文摘
背景炎症和免疫特异表达的发展是重要的肺动脉高血压(PAH)。引人注目的临床前数据支持治疗的封锁白细胞介素- 6 (il - 6)的信号。
方法我们进行了第二阶段的开放研究静脉叫(8 mg·公斤−1)在组1 PAH患者超过6个月。Co-primary端点安全,定义为不良事件的发生率和严重程度,肺血管阻力的变化。另外,孟德尔随机化研究进行744人11日与欧洲祖先包括2085例特发性/ il - 6受体遗传疾病(IL6R)变体(rs7529229),与循环IL-6R水平。
结果我们招募了29例(男/女10/19;均值±sd54.9±11.4岁)。其中,19个遗传/特发性多环芳烃和10结缔组织疾病有关的多环芳烃。六是之前撤回药品管理局;23个患者接受至少一个剂量的叫。叫了四个病人由于严重不良事件。没有人死亡。尽管证据表明目标参与血浆il - 6和c反应蛋白水平,意向处理和修改意向处理分析证明没有肺血管阻力的变化。炎症标记物并没有预测治疗反应。孟德尔随机不支持领先的效果IL6R变异的风险多环芳烃(或0.99,p = 0.88)。
结论不良事件是叫的符合已知的安全性。叫没有任何一致的治疗效果。
文摘
叫没有阻止il - 6在肺动脉高血压信号。多中心孟德尔随机化研究还没有证明的证据IL-6R肺动脉高血压。https://bit.ly/3xkDxS5
介绍
肺动脉高压(PAH)是一种罕见的,常常是致命的疾病的特点是深刻的改造小肺动脉导致增加肺血管阻力(PVR)和右心衰[1]。尽管现有的治疗,死亡率仍然很高,是一个重大的未满足的医疗需要确定新疗法。兴趣主要集中在PAH协会提供免疫力,感染和炎症(2]。自身免疫性疾病病因在PAH,通常硬皮病和系统性红斑狼疮(SLE)。此外,炎症/艾滋病毒感染和血吸虫病等感染过程与多环芳烃(3]。特发性和遗传形式的多环芳烃也与自身免疫性甲状腺疾病和人类白细胞抗原亚型,与自身抗体的存在在多达93%的病人(4]。事实上,它已经提出,特发性多环芳烃可能是一种自身免疫性疾病(2]。
在多环芳烃的肺血管病变,有炎症细胞的积累,包括T -淋巴细胞和调节T细胞功能改变(5和b细胞基因表达的变化6]。然而,目前尚不清楚是否这些发现引起疾病的结果,如。由于暴露在新抗原内皮损伤的结果。一个核心作用的途径,并有很强的临床前证据PAH是白细胞介素- 6 (il - 6)的途径。在外周血il - 6水平持续升高,肺内PAH患者(7]。il - 6是一个独立的预后的标志,优于传统标记如PVR和n端pro-brain利钠肽(中位数水平以上病人)8]。增加血浆il - 6水平,与il - 6受体(IL-6R)风险等位基因在结缔组织病(ctd)导致肺动脉高压,如类风湿性关节炎(RA) (9]。转基因超表达的il - 6在动物模型中促进肺动脉高压(10];相反,IL-6-deficient老鼠不受低氧诱导肺动脉高压(11]。政府重组il - 6的老鼠也概括PAH表型(12]。
叫是一个IL-6R拮抗剂建立安全有效,主要在RA (13),并承诺在硬皮病(14]。IL-6R对抗减弱小鼠多环芳烃和最近的数据表明,异位il - 6信号直接驱动动物模型血管变化(15]。抑制il - 6的理由信号直接延伸到il - 6对血管重塑的影响除了免疫调节。孤立的案例报告建议回归系统性红斑狼疮相关的多环芳烃在叫,混合CTD和Castleman病(16,17]。
我们进行了第二阶段非盲单臂概念验证研究多环芳烃的叫。在平行,我们进行了孟德尔随机病例对照研究(先生)使用一个单核苷酸多态性(SNP) (rs7529229) IL-6R来推断IL-6R水平和风险之间的因果关系在多环芳烃。这个SNP标记蛋白质数量性状位点循环IL-6R和包括连锁不平衡,非同义变体(rs8192284)增加可溶性蛋白水解乳沟的IL-6R从其膜结合的形式18]。
方法
研究设计和参与者
患者在8个中心在英国(补充材料单组研究非盲。研究(TRANSFORM-UK多NCT02676947)[19)是由当地研究伦理委员会批准(莱斯特中央15 / EM / 0401)。
