文摘gydF4y2Ba
我们的每一次呼吸包含有害的病原体或过敏原。树突状细胞(dc)、单核细胞和巨噬细胞在维持一种微妙的平衡至关重要的初始免疫没有造成间接伤害肺部,因为夸张的炎症反应。记录在稳态肺单核吞噬细胞的多样性,我们对20名健康受试者进行支气管镜检查,抽样的近端和远端气道(支气管和支气管肺泡灌洗,洗分别),以及粘膜组织(支气管活检)。除了大量肺泡巨噬细胞的人口,我们确定了亚种群的单核细胞,骨髓DCs (mdc)和血浆DCs肺粘膜。中间单核细胞和mdc非常频繁的航空公司相比,外周血。引人注目的是,单核吞噬细胞的密度增加了航空公司在下行。单核细胞从血液和航空公司10倍比MDCs促炎细胞因子在体外刺激。然而,气道单核细胞炎症低于血液单核细胞,表明自然更加宽容。本研究建立的结果如何识别人类肺单核吞噬细胞和功能在正常情况下,所以失调患者的呼吸道疾病能被探测到的免疫力或发病机理阐明他们的贡献。gydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
肺大器官在连续接触外部环境。暴露在各种无害的粒子或潜在的病原体免疫反应需要一个战略,平衡向吸入Ags宽容和免疫力。我们的免疫监测中心是一个网络的单核吞噬细胞包括单核细胞和树突状细胞(dc)。单核细胞和DCs可分为不同的子集,但重叠函数(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba)。从本质上讲,DCs和单核细胞遇到Ags在肺部,然后处理和运输他们肺淋巴管。引流淋巴结,DCs的独特能力,激活新Ags幼稚T细胞,而单核细胞和DCs都可以重新激活记忆T细胞之前遇到了Ags (gydF4y2Ba2gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
人类血液中单核细胞可分为三个种群称为古典单核细胞(CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)、中间单核细胞(CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba),或者模单核细胞(CD16gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD14gydF4y2Ba−gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba5gydF4y2Ba)。从历史上看,单核细胞巨噬细胞被认为是前兆,DCs区分在从血液进入外围组织动员。然而,最近的研究结果表明,小鼠巨噬细胞自我更新,而善意的DCs源自一个单独的前体(gydF4y2Ba6gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba8gydF4y2Ba)。在老鼠中,单核细胞在noninflamed条件下仍然可以溢出既定的组织,同时保留他们的单核细胞的字符(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba),而在人类单核细胞已被证明渗透和分化成巨噬细胞或DC-like细胞发炎设置(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba)。描述了DCs在啮齿动物行气道粘膜,形成紧密的网络在上皮细胞和肺泡空间,在那里他们可以协调保护或造成免疫病理(gydF4y2Ba12gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba)。重要的是,小鼠的肺DCs区分自己从DCs从血液或其他组织中获得的能力决定的质量和位置T细胞反应(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba16gydF4y2Ba)。然而,单核吞噬细胞位于肺也可以对疾病严重程度作出了重大贡献,因为他们控制炎症反应的程度在识别危险(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。综上所述,这凸显了需要研究lung-resident单核吞噬细胞在肺疾病,尽管血液单核细胞和DCs在人类更容易获得和可访问。gydF4y2Ba
调查lung-resident DCs和单核细胞在人类已持续了近30年,在依靠形态学和开拓性研究有限表达单一标记如HLA-DR和CD11c使用免疫组织化学(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)。识别特定的血液后直流Ags (BDCA) 2000年(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba),一个新的努力描述DCs在人类肺癌透露CD1c等罕见的DCs的数量gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(BDCA-1)和CD141gydF4y2Ba+gydF4y2Ba(BDCA-3)骨髓DCs (mdc)和CD123gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血浆DCs(髓)与T细胞刺激能力(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba)。然而,这些研究的限制使用四色流式细胞术的风险包括DCs具有相似的表型标记的细胞群。研究中应用更先进的流式细胞仪面板、非癌性肺组织从外科切除术的患者通常使用(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba28gydF4y2Ba),尽管目前尚不清楚这些稀有人群真正DCs在健康受试者的代表。事实上,几项研究已经调查了DCs在肺部疾病如哮喘、慢性阻塞性肺疾病、细支气管炎和结节病(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba35gydF4y2Ba)。在慢性阻塞性肺病,成熟的表达分子DCs已被建议作为一个潜在的诊断/治疗目标。然而,有相互矛盾的结论关于疾病进展相关的高(gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba)或降低(gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)costimulatory分子的表达。这凸显了需要继续调查和清晰的基线健康对照组病变条件下允许更精确的比较。最近,盖尔et al。(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)获得整个肺从人类尸体区分单核吞噬细胞和血管或支气管隔间nondiseased条件,重申需要改善我们的知识的肺在健康人体内单核吞噬细胞。gydF4y2Ba
