作为额外的标记识别这个细胞类型:gydF4y2BaCNKSR3gydF4y2Ba,gydF4y2BaHOMER2gydF4y2Ba,gydF4y2BaP2RX5gydF4y2Ba,gydF4y2BaSLC7A11gydF4y2Ba。基于这些度列表,我唯一上调某些规范路径,而其他五个子集选择基因的表达增加,一些未知的函数。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
我们的研究结果表明,至少有六个AARP子集存在于人类的下呼吸道,他们显示,据我们所知第一次与特定功能和转录概况。主直流的罕见周组织构成了限制他们的表征。我们全部肺BAL和随后的细胞保护的方法绕过了这个问题,因为罕见的直流子集水平可以找到足够的重复实验。我们的技术的另一个优点是气道细胞间质直流和Mϕ分开。我们承认,频率的一些六AARP子集可能改变之前到达肺部。然而,我们不认为任何AARP子集完全失去了在我们的研究涉及全部肺落下帷幕,从BALF等效子集被确定的健康志愿者(gydF4y2Ba无花果。1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba)。整个肺的渡越时间的变化取决于源的位置,但是在所有情况下,肺处理后立即到达我们的设施。有可能是Langerin的频率下降gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流我们观察到在文化(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)相关的敏感性这些特定子集的休克肺收成本身,交通、灌洗后或冻结/解冻。刚落下帷幕的孤立点的健康志愿者显示促炎的概要文件在转录和功能(基于细胞因子的生产)的水平,这只会降低在文化(24小时后gydF4y2Ba51gydF4y2Ba)。因此,AARP子集可能激活后立即全部肺灌洗,而不幸的是防止有效的稳态细胞冷冻前后的比较。gydF4y2Ba
最初的控制策略(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)建立在先前的分裂组织的策略APC在人类血液,皮肤和肺(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)。据我们所知,我们的工作是第一个应用歧视人类aarp这种级别的子集,它补充了盖尔et al。(最近的工作gydF4y2Ba27gydF4y2Ba基于BDCA1)分离肺血管外的吞噬细胞,CD1a, CD206表达式。尽管我们做了检查模的表达MHC分子,CD1a,六从志愿者BAL AARP子集(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba上),它没有进一步用作subset-defining标记。在人类皮肤,CD1a已经观察到表皮LC高水平,因此它一直与Langerin交替使用表达式来识别信用证(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba,gydF4y2Ba53gydF4y2Ba)。然而,在真皮有一个单独的CD1a人口gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流低水平的表达这个标记与LC (gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)。这是奇怪,我们没有观察到CD1a coexpression均匀的子集,包括LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流。绑架et al。(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)注意到,大多数(但不是全部)LangeringydF4y2Ba+gydF4y2BaBDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD1a直流从肺消化是积极的,是与我们的结果一致(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba上),∼Langerin的75%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流也CD1agydF4y2Ba+gydF4y2Ba。在mRNA水平,所有的gydF4y2BaCD1gydF4y2Ba分子是高架直流进化枝的成员与Mϕ进化枝,Langerin最高水平gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。然而,CD1a不是双向的积极性两三个表达(BDCA1子集gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流)。相反,沿着频谱表达式,杜绝分离基于高,低,或中间水平(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba(左)。LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流似乎包含一个小CD1a所做的那样gydF4y2BaintgydF4y2Ba子集,CD1a分开gydF4y2Ba−/低gydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba(左)。这LangeringydF4y2Ba+gydF4y2BaCD1agydF4y2BaintgydF4y2Ba直流子集可能对应于表皮LC与我们的模型,需要进一步调查。高水平的BDCA1出现在信用证和CD1agydF4y2Ba+gydF4y2Ba从皮肤(直流gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)。因此,如果我们使用CD1a作为额外的标记的直流子集,它可能不当BDCA1分裂gydF4y2Ba+gydF4y2Ba我们歧视的直流子集。盖尔et al。(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)最近检查人类肺血管外的子集,表示两个直流子集表示BDCA1 CD1a,第三只表示BDCA1子集。然而,他们没有测量Langerin表情的子集。Langerin BDCA1可能表示gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,但重要的是,Langerin并不表示在两个BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流子集(gydF4y2Ba无花果。1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba)。试图比较结果,我们的研究BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流可能分为CD1agydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD1agydF4y2Ba−gydF4y2Bamonocyte-derived细胞盖尔et al。(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)。此外,尽管他们调查了BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD1agydF4y2Ba+gydF4y2Ba子集被称为“肺直流”,他们没有描述BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD1agydF4y2Ba−gydF4y2Ba子集,我们做到了。对于我们的研究,我们不想要主观分裂AARP子集基于非离散水平的差异表达的任何标记,而是只有积极和消极。当我们能够分离和分类子集通过转录分析,这种方法似乎是合适的。gydF4y2Ba