18 - 70岁患者稳定的治疗与诊断组1多环芳烃为:具体来说,特发性或遗传的多环芳烃和多环芳烃CTD不包括系统性红斑狼疮、类风湿性关节炎和混合CTD。排除标准选择科目包括持续静脉注射(注射。内皮)或皮下输液,活跃的感染,外周血血小板< 100×109细胞·L−1,中性粒细胞计数< 2×109细胞·L−1,同时用生物制剂治疗冠状动脉和左心脏病的证据,肺活量≤60%的预测,用力呼气量在1 s≤60%的预测的6分钟步行试验的测试(6 mwt)和一个距离< 100(完整包含/排除标准中可以找到补充材料)。所有参与者提供书面知情同意。
程序
参与者被给出注射。叫月(8 mg·公斤−1;罗氏制药)6个月第一天,星期4,8、12、16和20(6支)。病人参加每月的注入和安全数据收集。恶化的发生多环芳烃的定义是这样的,以下三个:减少至少15%的6 mwt距离基线;需要额外的治疗多环芳烃;和PAH的恶化症状,包括至少一个基线的改变到一个更高的世界卫生组织(世卫组织)功能类和出现或恶化的迹象,右心衰对口服利尿治疗。外周血年底审判基准和抽样进行研究。血液流仪评价白细胞子集所提取的RNA序列(RNAseq)和血清炎症介质(c反应蛋白(CRP)、IL-1βil - 6,引发和肿瘤坏死factor-α(TNF-α))(补充图S1)。血液收集柠檬酸磷酸葡萄糖后抽样30分钟内腺嘌呤和加工转移到淋巴细胞分离管(EZ Lympho-Sep),这是离心机按照制造商的说明书。红色细胞裂解后一步,外周血单核细胞分离,在PBS resuspended EDTA + 2毫米,存储在一夜之间−80°C和转移到液氮。在Fortessa Immunophenotyping进行流式细胞分析仪(BD生物科学)。优化的组合主要抗体开发基于这些人类Immunophenotyping财团提出的(20.]。至少1×106为每个分析物事件收集。血也处理的细胞因子测定血清分离器管和颞部血液RNA管(3毫升的血液/管,热费希尔科学)。样本储存在−80°C,直到完成试验。细胞因子是措施使用规模内消旋从血清样本发现VPLEX multispot试验平台内消旋部门S600分析器(MSD)。样本制备和分析按照制造商的说明书(MSD人类促炎面板1 - K15049D)。进行RNA提取使用颞部旋转RNA隔离设备(热费希尔科学),包括可选DNase治疗步骤使用AbsoluteRNA清洗液(热费希尔科学)按照制造商的协议。提取RNA是集中使用RNeasy Minelute列(试剂盒)和筛选了在最后一卷14μL球蛋白mRNA耗尽之前使用GLOBINclear(热费希尔科学)。最后洗脱globin-depleted RNA在30μL RNase-free水。收益率和RNA完整性得分(RIN)的样品决定使用真核细胞总RNA纳米芯片工具包(安捷伦科技)和运行在一个安捷伦2100生物分析仪(安捷伦科技);RIN数字计算使用2100专家软件(安捷伦科技)。 Libraries for cDNA were prepared with the TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina), which generates Poly-A-enriched strand-specific libraries. 1 μg of high-quality RNA was inputted and all protocols were performed following the manufacturer's instructions. Completed libraries were assessed by DNA 1000 Chip (Agilent Biotechnologies) on an Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Biotechnologies) before normalisation and pooling. Pooled indexed libraries were submitted at 10 nM and sequencing was performed on a HiSeq4000 instrument (Illumina) using a single-end 50 bp run. Gene set analyses were run through cpdb.molgen.mpg.de gene set enrichment database.