仔细描述种群的单核细胞和DCs在稳态肺部,我们进行支气管镜检查健康,不吸烟的人从我们获得的粘膜组织(支气管活检(减少)),以及两个连续灌洗取样近端和远端气道(支气管冲洗(BW)和支气管肺泡灌洗(BAL),分别)。此外,我们抽取外周血单核细胞的分布的比较基准和DCs在流通。在分析的同时进行新样品,我们冻结BAL细胞是否检索单核吞噬细胞解冻后仍与新鲜细胞样本。为简单起见,我们有广泛称为肺部CD14 / CD16-expressing细胞单核细胞根据其形态和表面受体的表达,我们不能确认他们是否仍为单核细胞分化成巨噬细胞或DCs在肺部。此外,我们有机密MDCs CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2Ba或CD141gydF4y2Ba+gydF4y2Ba基于表型的表达这些标记,但它们也可以称为经典2型直流或1型,分别为(gydF4y2Ba37gydF4y2Ba)。我们的研究结果显示,健康人类,有内在的单核细胞的分布和DCs之间的差异在呼吸系统,以及这些细胞的反应到特定的TLR刺激。回应当前视图,免疫细胞是高度受暗示他们在微环境(接收gydF4y2Ba38gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba40gydF4y2Ba),我们的数据支持这一概念,还解剖位置形状分布和单核细胞和DCs的功能,不仅在血液和肺之间,而且在不同的隔间的肺。了解肺单核吞噬细胞的稳态是基础调查这些人群的变化在感染或炎症,这样我们可以识别渗透增加,损耗,在疾病或损伤函数。gydF4y2Ba
材料和方法gydF4y2Ba
主题gydF4y2Ba
健康受试者完成以下入选标准被邀请参加这项研究:18岁至40岁之间的男性和女性y是谁不吸烟者与正常肺功能和无疾病或感染(gydF4y2Ba表我gydF4y2Ba)。知情同意是获得所有的志愿者在口头和书面信息。这项研究是通过当地的伦理审查委员会Umea大学同居,瑞典和执行根据《赫尔辛基宣言》。gydF4y2Ba
支气管镜检查gydF4y2Ba
支气管镜检查进行如前所述(gydF4y2Ba41gydF4y2Ba)。总之,健康志愿者接受口服咪达唑仑(4 - 8毫克)和静脉输液格隆(0.2 - -0.4毫克)30分钟(min)在支气管镜检查。用利多卡因局部麻醉了,额外的利多卡因在喉和气管管理过程。一个灵活的电子支气管镜(奥林巴斯BF IT200)是通过一个塑料插入通过口腔喉舌。从每个主题,6至9支气管粘膜活检被从主船底座,左侧主支气管分支使用有孔的钳(奥林巴斯FB-21C)。为了避免污染的外周血,我们执行BW(2×20毫升)和平衡(3×60毫升)与生理盐水侧一侧。在支气管镜检查前,32毫升血液来自每个主题在真空采血管CPT管(BD)。gydF4y2Ba
单细胞制备血液和呼吸样本gydF4y2Ba
完整的活检标本在哈佛商学院洗(Sigma-Aldrich)在室温下5分钟(RT)。标本然后用5毫米1,孵化4-DTT (Sigma-Aldrich) 15分钟在rt,德勤的解决方案是更换RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) 15分钟在rt,孵化项目都在15毫升管而摇摆30 rpm。活检被转移到一个48-well细胞培养板,每在一个活检消化解决含0.25毫克/毫升胶原酶II (Sigma-Aldrich)和0.2毫克/毫升DNase (Sigma-Aldrich) RPMI 1640 1 m消息灵通的缓冲区。孵化后37°C在220 rpm摇臂为30分钟,活检是用移液器吸取前几次完全分解组织继续孵化30分钟。消化活检被汇集在一起,resuspended流式细胞仪包含PBS缓冲+ 2% FCS, 40-μm细胞过滤器,过滤和离心400×gydF4y2BaggydF4y2Ba5分钟在4°C。BW和BAL样本100 -μm尼龙过滤器过滤(Syntab)和离心机400×gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟在4°C。收集血液样本被倒和离心机1800×8 - 10倍gydF4y2BaggydF4y2Ba在rt, PBMCs 30分钟收获,在无菌PBS resuspended,离心机400×gydF4y2BaggydF4y2Ba15分钟在4°C。去除浮层后,所有细胞数使用台盼蓝排斥手动测量可行性。细胞随后被沾染了Abs流仪分析。此外,细胞从血液和BAL冷冻冷冻剂中含90% FCS和10% DMSO (WAKO-Chemie医学)和存储在−80°C为以后分析。gydF4y2Ba
刺激PBMCs与TLR配体和平衡细胞gydF4y2Ba
PBMCs和平衡细胞培养在1×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞/毫升RPMI 1640 (Sigma-Aldrich)含10% FCS(表达载体)。细胞被刺激3 h和5μg /毫升polyinosinic: polycytidylic酸(polyI: C;TLR3配体;Sigma-Aldrich)、1μg /毫升有限合伙人(TLR4配体;Sigma-Aldrich)、1μg /毫升imidazoquinoline化合物(3 m - 019;TLR7/8配体)(Robert逾越节家宴博士的礼物,国立卫生研究院)。30分钟后,10μg /毫升brefeldin (Sigma-Aldrich)添加到文化抑制细胞因子的释放。gydF4y2Ba