我们观察到BDCA3表情多个白细胞子集(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba),这与先前的研究一致的BDCA3 upregulation BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流和pDC随着文化时间(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba47gydF4y2Ba)。然而,BDCA3积极性也观察到的大部分新隔离的直流子集从健康志愿者(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba、中),这表明BDCA3不是一个特定的标记的任何子集调查,无论培养。BDCA3gydF4y2Ba嗨gydF4y2BaCLEC9AgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba提出了直流作为一个独特的人类cross-presenting DC的子集(gydF4y2Ba43gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba46gydF4y2Ba)。更低的比例我们五CLEC9A直流子集gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba相比BDCA3,底部)gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图2 bgydF4y2Ba、中)。更重要的是,高表达的BDCA3和CLEC9A只是观察到CD14的一小部分gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流子集(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba,对吧)。这些发现表明,稳态航空公司的房子一个小BDCA3人口gydF4y2Ba嗨gydF4y2BaCLEC9AgydF4y2Ba嗨gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流,我们会在CD14分组gydF4y2Ba−gydF4y2Ba从全部肺BAL直流。未来的工作可能测试肺灌洗细胞表面表达的趋化因子受体XCR1,已被确定为一个保守的标志cross-presenting BDCA3gydF4y2Ba+gydF4y2BaDC在老鼠和人类(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba,gydF4y2Ba55gydF4y2Ba)。gydF4y2BaXCR1gydF4y2Ba在CD14 mRNA水平也相对较高gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba),这将是用一小部分BDCA3来解释gydF4y2Ba嗨gydF4y2BaCLEC9AgydF4y2Ba嗨gydF4y2BaXCR1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba内细胞CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流人口。这个表达转录因子IRF8 (cross-presenting直流子集gydF4y2Ba56gydF4y2Ba,gydF4y2Ba57gydF4y2Ba),观察CD14之下gydF4y2Ba−gydF4y2BaDC在转录水平(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。这些BDCA3gydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba可以从BDCA1截然分开gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流,依赖于转录因子FLT3在人类血液和IRF4 (gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)和肺(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。尽管盖尔et al。(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba)没有观察到血管外的肺细胞表达CLEC9A BDCA3当寻找真实gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,他们没有比较他们的结果洗胃细胞的志愿者。相反,我们没有测试我们的细胞从全肺表面CLEC9A的表情。有些人猜测pDC留在血液循环和淋巴组织在稳态条件下,只有渗透外围后暴露于病原体,特别是病毒性病原体(gydF4y2Ba58gydF4y2Ba)。这可以解释为什么我们没有观察pDC全肺灌洗(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba),而他们的血液样本中识别使用相同的控制策略(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。虽然pDC隔绝BALF健康的志愿者,他们的频率远低于骨髓直流(gydF4y2Ba59gydF4y2Ba)。我们大力灌洗因此可能已经淡化了一小部分pDC低于检测极限。gydF4y2Ba