结果
co-primary终端的安全性和有效性,分别判断发生的不良事件和严重不良事件分类的医学词典监管活动(MedDRA), PVR和变化(PVRΔ)作为衡量入侵血液动力学的评估通过一个充满液体的心脏导管使用心输出量测量使用前文所述的热稀释法技术按标准技术(21]。二级安全及探索性疗效端点包括6 mwt距离根据美国胸科学会指南,Borg呼吸困难量表,中位数水平以上病人,功能类评估,剑桥肺动脉高压结果审查(樟脑)评估,分析流仪外周血白细胞immunophenotyping和血清和血浆循环细胞因子的测量IL-1β,il - 6,引发和TNF-α。一个完整的描述的研究计划包括在补充材料。事后描述性统计的二次端点和疾病亚型中预先确定统计分析计划。
统计分析
样本大小(n)动力检测PVR治疗6个月后减少30%与90%的力量和5%的统计显著性n = 17日占一个保守的退出率;招聘的最低目标是n = 21日发表(19]。我们提出的数据修改意图治疗(手套),定义为一组的患者至少有一个剂量的叫和至少一个post-baseline结果,和意向性治疗(ITT)分析灵敏度分析,即。评估潜在的偏见和检查它的存在没有不同于手套。估计的治疗反应率和相关的置信区间(或可信区间和后验概率)报道。例外是魏克森讯号等级进行测试,协议中定义的PVR褶皱变化文献[19]。一个额外的贝叶斯分析,被认为是更多的信息叫PVR的治疗反应,使用一个预先确定expert-elicited之前。任何预测影响二次报告结果的置信区间。这里所有的分析报告进行使用r项目(3.3.3版本;www.r-project.org)。主成分(PC) RNAseq数据集的分析,t检验与Benjamini-Hochberg过程/错误发现率(罗斯福)和惩罚回归模型(套索)使用所有immunophenotyping变量(细胞因子、流量仪子集和RNAseq)预测和评估响应表现最好的可预测性交叉验证使用r项目都进行,kaplan meier情节。
孟德尔随机
协会的基因变异IL6R、rs7529229 IL-6R水平循环的测试在欧洲特发性患者/遗传多环芳烃在哈默史密斯医院招募,伦敦,英国。通过全基因组测序的基因进行全国卫生研究所生物研究罕见疾病(NIHRBR) [22,23]。通过aptamer-based蛋白质测量进行蛋白质组学(24]。相加模型的分析是使用自然logarithmic-transformed水平循环IL-6R residualisation紧随其后的采样、年龄性别和人口结构(PC1-4)使用SNPTEST [25]。IL-6R蛋白水平协会估计rs7529229特发性患者/遗传多环芳烃是meta-analysed估计两个欧洲人群为基础的研究,应用相媲美的方法(26,27),使用一个逆加权方差固定后果分析(28]。两个示例分析进行meta-analysed先生估计IL6Rrs7529229和积累基因数据来自国际财团在四个特发性/遗传PAH-control比较[23]。因果效应及其标准误差估计使用瓦尔德比中实现MR-Base [29日]。rs7529229病例对照研究中不叫的时候,我们使用一个代理,rs4537545高连锁不平衡(r2= 0.99在欧洲人,运行通过ldlink.nci.nih.gov)。
生存分析
协会的基因变异IL6Rrs7529229,特发性/遗传PAH患者的全因死亡率NIHRBR研究用于kaplan meier分析。生存分析是left-truncated时间之间的PAH基因分型结果和抽样的诊断。
结果
29例(男性/女性的10/19;均值±sd54.9±11.4岁)招募了2016年1月至2017年4月。其中,15例特发性PAH,十有CTD-associated PAH(九硬皮病,一个干燥的多环芳烃)和四个遗传多环芳烃(表1)。六个病人之前撤回药品管理局;一个由于胸部感染,由于共病疾病的恶化和四个基线对核心catheterisation由于不和谐的结果与过去之前的血液动力学的参数,而临床医生判断无机窝疾病每项标准。总共23个患者接受研究药物(图1)。
