文摘
纤维化可以影响任何器官,导致组织结构和功能的损失往往危及生命的后果。病理、肝纤维化的特点是结缔组织的扩张由于细胞外基质(ECM)过度沉积蛋白质,包括纤维形式的胶原蛋白。发现治疗肝纤维化的重要的限制是合适的人体模型的可用性和技术来量化成熟纤维胶原沉积尽可能接近人类生理条件。
这里我们有广泛的特征体外培养的人类肺tissue-derived展示肺片(hPCLS)模型使用label-free二次谐波发生(宋惠乔)光学显微镜量化纤维胶原蛋白沉积和大规模spectrometry-based技术来获得一个蛋白质组和代谢组的hPCLS指纹体外文化。
我们证明hPCLS是可行的和新陈代谢活跃,间叶细胞、上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞存活至少2周体外文化。分析hPCLS-conditioned浮层显示一个强烈诱导肺fibrosis-related ECM蛋白质转换增长factor-β1 (TGF-β1)刺激。这个upregulation ECM的蛋白质不是翻译成纤维胶原沉积增加。支持这一观点,我们发现pro-ECM退化活动在我们的存在体外文化hPCLS,抑制金属蛋白酶抑制剂导致的在TGF-β1刺激胶原沉积增加。
的数据显示,一个集成的方法测量可溶性pro-fibrotic标记与定量SHG-based纤维胶原蛋白是一个有价值的工具,用于分析研究pro-fibrotic信号和测试anti-fibrotic代理。
文摘
Multiomic和label-free成像进行描述的体外培养人类展示肺片(hPCLS)显示MMP的信号是一个病原因素所需的纤维胶原沉积ECM hPCLShttps://bit.ly/3rcUa0e
介绍
的细胞外基质(ECM)过度沉积蛋白质是纤维化的一个特点。它改变了组织架构,并且导致功能丧失,最终,终末期器官衰竭(1]。在发达国家,45%的死亡是由于过多的ECM沉积相关条件(2]。纤维化导致加剧了病理学在癌症、心肌梗死和老龄化,这也是一个主要原因的死亡率在肾脏纤维化疾病,尤其是肝脏和肺(3]。慢性间质性肺疾病(ILDs)是最常见的肺纤维化(4]。ILDs分为300多个亚型,其中特发性肺纤维化(IPF)是最普遍的4]。各器官上皮和内皮细胞受损,启动炎症反应,这引发血栓形成和ECM修复。这部分修复机制是细胞因子的释放等转变增长factor-β1 (TGF-β1)启动激活的巨噬细胞和成纤维细胞3]。激活成纤维细胞表达α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA),导致其分化myofibroblasts [3]。持续慢性炎症触发不myofibroblasts扩散,增加epithelial-to-mesenchymal过渡(EMT) [3]。间叶细胞的细胞有一个增强的能力ECM组件,和这些事件的组合结果脱轨的组织修复过程中导致疤痕组织(3]。TGF-β1被认为是主调节器的信号通路(pro-fibrotic)导致异常过度沉积ECM (5]。pro-fibrotic信号的感应也变化之间的微妙的平衡胶原蛋白和其他ECM的合成和分解蛋白质(6)的过度沉积和病理加劲的ECM组织合规的损失。这种过度沉积和刚度ECM导致物理异常导致肺泡组织萎缩(3)和随后的窒息(呼吸困难)。在IPF患者纤维化病灶的特点是纤维胶原蛋白的异常高内容(I型、III和V) (3,7]。在ECM的层面上,这些纤维胶原的物理原因是最终死亡率(8]。尽管我们对纤维化的分子基础的底层理解过程,迄今为止只有两个许可的药物、pirfenidone和nintedanib [9),已经批准了IPF的治疗。这些药物疗效和非常低,因此,病人退出率高(10]。