我们的控制策略基于CD14和BDCA1表达同样适用于人类皮肤细胞,随后CD14的识别gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流和一个小BDCA1人口gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba52gydF4y2Ba)。表达的增加gydF4y2BaCD1CgydF4y2Ba,或gydF4y2BaBDCA1gydF4y2Ba在DC分化枝(gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba)也同意我们使用这个表面标志的识别两个BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流子集(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba)。虽然我们形容子集的六个方面中的五个,我们的转录分析支持其他组的工作(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)表明CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流更像是单核细胞和Mϕ。这一发现还支持通过组织学(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba),这表明CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaDC具有二裂片的核典型的人类血液单核细胞(gydF4y2Ba60gydF4y2Ba)。未来的工作可能比较CD14转录概况gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流CD14的概要文件gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血液单核细胞,与CD14进行了gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流从人体皮肤(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。Baharom et al。(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba)最近发现CD14的子集gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba−gydF4y2Ba古典单核细胞CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba中间单核细胞从BAL的健康志愿者。这两个是CD206子集gydF4y2Ba−gydF4y2Ba(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),我们的CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流还显示低相对mRNA的表达这个标记(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。我们的CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流因此可能包含两个子集的“组织单核细胞”发现Baharom et al。(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),他们可能会进一步分裂如果我们为表面CD206和CD16执行额外的染色。功能性BDCA1的重要性gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流先前从未被调查过在人类皮肤或肺部,尽管upregulation IL-17A信号通路的子集(gydF4y2Ba表我gydF4y2Ba)表明一个未来的研究领域。最后,我们建议CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流我们调查,排除可能小BDCA3gydF4y2Ba嗨gydF4y2BaCLEC9AgydF4y2Ba嗨gydF4y2BaXCR1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba子集,可以相当于CD14gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD1agydF4y2Ba−gydF4y2Ba以前观察到人类皮肤细胞(gydF4y2Ba61年gydF4y2Ba)。因此,我们歧视模式有关人类AARP子集是小说,和我们的研究结果是一致的与其他类似的研究在人类血液细胞,皮肤和肺。gydF4y2Ba
发现肺子集更善于内化gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba相比之下,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)是与他人工作涉及血液BDCA1一致gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流。血BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流吞噬gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba更有效地与mo-DC相比,只有∼25%阳性gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba在50:1莫伊(1 h孵化后gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba)。相反,该直流子集∼60%阳性gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba相似的文化条件下(gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba)。我们观察到的差异可能与细菌不同的内化机制三个测试。而gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba和gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba主要是细胞外的病原体,gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba孢子萌发所需内化的吞噬细胞被认为是肺(gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba)。表面的表达TLR-2,尤其是地很低(gydF4y2Ba66年gydF4y2Ba)和BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba血直流(gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba),而不刺激,也同意我们的结果如果TLR-2,特别是地是主要的模式识别受体gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba内化。