流式细胞术分析gydF4y2Ba
免疫组织化学gydF4y2Ba
消退是加工成甲基丙烯酸乙二醇酯树脂(Polyscience),(如前所述)(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba43gydF4y2Ba)。与aminoethylcarbazole所有部分都可视化,细胞核和迈耶的苏木精复染色。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
对所有实验数据表示为±四分位范围中值(差),除非另有说明。数据分析使用GraphPad棱镜(GraphPad软件)6.0版本。统计学意义是由非参数方差分析(克鲁斯卡尔-沃利斯检验)其次是邓恩的测试为多个比较正确。数据被认为是重要的gydF4y2BapgydF4y2Ba< 0.05。相关性的流式细胞术和免疫组织化学双尾枪兵的测试数据进行了分析。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
可行的白细胞可以恢复消化消退允许通过流式细胞术分析gydF4y2Ba
现有研究描述人类呼吸道单核细胞和DCs专门使用BAL吸入物或从患者肺组织/尸体(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)。因为手术切除或全部肺组织稀少,是微创的方法获取肺组织从健康志愿者的低潮是在这项研究中使用。航空公司进一步划分,我们执行顺序洗取样第一越近端航空(BW),随后远航空公司(BAL) (gydF4y2Ba44gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba1 bgydF4y2Ba)。20个健康的志愿者进行了外周血抽样后支气管镜检查,与每个主题提供六到九活组织检查,以及从BW送气,BAL (gydF4y2Ba表我gydF4y2Ba)。在这项研究中,我们调查是否单核细胞和DCs存在于血液也驻留在肺部。进一步,我们绘制的分布lung-resident单核吞噬细胞通过比较从气道腔和收集的细胞存在于粘膜组织。由于活检大小有限,因此可用的组织数量,活检通常嵌入组织切片,免疫组织化学分析。然而,这种方法限制了识别特定的直流子集,需要同时分析多个细胞表面标记的准确识别。除了嵌入组织切片低潮,我们优化酶消化的协议减少为流式细胞术获得单细胞悬浮体。我们能够获取足够数量(gydF4y2Ba图1 cgydF4y2Ba)的单个细胞采样间隔与相对较高的生存能力(gydF4y2Ba图1 dgydF4y2Ba台盼蓝排斥染色)作为评估。详细描述协议的优化对恢复低潮所示的单个细胞gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba。总之,六到九切片测量∼1毫米gydF4y2Ba3gydF4y2Ba从每个主题在寒冷中收集到准备处理(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2 bgydF4y2Ba)。活检在哈佛商学院彻底清洗,然后接受德勤解散任何粘液之前DNase和胶原酶II处理以保持酶的消化肺组织(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba)。池6个月至9个活检,我们平均获得1.5×10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba每个主题细胞(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。单个细胞从低潮CD45沾anti-CD45区分gydF4y2Ba+gydF4y2Ba大多数人的白细胞nonhematopoietic CD45gydF4y2Ba−gydF4y2Ba肺细胞(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba)。平均总额的12%的活细胞肺消化白细胞是评估通过流式细胞术(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba)。在平行,我们进行了免疫组织化学退潮部分来自同一主题和量化的平均125 CD45gydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞/毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba(gydF4y2Ba图2 fgydF4y2Ba)。这两种不同的技术的能力可比识别白细胞(gydF4y2Ba图2 ggydF4y2Ba)。简而言之,通过收购单个细胞从低潮,我们开发了一个可行的方法的抽样肺组织健康受试者或病人没有接受手术,使提取更多的信息从一个小组织样本描述稀有的细胞用流式细胞术。gydF4y2Ba
中间单核细胞更加频繁的航空公司,而经典的单核细胞在稳态更频繁的血液中gydF4y2Ba
我们获得足够数量的不同的采样间隔执行流的单个细胞仪分析。BW,因此,我们染色新鲜PBMCs落下帷幕,与21和减少细胞表型和各种免疫细胞的活化标记(gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba)。在BW和BAL样本,巨噬细胞是免疫细胞的人口主要由微分细胞计数(gydF4y2Ba补充图1gydF4y2Ba)。巨噬细胞第一次被排除在我们的流仪分析基于高自发荧光和粒度,以防止对其他单核吞噬细胞(gydF4y2Ba补充图1 b, cgydF4y2Ba)(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba,gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba)。