缺乏更有效的anti-fibrotic疗法可能部分归因于缺乏足够的模型系统,可以模拟纤维化的病理生理学过程相关的人体生理学(11),间接功能性生物标志物用于量化疾病进展的读数。目前,小鼠实验模型的纤维化经常用于研究肺、肝脏和肾脏纤维化。通常,肺纤维化是诱导使用遗传操作如overexpressing粘蛋白5 b (MUC5b),遗传危险因素中确定大群IPF患者(12),或化学感应(硫酸博来霉素、胺碘酮、四氯化碳)[13]。这些模型系统有助于阐明急性前组织损伤和信号通路,在某些情况下,化学物质,如硫酸博来霉素可以作为病原体(14];然而,在活的有机体内人类疾病模型缺乏组织学特征和可以自发地解决,因此他们无法概括不可逆终末期疾病。这些模型系统突出了炎症组件呈现在纤维化疾病的发展,然而消炎药没有在临床开发(15,16]。基于这些发现,治疗方法包括糖皮质激素(强的松)有或没有免疫抑制药物(硫唑嘌呤、环磷酰胺)已经被用来治疗IPF。事实上,一些药物有副作用,病人病情恶化15,16]。
人类展示肺片(hPCLS)三维(3 d),均匀切割片肺组织中维护体外文化。他们已经成为一种很有前途的模型系统研究人类疾病在体外。使用pcl(鼠肺和人类)在1990年代初首次报道(17,18]但他们最近才被用作模型评估人类疾病病理生理学(11,19]。几组使用这个模型系统概括pro-fibrotic信号(11,19,20.]。最近,一位kram等。(21)上皮细胞在小鼠pcl的动力学研究。然而,整个分子的变化和变化的分子途径体外人类文化pcl仍然是难以捉摸的。早期的研究(11,19)在纤维化信号显示感应,但增强的功能性读出ECM沉积一直缺乏。此外,细胞的纤维化是否如上皮、间叶细胞和免疫细胞类型(3)模型系统中没有被调查。虽然一般认为信息和cell-matrix交互在hPCLS[保存完好21),没有进行系统的研究来评估这种假设。
ELISA-based测量可以用来量化的乳沟产品胶原蛋白前肽,如I型、三世和VI胶原蛋白,因为他们被分离在形成。这些乳沟产品提供信息纤维化疾病进展(22]。虽然他们可能是疾病生物标志物,过剩的相关沉积仍未建立。微观检测纤维胶原蛋白也困难,由于缺乏特定的抗体。然而,label-free二次谐波发生(宋惠乔)成像纤维胶原蛋白是一个很好的替代方法为量化纤维胶原蛋白在组织切片23]。
在这项研究中,我们使用质谱(MS)和轻型microscopy-based方法首先调查和描述四个主要类型的细胞蛋白表达的变化出现在肺组织当hPCLS体外讲究的。其次,探讨pro-fibrotic TGF-β1引起的信号刺激,我们建立了一个新的定量,label-free宋惠乔成像方法,量化纤维胶原蛋白沉积在ECM pro-fibrotic刺激。我们提出,这个模型代表一个多功能人工平移模型系统,可以用于识别和描述anti-fibrotic代理。
材料和方法
肺切除供应和执照
所有的hPCLS讲究的体外来自肺组织切除从发表地区捐助者(26)。捐赠者人口,包括年龄、性别、吸烟状况、主要临床诊断和实验中使用的组织,列出表1。发表组织取得的肺癌患者肺组织切除术病人从Thoraxklinik-Heidelberg匿名身份。选择的发表组织病理学家在组织切除。病人同意和使用的组织得到的研究伦理委员会(海德堡大学医学院)S-270/2001审批的参考号码。此外,hPCLS ILD产生肺组织肺实质的获得接受肺移植的患者终末期疾病研究所的移植,英国纽卡斯尔医院(五个肺移植受者;细节表1)。纤维化病灶在加工过程中不可见;因此,它是不可能说个人片为每个捐赠者生成包含纤维化病灶。病人同意和使用ILD组织批准的国家科研伦理服务(11 /不/ 0291)和英国卫生研究的权威。人类道德的生物样本和他们的研究使用符合知情同意的条款下一个制度审查委员会/伦理委员会批准了协议。
pcl准备和体外文化