事实上,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流表达相对的mRNA水平升高gydF4y2BaTLR2gydF4y2Ba,而我和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流表达高水平的gydF4y2BaTLR4gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。这些结果表明,增加gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2Ba内化这三个子集将发生如果长时间点被检查。gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba识别和后续吸收吞噬细胞可能支持TLR-2,可能结合CD36感应的gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Badiacylglycerides (gydF4y2Ba67年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba68年gydF4y2Ba)。我们所做的观察gydF4y2BaCD36gydF4y2Ba信使rna在我和CD14升高gydF4y2Ba+gydF4y2Ba这可能部分解释了相对较高gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba通过这两个子集内化。在人类真皮,CD14的子集gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞已被证明表达TLR-2没有刺激,而第二个子集不(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。相当于人类航空公司可能CD14子集gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba分别为直流。gydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba孢子内化的重点是整合素异质二聚体CR3 (CD11b / CD18)吞噬细胞表面与孢子表面蛋白交互BclA (gydF4y2Ba69年gydF4y2Ba)。内化的力量进一步增加了由内向外信号由表面CD14表达(gydF4y2Ba70年gydF4y2Ba),同时补充激活的组件C1q和C3 (gydF4y2Ba71年gydF4y2Ba)。未来的研究可以集中在mRNA水平pathogen-sensing受体类似我们检查(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba),但在细菌暴露。gydF4y2Ba
我们使用的系统,与pH-sensitive染料标记细菌,消除了粒子的测量仅绑定到AARP的表面,而没有内化(gydF4y2Ba72年gydF4y2Ba)。然而,它也引入了内部化的可能性,我们集体测量效率和酸化。从理论上讲,一个吞噬细胞包含一个高酸化粒子能够贡献一个等价的荧光值作为一个细胞与内化三粒子酸化程度较轻。人工计数的内化gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba通过共焦显微镜(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2BaCD14)支持这种可能性gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流显示更高的平均PI值与我相比,而不是相反的使用流式细胞仪观察。CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流可能更好的吞噬作用与点(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba、中),至少gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba粒子,但超越CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流的酸化效率(基于时间和酸化水平)。Mϕ被公认为可怜的APC,迅速酸化时间和完全proteolytically降解吸收材料通过溶酶体融合。直流phagosomal酸化和蛋白水解降解效率低下,从而产生免疫原性肽的长度适合Ag)加载和显示(gydF4y2Ba73年gydF4y2Ba)。事实上,华盛顿可能积极缓慢酸化时间通过招聘的NADPH氧化酶NOX2活性氧和后续的生产(gydF4y2Ba74年gydF4y2Ba)。直流进化枝的成员我们建议(gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba)可能是公平的测试粒子但贫穷的内化在酸化后早期吞噬体形成,已被证明发生在未成熟DC在溶酶体级别(gydF4y2Ba75年gydF4y2Ba)。吞噬体形成后,Mϕendosomal融合导致插入空泡的H (+) phagosomal膜atp酶。活动的V-ATPase大幅增加早期Mϕ内化后的细菌,从而减少phagosomal pH值在20分钟(从生理7.4到6.0gydF4y2Ba76年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba77年gydF4y2Ba)。关闭转录我们确定了我和CD14之间的关系gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)可能与部分phagosomal酸化的更高的效率。Mϕ的例外与DC分化枝基于酸化将CD14的分离gydF4y2Ba−gydF4y2Ba与我和CD14直流gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,但显示可怜的内化和酸化细菌的能力(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4 bgydF4y2Ba)。一种可能性是,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流不是专门用于内化,BDCA3gydF4y2Ba嗨gydF4y2BaCLEC9AgydF4y2Ba嗨gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2BaDC在这个人口负责低水平的内化。我们观察到一个大CD14之间的分离gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流和其他两个成员的Mϕ进化枝PC2的PCA (gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba),它可以代表内化的变量/酸化。