药物停止在一个额外的四个病人由于严重不良事件(图1):一个尿脓毒病,一个胸部疼痛,一个外周动脉栓子和一个可疑的临床恶化事件并没有实现预先确定协议标准临床恶化事件对独立审判。发生在一个病人呕吐,被列为怀疑意想不到的严重不良反应。没有人死亡。最常见的不良事件是鼻咽炎(图2)。不良事件是分级轻微(80.0%)、中等(16.6%)和严重(3.4%)。
总的来说,叫PVR导致无显著变化从基线治疗6个月后ITT或手套分析(图3一b)。先天的分析PVR分层的病因学,四个六CTD-associated PAH患者接受研究药物在PVR减少> 15%与三个13特发性或遗传PAH患者(图3 c)。
贝叶斯分析导致相同的结论频率论的分析(图3 b)。前expert-elicited结合产生后的观测数据的概率密度研究药物实现PVR的变化至少−30%。研究药物成功的后验概率< 1%。
探索性次要终点分析一致的主要终点,没有二次端点数据明显支持治疗效果(表2)。增加了均值±6 mwt距离sd19.1±60.8 m,中位数水平以上病人增加了平均22.5 pg·毫升−1(差275 pg·毫升−1)和樟脑下降值2 (IQR 10)。功能类改变了六个病人,提高在两个四个病人和恶化。
符合有效抑制il - 6信号,叫暴露增加血浆il - 6的中位数9.5 pg·毫升−1(差7.3 pg·毫升−1)和c反应蛋白减少了平均1.2 mg·L−1(差2.2 mg·L−1)(表2和补充图S1)。等离子体水平的IL-1β,引发和TNF-α没有改变(补充图S1)。此外,immunophenotyping外周血细胞没有任何明显的B -或t细胞数量的变化(补充图S2)。在RNAseq分析没有明显的单一基因表达变化修正后为多个比较叫。网络分析的基因集代表和本体论分析表明免疫介导的变化过程(补充表S1)。丰富蛋白质complex-based集也主要由信号与T -和B-cell-mediated免疫力,尤其是b细胞受体(补充表S2)。
电脑分析RNAseq基因表达和表达变化没有歧视CTD-associated PAH或潜在反应组(t, Benjamini-Hochberg过程与罗斯福< 0.1)(补充图S3)。总的来说,没有一个immunophenotyping预测数据与治疗反应或反应者从无单独或使用综合造型。符合治疗对基因表达的影响,在PC有温和的证据表明,预处理和后处理分析分类可以在两个维度的基础上分化前两个人电脑(孔雀测试,p = 0.033)。在惩罚使用所有immunophenotyping变量回归模型(套索)预测和评估的可预测性响应,模型表现最好在交叉验证没有包含在变量预测模型(补充图S4)。因此,没有额外的增值分析,利用所有的炎症数据集,也没有炎症标记物预测治疗反应单独或组合造型。
在关联分析中,每个小等位基因,“C”,在循环IL-6R rs7529229与增加124年特发性或遗传PAH患者(效应估计0.27±0.03,p = 2.69×10−16,图4 c)。荟萃分析包括这些PAH患者和一个额外的4299人来自两个以人群为基础的群组显示整体效果估计为0.81±0.01 C等位基因(或2.1,p < 1×10−300),但没有trans-acting轨迹与循环IL-6R (图4一b),显示无显著rs7529229 PAH的风险我们协会汇集分析2085例特发性或遗传的多环芳烃和9659名对照(或0.99,95%可信区间0.9 - -1.09,p = 0.88,图4 e)。此外,基因型IL6RSNP rs7529229无关的全因死亡率NIHRBR研究队列(图4 d)。
讨论
一概念验证非盲临床试验证明没有叫流行组1中多环芳烃的重要影响。这是尽管证据表明药物导致预期目标接触生物标志物的变化:增加il - 6和降低CRP水平。此外,B和t细胞激活通路在RNAseq分析本体顶部支安打。可能是稳定的普遍患者招募本研究不太可能有活跃的炎症,虽然il - 6和c反应蛋白水平测量符合先前的报道(8]。