接下来,我们调查是否有tissue-resident单核细胞在稳态呼吸道,因为单核细胞大多报道中渗透到肺部炎症条件(gydF4y2Ba11gydF4y2Ba,gydF4y2Ba45gydF4y2Ba)。在血液单核细胞可分为基于CD14和CD16表达不同的子集。通过控制直播、low-autofluorescent单线态细胞,我们首先排除B细胞(CD20gydF4y2Ba+gydF4y2Ba),T细胞(CD3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba)、NK细胞(CD56gydF4y2Ba+gydF4y2Ba或CD11cgydF4y2Ba昏暗的gydF4y2BaSSCgydF4y2Ba低gydF4y2Ba)和中性粒细胞(CD66abcegydF4y2Ba+gydF4y2Ba或CD11cgydF4y2Ba昏暗的gydF4y2BaSSCgydF4y2Ba嗨gydF4y2Ba)在一个血统转储(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba)。更多信息在淋巴细胞的分布在BW和落下帷幕,一个单独的染色面板,允许使用单个大子集的分析淋巴细胞(gydF4y2Ba补充图2gydF4y2Ba,gydF4y2Ba补充表我gydF4y2Ba)。大多数的单核细胞和DCs在HLA-DR的数量可以被识别gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血统gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在PBMC细胞,平均频率,BW,落下帷幕,和减少5,6,10,和3%,分别占总住白细胞(gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba3 bgydF4y2Ba)。我们进一步划分基于血液命名为经典(CD14的单核细胞gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba−gydF4y2Ba绿色)、中级(CD14gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba非经典数理(CD14、红色)或gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba、蓝色)单核细胞(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。虽然古典单核细胞是血液的多数人口(HLA-DR的53%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血统gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞)与BW(9%)相比,BAL(10%),和减少(17%)、中级单核细胞占人口最大的单核细胞/航空monocyte-derived细胞,在BW (HLA-DR的16%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血统gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞)和平衡(32%)与血液(7%)(gydF4y2Ba图3 cgydF4y2Ba)。BW模单核细胞也被少数人口(6%)和平衡(6%)与血液(11%)。类似于啤酒等。gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),我们无法确定CD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba单核细胞在肺组织,不包括CD16进一步分析。总的来说,我们的数据表明,血液中的单核细胞各亚群也可以确定下呼吸道,但频率取决于细胞的精确位置采样在肺(gydF4y2Ba补充表2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Monocyte-derived表型细胞中确定航空公司可能类似于DCs但不是巨噬细胞gydF4y2Ba
地址是否这些tissue-resident单核细胞表型类似mdc我们评估他们的表达CD1c CD141和观察到的一个upregulation标记,特别是CD1c单核细胞在BW和落下帷幕,但不是在血(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。落下帷幕,在平均28%的古典CD1c单核细胞表达,其次是模单核细胞的15%和5%的中间单核细胞(gydF4y2Ba图4 bgydF4y2Ba)。作为CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2Ba善意的DCs,依赖于转录因子IRF4 (gydF4y2Ba26gydF4y2Ba),我们评估是否IRF4 CD1c也是调节gydF4y2Ba+gydF4y2Ba单核细胞(gydF4y2Ba图4摄氏度gydF4y2Ba)。而CD1cgydF4y2Ba−gydF4y2Ba古典单核细胞表达低水平的IRF4 CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2BaIRF4的古典单核细胞表达水平较高,尽管比CD1c下级gydF4y2Ba+gydF4y2Bamdc建议中间人口。这个观察表明,尽管缺乏炎症环境中,单核细胞可能会收购DC-like呼吸道甚至在稳态的表型。盖尔et al。(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)也在转录组水平报道,monocyte-derived DCs在肺部表达高水平的IRF4比古典血液中单核细胞。解决中标识的单核细胞BAL能否表型类似于巨噬细胞,我们评估的表达趋化因子受体CCR2,据报道,由CD14表达下调gydF4y2Ba+gydF4y2Ba单核细胞分化成巨噬细胞间隙时,以及CD206(甘露糖受体)和CD163(清道夫受体),这是典型的巨噬细胞标记(gydF4y2Ba图4 dgydF4y2Ba)。虽然我们观察的upregulation CD206落下帷幕,在所有的单核吞噬细胞包括mdc CCR2或差别我们不能检测到对这些upregulation CD163,表明落下帷幕的单核细胞分化成巨噬细胞。gydF4y2Ba