整个工作流本研究随访总结图1。Non-ILD和ILD hPCLS准备如前所述[24,25]。简单地说,当天组织切除样本收到了(天0),肺组织膨胀了3%低熔点琼脂糖(σ# A9414)准备在phenol-free DMEM (Gibco # 41965 - 039)。接下来,8毫米核准备和250 -μm厚片生成使用Krumdieck组织切片机(谢霆锋系统,坏的小礼帽,德国)。促进经济复苏后,切片过程中,组织中补充了青霉素,链霉素,二性霉素b和10% FCS第一18 h体外文化。经过18 h(第一天),然后每72 h到13天,媒体(±刺激)补充。格林尼细胞文化品位塑料24-well盘子(# 353226)被用来hPCLS文化。0天中另外补充10% FCS (Gibco # 10270106)。hPCLS处理10 ng·毫升−1重组体人TGF-β1蛋白质(研发系统# 240 - b - 010)和25µM(750年µL DMEM)的基质金属蛋白酶(MMP)抑制剂(明尼苏达)(默克# CC1010)。生活/死染色进行了使用calcein-AM / ethidium为工具包(ThermoFisher # L3224)按照供应商的建议。hPCLS孵化在推荐的生活/死试剂浓度生活共焦显微镜前45分钟。hPCLS总是培养的penicillin-streptomycin (Gibco # 15140122)和两性霉素B (Gibco # 15290026)。
ELISA测量
可溶性ECM片段(原骨胶原1氨基端前肽(PRO-C1),纤连蛋白c端部分的(FBN-C)和III型胶原降解标记(C3M))测定在媒体上上层清液通过竞争(ELISA)检测由北欧生物科学开发和验证/ S (Herlev、丹麦)根据制造商的指示26- - - - - -28]。测量值低于检出限的测定被分配的下限检测。
女士样品制备和分析
蛋白质组学
短暂,hPCLS洗PBS和收获在液氮中使用临时冻结。解冻后,样本(2 hPCLS /技术复制)在300年解散SDS-HμL 2%2O(蛋白酶和磷酸酶抑制剂)在室温下2 h。然后他们被机械地使用珠ruptor单一化(泛光灯国际# 19 - 040)。在液相色谱串联女士(质/ MS)分析、蛋白质浓度测定(皮尔斯660海里工具包# 22660)。样品中水溶性2×SDS样品缓冲和短SDS凝胶电泳。质/ MS分析样本进一步处理。
sds - page凝胶Coomassie彩色。凝胶车道被切成三片覆盖整个范围(∼2厘米)和分离受到凝固态胰蛋白酶的消化(29日]。肽被贴上标签通过等压质量标签(TMT10;热费希尔科学)。T太labelling was performed using the 10-plex TMT reagents, enabling relative quantification of 10 conditions in a single experiment [30.]。短暂,标签的反应是在40毫米triethylammonium碳酸氢盐,pH值8.53 22°C,并与甘氨酸淬火。标签肽提取物被组合到一个每个实验样本。Lyophilised样本re-suspended在水和氨1.25%受到质/女士(30.]。
肽和蛋白质识别
吉祥物2.4(美国矩阵科学,波士顿,MA)被用于蛋白质识别使用10 ppm质量对肽前体和20 mD的高能碰撞离解(HCD)质量对碎片离子。搜索数据库由一个定制版的国际蛋白质指数蛋白质序列数据库结合诱饵的版本由MatrixScience使用创建的数据库脚本。
记者从原始数据和读取了离子强度乘以离子积累乘以(女士)收益率衡量离子的数量成正比;这种方法被称为离子区(31日]。光谱匹配肽是过滤根据以下标准:吉祥物离子得分> 15日signal-to-background前体离子> 4和信号干扰> 0.5 (31日]。褶皱变化修正了同位素纯度和调整所述干扰引起的co-eluting近等压峰值估计的信号干扰测量(31日]。蛋白质定量是源自个人光谱匹配不同的肽使用sum-based引导算法;对所有蛋白质折叠计算95%置信区间变化,量化了三个多光谱(31日]。