支持的想法变化酸化潜力子集之间休息CD14的观察gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,尤其是我表达mRNA水平较高的溶酶体蛋白质LAMP1 LAMP2相比与其他四个肺子集(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。如果实际,我们将分离出足够的细胞的AARP子集执行手册项粒子内化,从而确定酸化程度有助于我们观察到流仪π值的差异。我们已经可以推断和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流能更有效的粒子内化(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)与直流进化枝的成员,因为他们是慢启动成熟通路。Kiama et al。(gydF4y2Ba78年gydF4y2Ba)已经观察到未成熟的mo-DC拥有更大的吞噬潜在的聚苯乙烯珠LPS-matured mo-DC,和这些成熟mo-DC同样吞噬作用弱,相比之下我和血液单核细胞。因此,我们感到,一直流仪π值最高(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba),可能是最有效的在内化/酸化还慢的成熟的触发。我们的观察的最小CD83、CD86 upregulation我和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)表明,这两个子集仍处于不成熟的状态,允许不羁吞噬的细菌颗粒与quick-to-mature DC分化枝成员。gydF4y2Ba
的upregulation CD83、CD86和CCR7与次文化中突出DC分化枝但Mϕ软弱的进化枝(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。这些结果支持增加mRNA的表达这三个分子DC分化枝相对于Mϕ进化枝(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba),他们同意研究显示真皮Mϕ和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流不CCR7表达,即使在刺激,而真皮BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。这样的自然进化枝的差异可能是有益的在最小化潜在的促炎反应的大小在人类航空公司。解剖学上,Mϕ进化枝成员可能有时间和空间优势获得吸入微粒在DC分化枝成员,由于大量肺泡(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。这表明Mϕ进化枝可以“吸收”大多数吸入粒子没有白细胞激活。如果粒子溢出发生由于Mϕ进化枝饱和,DC分化枝成员接触,但相对较少的粒子。低接触允许直流进化枝上调CD83、CD86, CCR7在一个受控的方式和启动高度调节免疫反应(这将不会发生,如果发生接触迅速以极高的剂量)。封存的Ags已被证明发生在老鼠模型中吸入的细菌(gydF4y2Ba79年gydF4y2Ba),我们建议顺序相同的事件发生在人类的航空公司。gydF4y2Ba
在人类的真皮,CD14的较小的子集gydF4y2Ba+gydF4y2Ba自然地表达CD83细胞已被证明,但也减少了TLR-2水平(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba)。我们认为BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba这些CD83的气道等效直流gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaTLR-2gydF4y2Ba罗gydF4y2Ba真皮细胞,而CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流CD83是等价的gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaTLR-2gydF4y2Ba地中海gydF4y2Ba真皮细胞具有更高的能力TLR-2-dependent细菌内化。表面的CD83、CD86在BDCA1水平gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba从血液直流反应增加gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba接触,但在12 h (coincubation (gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们的转录分析表明肺AARP子集可以分为Mϕ和直流演化支,但是不成熟或成熟演化支mo-DC和mo-Mϕ贫穷模型。比较相对mRNA表达的趋化因子受体gydF4y2BaCCR6gydF4y2Ba和gydF4y2BaCX3CR1gydF4y2Ba提供具体的例子的基因所表达的是高度DC分化枝相比Mϕ进化枝和monocyte-derived吞噬细胞(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba80年gydF4y2Ba)。酪氨酸激酶gydF4y2BaFLT3gydF4y2Ba也特别高的直流进化枝,同意通过瓦斯科等。gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)在小鼠外围直流发展突显出它的重要性。其他表明mo-DC显著区别淋巴node-resident直流在转录水平(gydF4y2Ba81年gydF4y2Ba),而最近工作分组这些体外细胞与人类炎症直流驱动Th17响应(gydF4y2Ba82年gydF4y2Ba)。等,具体途径调节PXR / RXR激活补体系统,同意人类皮肤研究麦戈文et al。(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)表明,这两种方式在真皮Mϕ调节。整体密切联系我们观察我和CD14之间gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流也观察到比较skin-equivalent这组的子集。例如,我们确认gydF4y2BaLYVE1gydF4y2Ba作为一个独特的CD14基因表达增加gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba表二世gydF4y2Ba),被认为在真皮Mϕ和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流。我们的识别gydF4y2BaNR1H3gydF4y2Ba(肝X受体α)作为Mϕ调节基因的进化枝同意其特异性Mϕ其他人体组织(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba),还提供了一个潜在的目标调制Mϕ活动在炎症性疾病(gydF4y2Ba83年gydF4y2Ba)。