MDCs更频繁的肺部的血液,随着密度在下行气道稳态gydF4y2Ba
接下来,我们开始从HLA-DR识别特定子集的DCsgydF4y2Ba+gydF4y2Ba血统gydF4y2Ba−gydF4y2Banonmonocytic (CD14gydF4y2Ba−gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba−gydF4y2Ba人口)。在这些细胞中,我们可以区分MDCs PDCs CD11cgydF4y2Ba+gydF4y2Ba细胞或CD11cgydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞,分别为(gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba)。MDCs被进一步细分为CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2Bamdc(珊瑚)或CD141gydF4y2Ba+gydF4y2Bamdc(栗色),而髓(蒂尔)coexpressed CD123和CD303 (BDCA-2)。所有的直流子集可以识别不同肺隔间以不同的频率。mdc在HLA-DR一般更频繁gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血统gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞在气道和肺组织的血液。相比之下,6%的血液,CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs由6、11和HLA-DR总量的15%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血统gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞在BW,落下帷幕,和低潮,分别为(gydF4y2Ba图5 bgydF4y2Ba)。我们也评估了表达CD1a因为有矛盾的报告关于CD1c CD1a在族群的表达gydF4y2Ba+gydF4y2Bamdc Demedts et al。(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba)表明CD1a-expressing细胞位于肺上皮细胞而不是肺实质。虽然我们所有CD1c指出,在16和19%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba分别MDCs BW和拜尔表示CD1a CD1c的只有9%gydF4y2Ba+gydF4y2Bamdc在粘膜组织消化CD1a表示。排除的可能性CD1a抗原决定基活检的丢失是由于酶消化,我们也玷污了衰退的部分使用免疫组织化学检测CD1a-expressing细胞。事实上,几乎没有CD1a-expressing细胞(1细胞/毫米gydF4y2Ba2gydF4y2Ba,gydF4y2BangydF4y2Ba= 20)活检(gydF4y2Ba图5度gydF4y2Ba)。像预期的那样(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),血液CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs没有coexpress CD1a。CD141gydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs HLA-DR也更频繁gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血统gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞BW(1.5%)和平衡(3%)相比,衰退(0.1%)或血液(0.2%)。与mdc, PDCs少在所有HLA-DR航空为0.8和1.5%gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血统gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞分别在BW和落下帷幕,而血液(5%)或减少(5%)。我们详细的表型分析三个不同的直流子集的肺隔间,连同周边血液采样在同一个主题,表明有不同子集的DCs驻留在稳态下呼吸道,尽管这些罕见的人群的实际频率取决于抽样解剖位置。BW和BAL包含直流子集的类似的模式,但随着频率从近端到远端航空公司。尽管BAL样本通常采取反映出现在肺组织细胞如诊断(gydF4y2Ba46gydF4y2Ba),我们的数据表明,DCs的分布抽样的航空公司并不完全代表DCs中确定肺粘膜组织。所有的直流子集都更频繁的组织比总HLA-DR之间的航空公司gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血统gydF4y2Ba−gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba
CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs表达更多costimulatory分子和趋化因子受体航空公司的血液gydF4y2Ba