代谢组学
hPCLS snap-frozen在收获的日子。在样品制备,两个hPCLS每简要冲洗技术复制75毫米碳酸氢铵(pH值7.4)和机械单一化MS-grade H2O提取代谢物。如前所述(执行的诸多代谢组学分析32]。短暂,样本分析液体相色谱分析-质谱法(LC / MS)平台组成的热科学最终3000 LC系统autosampler温度设为10°C耦合热科学Q-Exactive +傅里叶变换配备了加热电喷雾离子源和女士在消极的电离作用模式。权力平等主义的流量是150μL·分钟−1的流动相组成的60:40% (v / v)异丙醇:水与1毫米氟化铵缓冲pH值9和包含10牛磺胆酸和20 nM homotaurine锁的质量。质谱记录剖面模式从50到1000 m·z−1用下面的仪器设置:鞘气体,35 a.u。;辅助气体,10 a.u。;辅助气体加热器,200°C;尾气,1 a.u。;喷涂电压、−3 kV;毛细管温度、250°C;S-lens无线电频率水平,50 a.u。;分辨率,70 k 200米·z−1;自动增益控制目标,3×106离子,最大注射时间120毫秒;收购期间,60年代。光谱数据处理在R(使用一个自动执行管道www.r-project.org)如前所述32]。发现离子被暂时注释为代谢物基于匹配精确的公差内的质量5使用人类代谢组mDa数据库(33]。
数据分析
蛋白质组学
R编程语言(www.r-project.org)是用来处理蛋白质IsobarQuant的输出文件。只有蛋白质与至少两个独特的肽和量化,量化在所有实验被用于进一步分析。“sumionarea蛋白质”列标注不同的实验条件。然后,使用limma包(批量删除潜在影响34),结果是正常使用vsn包[35]。Limma也用来测试对差异表达的蛋白质。一种蛋白质被认为是显著的双重差异和错误发现率< 5%。所有重要的蛋白质聚集(使用病房层次聚类。d2方法)基于欧几里得距离log2比率对各自的控制。
网络分析使用Cytoscape
网络分析是使用开源软件平台Cytoscape [36]。简而言之,基因显著监管(log2褶皱变化(FC)≥0.58或≤0.58和调整假定值≤0.05)策划,进行路径分析。图表绘制使用内部R脚本。
肺细胞基因表达分析分析
的主要细胞类型的基因列表从“LungSortedCells”下载工具在肺癌基因表达分析(LGEA)数据库。这里,RNA-sequencing (RNA-seq)数据属于类别的定义为“成人”被用作参考。这些数据生成RNA-seq排序后细胞按以下标记:CD45+免疫细胞,CD45−/ PECAM−/ VECadherin−/ EpCAM+上皮细胞混合,CD45−/ PECAM+/ VECadherin+内皮细胞和CD45混合−/ PECAM−/ VECadherin−/ EpCAM−混合间充质细胞。
常用的肺程控标记的内容管理是使用LGEA工具箱功能。这里,LungGENS人类RNA-seq数据分类下“Human-Dropseq-PND1”作为参考。
宋惠乔成像和样品制备
收获的日子,媒介上层清液吸气从每个包含hPCLS好。hPCLS洗了PBS(3×1毫升)和固定在1毫升的4%多聚甲醛(PFA)(电子显微镜服务;他们年级# 5710)一夜之间在4°C。随后,hPCLS洗了PBS(3×1毫升)。其次,每位PFA-fixed hPCLS被转移到一个24-well板玻璃底部(他一一Bio-One国际SensoPlate # 662892)。hPCLS满是150µL PBS和按下底部使用一个圆形玻璃盖片和塑料环EMBL的车间(本地)。接下来,每个被进一步覆盖着300µL PBS避免hPCLS干燥(图像采集期间由于PBS蒸发)。