有趣的是,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba我们分析没有一个明确的直流子集在血液或皮肤。我们怀疑CD14表达人口意味着与CD14转录关系密切gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流。然而,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaDC DC分化枝连同Langerin实际上分组gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba)。一个可能的BDCA1的功能gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流相比其他两个真实的直流子集可能与IL-17A信号(gydF4y2Ba表我gydF4y2Ba),应是未来研究的焦点。BDCA1还不足以表达与转录因子IRF4的表达式,如BDCA1 IRF4相对升高gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。尽管IRF4涉及指挥由人类BDCA1 Th17免疫反应gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba观察),这并不排除BDCA1的可能性gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaDC刺激Th17反应不涉及IRF4通过另一种途径。与CD14相比gydF4y2Ba+gydF4y2Ba特区BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流upregulation通路与细胞周期相关的和有丝分裂(gydF4y2Ba表我gydF4y2Ba),因此他们可能在稳态组织中自我更新的能力,作为信用证被建议在人类皮肤(gydF4y2Ba84年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba85年gydF4y2Ba)。重要的是,由直流通路调节分化枝是直流的预期功能,包括DC成熟和脂质CD1 Ag)表示。作为一个例子,趋化因子受体gydF4y2BaCX3CR1gydF4y2Ba独特的调节直流进化枝(gydF4y2Ba图6 dgydF4y2Ba),也是居民肾BDCA1表达的高度gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流(gydF4y2Ba86年gydF4y2Ba)。总的来说,LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba,BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流是人类的“真正的直流”航空公司可以分离转录的,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaBDCA1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流,CD14gydF4y2Ba−gydF4y2BaBDCA1gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流的Mϕ进化枝。gydF4y2Ba
我们确定了一些调节基因是与规范的降解途径(gydF4y2Ba表我gydF4y2Ba,gydF4y2Ba二世gydF4y2Ba)。这些结果同意认为Mϕ专攻快速、完整的蛋白水解降解,而直流支持延迟和不完整的过程产生免疫原性肽(gydF4y2Ba75年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba87年gydF4y2Ba)。其他途径调节具体点,比如PXR / RXR激活补体系统,最近同意人类皮肤研究表明两个通路调节真皮Mϕ和CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)。毫不奇怪的是,我取得了最大数量的度比其他APC子集(gydF4y2Ba表二世gydF4y2Ba),因为他们可能在肺组织(自我更新gydF4y2Ba88年gydF4y2Ba),而不是从循环稳态补给。相比之下,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流,至少在皮肤,转录归类为流动人口的前体血液单核细胞(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba,gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)。我们进一步分离CD14吗gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流基于CD16积极性,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞可能会出现更多的是比CD14的远亲gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞。CD14是可能的gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba−gydF4y2Ba类似“经典的细胞,单核细胞”(gydF4y2Ba34gydF4y2Ba),定期向航空运输和回引流淋巴结没有表型转换Mϕ或直流的特征。出现这种情况,一直在观察小鼠模型(gydF4y2Ba35gydF4y2Ba),理论上也有可能发生在人类身上。相比之下,CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba航空公司可以从CD16区分单核细胞的子集gydF4y2Ba+gydF4y2Ba间质Mϕ,但在穿越的过程中肺泡上皮细胞失去CD206表达式(gydF4y2Ba89年gydF4y2Ba,gydF4y2Ba90年gydF4y2Ba)。事实上,相对mRNA水平建议gydF4y2BaCD206gydF4y2Ba是最高的,其他五个APC子集相对低得多(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。然而,在我们CD14 CD16 mRNA,尽管最高gydF4y2Ba+gydF4y2Ba特区在BDCA1也相对较高gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流和CD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba直流。gydF4y2Ba