缺乏有效性的试验似乎与广泛的临床前数据细胞和动物模型的il - 6的重要潜在的因果作用。有很多的解释。炎症可能是血管损伤反应,而不是一个因素在人类的多环芳烃,先生尽管在研究中我们没有看到一个与疾病关联课程基于死亡率。值得注意的是,在多环芳烃组的il - 6水平倾斜的非正态分布和大多数患者没有明显较高(8]。这就提出了一个可能性,疾病是由炎症只在病人的一个子集,或有炎症活动的耀斑的病人。自身免疫性分层的三期临床试验的荟萃分析il - 6展示令人失望的相关性的临床反应(30.不推荐),这种方法在任何当前适应症的il - 6受体拮抗。我们计划sub-analyses使用广泛的炎症标记物的反应,包括il - 6,再次建议,患者il - 6水平就不会额外的价值。我们注意,在原始报告,il - 6水平几乎是两倍报道这里(8]。虽然没有审判强烈建议分层il - 6在其他疾病,这可能反映了随机抽样偏差,靶向治疗的影响,不同的化验或要求稳定的疾病,可以设定负选择对患者积极炎症。
CTD-associated PAH排除特定的进入标准,不太常见的自身免疫性与RA患者团体,系统性红斑狼疮和混合CTD。排斥的原因包括这些病人已经接受免疫抑制和不觉得合适从安全的角度来看的第一次审判免疫抑制包括子集的病人在多个疗法。此外,这将导致更大的异质性在病人队列。尽管如此,有减少PVR的四个六CTD-associated PAH患者。免疫抑制广泛用于连续油管的上下文,但目前对关联的多环芳烃的影响还没有被研究在随机对照试验。本文提供的有限的数据基础上,优先考虑未来可能是明智的试验CTD-associated PAH的免疫抑制。这将是复杂的异构本质患者人群和免疫抑制药物的使用在一些病人发病前多环芳烃。这些试验需要考虑混合人口疾病和免疫抑制药物的混合背景。
潜在的限制我们的实验研究这个小尺寸和开放性的设计。此外,它可能在PVR免疫抑制的影响,如果存在,可能需要超过6个月。先前的荟萃分析表明,PVR不是placebo-responsive端点(19]。这是由我们的试验结果。在以前的类似的试验持续时间,PVR更有可能恶化在安慰剂武器和因此可能我们错过了一个活跃的药物和安慰剂之间的区别,我们包括一个。然而,这种差异会根据定义小和有限的临床效用的额外风险患者暴露于免疫抑制。
这是第一次在PAH基因数据被用于串联试验药物目标有效性结合早期行/不行investigator-led临床试验。我们协会的分析结果证实,与循环IL-6R rs7529229 associates的水平,如预期。然而,没有明显关联,变异和多环芳烃的存在与否,提供额外的证据表明,il - 6的调制信号可能不是大多数PAH患者的利益。如果利用基因数据的方法在评估治疗势头加快,可能信号仪/硬皮病可能是由现有的荟萃分析数据在硬皮病不存在分层的多环芳烃,STAT3成为一个风险位点31日]。这种方法将是一个潜在的有用的补充药物开发的工具包。耦合快速和统计上有效的试验设计,研究是可行的,即使在罕见的疾病,在合作国际遗传学财团正在开放获取基因组数据现实数字足够健壮测试假说。188滚球软件我们承认先生荟萃分析没有动力去接小的影响,这仍不能排除。
总之,治疗叫PAH是可行的,但证明没有显著影响血液动力学的参数或探索性二级终端在遗传或特发性多环芳烃。先生研究符合这些结果。指出潜在的改善患者的小群CTD-associated PAH,这需要进一步调查。未来试验免疫调节在PAH需要考虑是否endotyping和分层的患者在疾病过程中可能是值得的。
补充材料
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确认
一个完整的合作者是包含在列表补充材料。
脚注
TRANSFORM-UK,多NCT02676947。个人去除了识别信息的主要和次要终点数据将提供一个数据字典。研究方案和统计分析计划公开发表。数据将被用于出版。数据将被托管在剑桥大学开放获取存储库。188滚球软件
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支持声明:这项工作是由来自英国国家健康研究所资助剑桥生物医学研究中心和罕见疾病转化研究合作,除了一种无限制的补助金从罗氏产品有限,韦林花园城,英国。TRANSFORM-UK,多NCT02676947。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2020年6月23日。
- 接受2021年7月15日。
- 版权©2022年作者。
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