我们评估了单核细胞的成熟状态,DCs在稳态因为这可能表明他们迁移到淋巴结的能力,刺激T细胞。首先,我们调查了costimulatory分子CD86的表达,结合CTLA-4和T细胞CD28 (gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)。与血液同行相比,古典CD1c和单核细胞gydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs BW和BAL CD86表达较高抽象级别的。的成熟表型不太可能仅仅是样品处理或处理的结果因为PDCs呼吸隔间CD86表达较低(gydF4y2Ba图6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6 bgydF4y2Ba)。单核细胞和DCs中确定组织也相对不成熟,尽管严厉处理方法涉及酶消化。接下来,我们表达的趋化因子受体CCR7相比,迁移所需的DCs淋巴结,其配体CCL19 CCL21产生,并发现CD1c平均10%gydF4y2Ba+gydF4y2Bamdc CD141 3%gydF4y2Ba+gydF4y2Bamdc和2%的髓BAL CCR7表达,与相应的血液细胞子集(gydF4y2Ba图6 cgydF4y2Ba,gydF4y2Ba6 dgydF4y2Ba)。有趣的是,其gydF4y2Ba+gydF4y2Ba人口CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs显示减少的表达CCR2(重要从骨髓组织归巢)(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba)和增加IRF4的表达式(重要驾驶T细胞反应)(gydF4y2Ba49gydF4y2Ba)(gydF4y2Ba图6 egydF4y2Ba),这表明这些细胞有居住在组织长和回应Ag)在肺部。综上所述,我们的数据表明,尤其是CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs气道腔中发现,随着采样落下帷幕,BW和显示一个更成熟的表型,与CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs从血液或消退。gydF4y2Ba
单核细胞和DCs从血液或航空公司应对TLR刺激体外通过产生不同程度的肿瘤坏死因子根据血统和解剖位置gydF4y2Ba
更成熟的单核细胞的表型和DCs在航空公司可能会影响细胞如何应对致病性的信号。使用面板的纯化TLR配体如有限合伙人(TLR4) polyI: C (TLR3)和TLR7/8配体(7/8L),我们挑战PBMCs BAL细胞体外研究其产生肿瘤坏死因子等促炎细胞因子的能力。3小时内的刺激在brefeldin面前,阻止细胞因子的释放,我们观察到不同的肿瘤坏死因子生产模式在不同的细胞内染色细胞群的肿瘤坏死因子(gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba)。在很大程度上,决定细胞的个体发生TLR配体他们回应和有效的反应。单核细胞的子集(包括那些类似MDCs表型)显示更频繁TNF-producing细胞也意味着荧光强度(MFI)的肿瘤坏死因子高于DCs刺激后,除髓在7/8L刺激(gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba,gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)。解剖位置也调整TLR刺激的反应,因为BAL单核细胞一直与血液同行相比降低TNF的小额信贷机构。这适用于所有的直流子集,CD1c除外gydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs BAL细胞更敏感TLR刺激(gydF4y2Ba图7 bgydF4y2Ba,gydF4y2Ba7 cgydF4y2Ba)。总之,我们已经表明,血统和环境因素都可以调节血液和BAL单核细胞的功能容量和DCs在回应TLR刺激。gydF4y2Ba
可行的和功能性单核细胞和DCs可以从冷冻检索BAL细胞gydF4y2Ba
由于人类样本的限制可用性,这将是有益的冻结病人材料为实用目的和未来分析解决后续问题。然而,重要的是,我们首先建立冻融BAL的过程细胞是否会改变其表型或频率。当我们失败在冻融细胞衰退样本(6%细胞复苏)和没有足够的细胞从BW样品也冻结,我们继续冻结BAL细胞在冷冻剂,所述gydF4y2Ba材料和方法gydF4y2Ba。我们获得了60%的细胞复苏冻融BAL细胞生存能力的68% (gydF4y2Ba图8gydF4y2Ba)。所有的单核细胞和直流子集确定新鲜BAL样本所示gydF4y2Ba3无花果。gydF4y2Ba和gydF4y2Ba5gydF4y2Ba在冷冻BAL样本也可以确定,尽管冻融后的相对比例的人口转移(gydF4y2Ba图8 bgydF4y2Ba)。我们还发现有轻微差异CD86表达新鲜和冷冻BAL样本之间的变化取决于特定的细胞亚群(gydF4y2Ba图8 cgydF4y2Ba)。模的单核细胞似乎更容易freeze-thawing-induced成熟CD86表达增加,而CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs显示CD86的表达减少,这表明更成熟的DCs的冻融可能没有幸存下来。冷冻细胞也可以应对TLR刺激产生TNF在见一个类似的模式gydF4y2Ba图7gydF4y2Ba下新孤立BAL细胞(gydF4y2Ba图8 dgydF4y2Ba)。总之,冻结BAL细胞是单核吞噬细胞的表型分析的可行的方法,因为所有的不同子集仍然可以从冷冻样品用最小的诱导成熟中恢复过来。然而,人口的变化频率建议应该有只使用新鲜的或冷冻样品的一致性。这样一个过程将减少误解的结果目标朝向比较单核细胞和直流子集是否改变了在炎症和感染。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