少数特定调节基因识别DC成员之间的进化枝(而不是更多的调节基因的所有成员国与Mϕ进化枝)指出,“真正的直流”子集之间的亲密关系(gydF4y2Ba无花果。gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba表二世gydF4y2Ba)。它也可能指向这些直流子集之间的可塑性根据不断变化发生在航空公司的微环境。事实上,其他人最近决定,皮肤和肺LangeringydF4y2Ba+gydF4y2Ba也可以表达BDCA1特区BDCA1血gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流可诱导表达Langerin培养时TGF-β(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba)。这种细胞因子以人类BALF中高浓度(gydF4y2Ba91年gydF4y2Ba),可能是由上皮细胞在航空公司(gydF4y2Ba92年gydF4y2Ba)维持抗炎环境响应经常吸入微粒。我们认识到,我们比较的严格的确可能消除一些基因调节由特定的成员在稳态直流进化枝。在转录分析,我们捐赠的影响,所以度确定必须统计调节子集的七个捐助者。我们样本收集更多的捐助者,我们可能已经能够测试生僻概要文件和识别更多subset-specific度,特别是对于直流进化枝成员。支持了这个观点我们相对表达的比较(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba),某些基因等gydF4y2BaCD1AgydF4y2Ba,gydF4y2BaSIRPβ1gydF4y2Ba,gydF4y2BaNR1H3gydF4y2Ba,gydF4y2BaXCR1gydF4y2Ba,gydF4y2BaCD11CgydF4y2Ba,gydF4y2BaIRF4gydF4y2Ba,gydF4y2BaIRF8gydF4y2Ba显然是高在一个特定的APC子集相对于其他五个子集。这些基因可能没有出现在subset-specific度列表(gydF4y2Ba表二世gydF4y2Ba),因为至少在一个捐赠者,他们不是调节。相比之下,的结果gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba不是由某些表达式过滤标准或意义的价值观,因此他们可以掩盖一个捐赠者局外人。比较的相对表达水平可能是更相关的功能区分AARP的子集,因为我们选择了基因分析基于现有文献的直流和Mϕ。gydF4y2Ba
微环境的差异等网站皮肤和肺部排除完全重叠基因签名相同的细胞类型。未来的研究途径之一就是识别等效气道子集之间通过转录分析人类和老鼠。其他人采取了类似的路径比较人类血液和皮肤BDCA1gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和BDCA3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba直流鼠标lymphoid-resident和nonlymphoid直流子集(gydF4y2Ba44gydF4y2Ba,gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba81年gydF4y2Ba)。我们建议把这个进一步通过比较人类呼吸道细胞的老鼠航空公司允许微环境的差异占物种之间。我们发现基因签名Mϕ和直流演化支,连同个人签名子集,还提供进一步描述这些细胞功能的方法基于这些度的蛋白表达。gydF4y2Ba
披露的信息gydF4y2Ba
作者没有利益上的冲突。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢下列人员从俄克拉荷马州医学研究基金会的援助:雅各低音和流式细胞术戴安娜汉密尔顿博士核心设备和本·福勒和朱莉起重机成像核心设施。我们感谢菲利普·汉纳博士(密歇根大学安阿伯分校MI)提供ger-nullgydF4y2Ba炭疽杆菌gydF4y2Ba。我们感谢k博士马克Coggeshall知识输入。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
这项工作是支持的资金从航空医学的办公室,联邦航空管理局(D.M.B.),退伍军人事务部格兰特1 I01 BX001937 (J.P.M.),和由美国国立卫生研究院的资助AI062629和GM103648 (J.P.M.)和HL119501(”栏目)。gydF4y2Ba
在本文中给出的微阵列数据已经提交给基因表达综合(gydF4y2Bahttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/gydF4y2Ba)加入GSE79706数量。gydF4y2Ba
本文包含的在线版本gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
本文中使用的缩写:gydF4y2Ba
- AARPgydF4y2Ba
- 气道,alveolar-resident白细胞gydF4y2Ba
- 房颤gydF4y2Ba
- 自发荧光gydF4y2Ba
- 我gydF4y2Ba
- 肺泡巨噬细胞gydF4y2Ba
- 落下帷幕gydF4y2Ba
- 支气管肺泡灌洗gydF4y2Ba
- BALFgydF4y2Ba
- 平衡液gydF4y2Ba
- BDCAgydF4y2Ba
- 血树突状细胞Ag)gydF4y2Ba
- 直流gydF4y2Ba
- 树突细胞gydF4y2Ba
- 度gydF4y2Ba
- 差异表达基因gydF4y2Ba
- IRFgydF4y2Ba
- 干扰素调节因子gydF4y2Ba
- 信用证gydF4y2Ba
- 朗格汉斯细胞gydF4y2Ba
- MϕgydF4y2Ba
- 巨噬细胞gydF4y2Ba
- mo-DCgydF4y2Ba
- monocyte-derived树突细胞gydF4y2Ba
- 莫伊gydF4y2Ba
- 感染复数gydF4y2Ba
- mo-MϕgydF4y2Ba
- monocyte-derived巨噬细胞gydF4y2Ba
- 个人电脑gydF4y2Ba
- 主成分gydF4y2Ba
- 主成分分析gydF4y2Ba
- 主成分分析gydF4y2Ba
- pDCgydF4y2Ba
- 血浆直流gydF4y2Ba
- πgydF4y2Ba
- 吞噬指数gydF4y2Ba
- RPMI-10gydF4y2Ba
- RPMI 1640有10%的边后卫。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2016年5月2日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2016年11月28日。gydF4y2Ba
- 版权©2017年由美国免疫学家协会有限公司gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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