现场成像实验,空间之间的墙壁,hPCLS充满了一层薄薄的5%低熔点琼脂糖,防止运动中随时间的变化所引起的体外文化。
宋惠乔成像进行hPCLS蔡司NLO LSM780显微镜配有脉冲多光子激光。hPCLS很兴奋的双光子波长880 nm×20(0.8数值孔径)空中目标和×25(0.8数值孔径)水目标成像PFA-fixed和生活hPCLS,分别。150 - 180年µm-deep z-stacks收购了一个正方形瓷砖(8×8毫米)扫描。双光子激发信号来自hPCLS被捕获在三个不同的渠道:宋惠乔向后、向前宋惠乔和双光子激发自体荧光(2豌豆)。前锋宋惠乔信号被用激光阻塞过滤和436/20 nm的带通滤波器。向后宋惠乔信号记录使用内部探测器的带宽435 - 455 nm。2豌豆中检测出550 - 650 nm的带宽。
Calcein-AM / ethidium homodimer-1成像和ATP-Glo化验
生活/死可行性/细胞毒性工具包(ThermoFisher # L3224)是用于calcein-AM / ethidium homodimer-1成像。成像,那天住hPCLS第一次洗1×phenol-free DMEM然后孵化(45分钟到1小时)500µL 1µM和2µM工作解决calcein-AM和ethidium homodimer-1,分别(37°C, 5%有限公司2)。染色、生活hPCLS被转移到一个35毫米MatTek盘中心的玻璃盖玻片(# d35 - 10 - 1.5 - n)。hPCLS通常是20 - 25分钟拍摄在一个潮湿MatTek室100µL phenol-free DMEM(σ# D2902) hPCLS覆盖。在成像后,hPCLS被丢弃。在成像,随后天新hPCLS染色和成像。CellTiter-Glo发光测定(Promega # G7570)是用来测量ATP水平后,制造商的协议。简单地说,一个hPCLS单一化使用250年珠ruptorµL CellTiter-Glo试剂和每个hPCLS溶解产物在96 -孔板测量一式三份(50µL一式三份的hPCLS溶解产物)。总共四个hPCLS每个捐赠者进行分析。
ELISA和宋惠乔成像数据的统计分析
一般来说,所有的数据是正常的平均值hPCLS测量(每个捐赠者)在各自的控制(根据实验定义)。首先,SHGintensity的原始值(iSHG)从不同的刺激或疾病条件log2转换(Log2iSHG)和平均iSHG如果hPCLS计算和log2转变(Log2iSHGc)。接下来,日志褶皱变化计算Log2SHGi = Log2iSHG−Log2iSHGc每片各自的捐献者。在全球正常化,每个hPCLS正常化的Log2iSHG的Log2iSHGc如果hPCLS在各自的刺激或条件。双向方差分析与图基的多个测试进行比较来确定的意义之间的差异比较。两个因素选择的是1)捐赠者捐赠的数量差异片和2)各自的治疗或疾病状态。Shapiro-Wilk正常测试是用于确认数据正常。
宋惠乔图像分析
图像分析组成的z-stacks宋惠乔通道(前后)和2豌豆进行分析使用半自动斐济(37)管道定义为Jython脚本(补充材料)。简而言之,所有的通道都阈值和该地区或像素低于阈值的数量(PBT)为每个通道数。PBT的综合强度也计算为每个通道(Sumintensity)。测量总胶原蛋白的纤维含量,前后的PBT Sumintensity宋惠乔信号总结和称为总胶原蛋白的纤维含量。一笔的最大向前和向后宋惠乔预测(二维)创建图像,这幅图像分为8×8同样大小的感兴趣的区域(roi)。每个ROI手动分类为间质胶原蛋白或non-interstitial胶原蛋白。只有roi的间质胶原蛋白是平均每hPCLS宋惠乔形象。每个实验都有如果和治疗hPCLS宋惠乔图像。总胶原蛋白含量的Sumintensity像素·ROI−1是正常的平均宋惠乔信号如果所有roi的(平均)hPCLS各自的捐赠者。为每个hPCLS宋惠乔堆栈至少20 roi分析。