DCs和单核细胞在肺部形成免疫反应(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba50gydF4y2Ba)。他们的分布和功能在不同情况下都进行了广泛的调查在啮齿动物(gydF4y2Ba51gydF4y2Ba)。这些努力在我们目前的理解,DCs和单核细胞编排耐受性反应朝着良性的物质对肺有害的病原体或免疫力。然而,这些发现的翻译一直受到遗传、解剖和免疫学啮齿动物和人类之间的差异(gydF4y2Ba52gydF4y2Ba,gydF4y2Ba53gydF4y2Ba)。人类肺癌研究几乎完全使用落下帷幕,很少有研究使用的肺部组织。在这项研究中,我们已经优化协议抽样肺支气管粘膜活检组织通过从主支气管分歧和消化成单细胞悬浮液进行多色流式细胞术和从一些细胞获取更多信息。证实了流式细胞仪数据外,我们还对切片进行免疫组织化学显示协会在白细胞的识别使用两种不同的方法。活检的包容也允许我们解决细胞仍然驻留在空间分布的粘膜组织与细胞衬里的气道腔灌洗。我们区分了航空公司进一步通过抽样近端和远端航空,BW和落下帷幕,分别给更多的信息在单核细胞的解剖分布和DCs在稳态。gydF4y2Ba
通过比较单核细胞从血液特征明显不同的呼吸道隔间,亚种群,我们已经表明,中间单核细胞在肺与血液更加频繁。中间这些CD14的性质gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD16gydF4y2Ba+gydF4y2Ba单核细胞是指发展的过渡时期古典单核细胞,血液,主要人口为模单核细胞(gydF4y2Ba54gydF4y2Ba)。虽然我们广义CD14 / HLA-DR CD16-expressing细胞gydF4y2Ba+gydF4y2Ba血统gydF4y2Ba−gydF4y2Ba单核细胞,我们认识到,他们可能分化成多个DC-like或macrophage-like细胞从循环进入肺部,由于单核细胞的可塑性。根据我们的发现,肺单核细胞在稳态上调CD1c和CD141,通常由MDCs表示。这些细胞可能代表体内monocyte-derived DCs尚未确定检测不到发炎的迹象的情况下,尽管只有健康的淋巴组织进行评估之前(gydF4y2Ba10gydF4y2Ba)。盖尔et al。(gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)说明CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2Bamonocyte-derived nondiseased肺细胞有优越的T细胞刺激能力与CD1c相比gydF4y2Ba−gydF4y2Ba组织单核细胞。这个优点nonlymphoid健康组织的进一步调查确认稳态monocyte-derived DCs的存在。单核细胞指在我们的研究中还可以包括monocyte-derived间质巨噬细胞被别人(gydF4y2Ba27gydF4y2Ba,gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba56gydF4y2Ba)。蔡等人相比血液单核细胞和间质巨噬细胞在肺部的恒河猴和显示他们表达非常相似的标记,除了间质巨噬细胞,单核细胞不同,没有表达CCR2,这是很重要的招聘从骨髓单核细胞循环,然后组织(gydF4y2Ba55gydF4y2Ba,gydF4y2Ba57gydF4y2Ba)。然而,我们无法CCR2在单核细胞的差别显示对这些标识在落下帷幕。进一步分析差异表达基因在这些亚种群将宝贵的令人信服地决定他们的个体发生。gydF4y2Ba
我们识别CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2Bamdc CD141gydF4y2Ba+gydF4y2Bamdc和髓样在肺组织和气道腔符合先前的研究使用肺组织(gydF4y2Ba14gydF4y2Ba,gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba,gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba36gydF4y2Ba)和平衡(gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba)在健康和患病的条件。在这项研究中,除了识别特定的直流子集,我们绘制了DCs在稳态肺的解剖分布相同的主题。三个直流子集的比例相对相似的近端和远端航空公司,但在粘膜组织完全不同,是在比气道的髓腔更丰富。有趣的是,CD1c的频率gydF4y2Ba+gydF4y2Bamdc和CD141gydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs高出持续气道腔和肺组织与血液相比,相对于总HLA-DRgydF4y2Ba+gydF4y2Ba血统gydF4y2Ba−gydF4y2Ba在每个取样室人口。此外,肺DCs的密度增加下行气道,与所有的直流子集被更频繁比航空公司近端支气管肺泡外围地区的肺泡。这可能反映了快速检测的必要性的有害的代理设法逃脱了呼吸道的多层物理和化学屏障,因为肺泡的主要网站微生物和有毒药物进入血液循环。的CD1a upregulation CD1c的子集gydF4y2Ba+gydF4y2Bamdc在气道和肺组织,与血,可能是一个扩张的曲目检测微生物的威胁,因为在呈现脂质Ags CD1分子都是重要的。gydF4y2Ba
虽然细胞表面标记的表型分析识别lung-resident单核吞噬细胞的一个重要方法,我们想要评估其功能性的能力可能阐明他们的角色在肺部。costimulatory分子和趋化因子受体的表达可能提供线索他们的成熟状态,这决定了他们的能力转移到淋巴结和/或激活T细胞,启动自适应免疫反应(gydF4y2Ba58gydF4y2Ba)。单核细胞和DCs粘膜组织是相对不成熟,类似的单核细胞和血液中DCs。不过,总体而言,单核细胞和MDCs航空公司(BW和BAL)表达了semimature表型,与血液单核细胞和DCs相比,因为他们更高水平的CD86表达。DCs在航空公司的比例调节CCR7,表明淋巴node-homing表型。此外,CCR7gydF4y2Ba+gydF4y2BaCD1cgydF4y2Ba+gydF4y2Ba在落下帷幕与CCR7 MDCsgydF4y2Ba−gydF4y2Ba同行表示CCR2和更高水平的IRF4的较低水平。CCR2,除了外围组织归巢受体(gydF4y2Ba47gydF4y2Ba,gydF4y2Ba48gydF4y2Ba),已被证明是重要的在DC-elicited Th1反应(gydF4y2Ba59gydF4y2Ba),而IRF4牵连Th2 (gydF4y2Ba49gydF4y2Ba,gydF4y2Ba60gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba62年gydF4y2Ba)和Th17反应(gydF4y2Ba26gydF4y2Ba,gydF4y2Ba63年gydF4y2Ba)。综上所述,这突显了DCs的表型和功能异质性可能在肺部,甚至在一个CD1c人口gydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs。因为这些健康受试者没有气道炎症的迹象,semimature表型可能表明单核吞噬细胞遇到self-Ags或无害的粒子和回应更耐受性的方式,可能产生抗炎因子或控制的调节性T细胞(gydF4y2Ba64年gydF4y2Ba)。连续相声肺单核吞噬细胞和组织微环境之间也可以调节适当的回应,因为周围的细胞已做好准备,来认识自我平衡的变化。gydF4y2Ba
再往下,我们调查是否呼吸单核细胞和DCs在炎症反应的方式如果与病原体的挑战。以前,特定的肿瘤坏死因子等细胞因子由monocyte-derived细胞肺与流感病毒感染小鼠的免疫病理学相关(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba)。诱导细胞因子风暴导致严重的肺部炎症也被观察到在大流行性流感期间人类肺部。模拟微生物暴露在我们的体外培养,我们刺激大部分PBMCs BAL细胞和细菌的数量有限合伙人和合成类似物代表ssRNA (imidazoquinoline)或dsRNA (polyI: C)潜在的病毒的起源,并确定肿瘤坏死因子3 h后的生产用细胞内细胞因子染色流式细胞术。TNF生产我们的数据显示一个不同的模式在单核细胞明显优于DCs TNF的生产在3 h,无论他们来自血液或肺部。然而,肿瘤坏死因子生产的模式也不相同的落下帷幕,同样的子集在PBMC与TNF强响应被减毒BAL单核细胞。相比之下,CD1cgydF4y2Ba+gydF4y2BaMDCs BAL优于他们的血液中产生TNF。这些差异可能在免疫监视指向他们扮演不同的角色,与单核细胞诱导炎症的最前沿,而DCs是更好的装备Ag)表示(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba65年gydF4y2Ba)。继续增加我们的理解人类肺单核吞噬细胞是解剖肺单核细胞和DCs呈现Ag)和他们是否还可以指示T细胞回家专门到肺部。确认他们的迁移能力在稳态lung-draining淋巴结,CCR7表达之外,淋巴结吸入物从健康受试者将有价值的材料进行调查。gydF4y2Ba
在这项研究中,我们已经说明了单核细胞和DCs不同分布在特定的人类肺粘膜隔间稳态诱发炎症与不同的能力。因此,抽样方法可以极大地改变调查的结果,特别是当呼吸道单核细胞或DCs进行广义的结论。我们并排比较新鲜和冷冻细胞还透露了频率。因此,重要的是要使用新鲜的或冷冻细胞保持一致。更重要的是,所有的亚种群的单核吞噬细胞仍然可以从冷冻BAL细胞和他们保留检索功能的能力。这提供了一个重要的物流解决方案从实验的角度和允许小心,继续分析宝贵的材料。总之,因为支气管镜检查通常安全和耐受性良好,我们的抽样方法肺单核吞噬细胞可以执行健康对照组和肺部疾病患者,以及后续或纵向研究。通过建立清晰的基线,我们为未来提供一个资源调查肺癌单核细胞和DCs在病理条件。gydF4y2Ba
披露的信息gydF4y2Ba
作者没有利益上的冲突。gydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢志愿者贡献了临床材料研究。我们也感谢工作人员的公共卫生和临床医学,医学部门/呼吸医学、于默奥大学医院(Norrlands universitetssjukhus),所有收集的临床资料。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
这项工作是A.S.-S赠款支持。从瑞典国际发展研究机构/部门合作(SAREC),瑞典政府机构创新体系(Vinnova),瑞典研究理事会,瑞典心肺基础,瑞典战略研究基金会的瑞典社会医学研究,卡罗林斯卡医学院,蛇Wiberg基金会,撕尼尔森的基础。gydF4y2Ba
本文包含的在线版本gydF4y2Ba补充材料gydF4y2Ba。gydF4y2Ba
本文中使用的缩写:gydF4y2Ba
- 落下帷幕gydF4y2Ba
- 支气管肺泡灌洗gydF4y2Ba
- BDCAgydF4y2Ba
- 血直流Ag)gydF4y2Ba
- BWgydF4y2Ba
- 支气管冲洗gydF4y2Ba
- 直流gydF4y2Ba
- 树突细胞gydF4y2Ba
- 低潮gydF4y2Ba
- 支气管活检gydF4y2Ba
- 位差gydF4y2Ba
- 四分位范围gydF4y2Ba
- IRF4gydF4y2Ba
- 干扰素调节因子4gydF4y2Ba
- 争取民主变革运动gydF4y2Ba
- 骨髓直流gydF4y2Ba
- 小额信贷机构gydF4y2Ba
- 平均荧光强度gydF4y2Ba
- PDCgydF4y2Ba
- 血浆直流gydF4y2Ba
- polyI: CgydF4y2Ba
- polyinosinic: polycytidylic酸gydF4y2Ba
- RTgydF4y2Ba
- 室温。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2016年1月12日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2016年4月4日。gydF4y2Ba
- 版权©2016年由美国免疫学家协会有限公司gydF4y2Ba
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