斐济代码间质和non-interstitial ROI的选择
一步一步文档的代码和代码本身可以作为压缩zip文件(补充材料)。
结果
蛋白质组学描述分子hPCLS随时间变化的体外培养条件
使用hPCLS时,在这种情况下,来自从non-ILD组织切除的病人,模仿某种疾病涉及某些细胞类型和信号通路,必须描述的模型系统体外文化条件。为此,我们使用MS-based蛋白质组学和没有针对性代谢组学监控hPCLS蛋白质组和代谢组随着时间的推移体外文化。体外培养hPCLS(四个捐助者,两个复制每捐赠,每复制两个hPCLS)收获在不同天(天1、4、7、10、13文化)和snap-frozen液氮。随后,溶解产物准备MS-based蛋白质组学和代谢组学分析。蛋白质组学分析,2% SDS可溶性的分数hPCLS受到LC / MS分析。在四个捐助者发现了大约5500个蛋白质测试,其中4288蛋白质共同之处(补充表S1)。这些蛋白质可以归因于不同的细胞本地化信息角度使用基因本体论(去)数据库(38]。蛋白质的比例每走项计算相对于整个去项独立的表达在人类的肺部组织。这里,3648蛋白质(蛋白质31.75%,参考列表11 488,:0005737)是细胞质,2556(25.9%,蛋白质参考列表9856:0016020)膜相关,1149年(54.2%,蛋白质参考列表2119:1903561)是细胞外泡相关和207年(38.6%,蛋白质参考列表536:0031012)ECM相关。187蛋白质(45.7%,蛋白质参考列表409:0062023)可以与collagen-containing细胞外基质术语。(蛋白质的数量不加起来5500,因为许多的蛋白质被归类为属于一个以上的词。)
微分分析(图2一个)Log2FC蛋白质水平对之前的时间点收获表明hPCLS经历重大的改变。13天,728人(17%,补充表S1)4288年的蛋白质比第一天已经发生重大变化。其中,10%改变了从第一天到第四天,剩下的7%从第四天到第七天。天7和13之间没有观察到进一步的改变。总的来说,343年的728改变蛋白表达下调,385年调节。
Cytoscape-based网络分析(补充图开通)的728个蛋白质主要是upregulation ECM降解相关涉及蛋白质的途径。更少的途径是与ECM的形成有关。炎症信号通路的一个重要upregulation,如中性粒细胞脱粒和先天免疫系统,也观察到(补充图开通)。
我们进一步分析了蛋白质组学数据调查不同细胞类型的动态的观察到蛋白质含量的变化。人类肺组织免疫,主要由间叶细胞、内皮细胞和上皮细胞。LGEA门户网站建立了一个数据库的每一个细胞类型的基因表达(这也是年龄相关性,从新生儿到成人阶段)在老鼠和人类肺(39,40]。在这个数据库中,RNA-seq flow-sorted人类肺细胞已被指定为CD45+免疫细胞,CD45−/ PECAM−/ VECadherin−/ EpCAM+上皮细胞混合,CD45−/ PECAM+/ VECadherin+内皮细胞和CD45混合−/ PECAM−/ VECadherin−/ EpCAM−混合间充质细胞。父母可以从LGEA数据库下载列表下“LungSortedCells”。我们比较(补充表S3a)显著改变(Log2FC≥0.5和≤−0.5和错误发现率(罗斯福)p≤0.05)蛋白质在13天与第一天到蛋白质列表归因于不同的细胞类(在LGEA [40]分析)。补充图S2c显示了四个广泛的分类标记主要的细胞类型,即上皮、内皮细胞、间叶细胞和免疫细胞类型,通常出现在肺组织13天在我们的文化系统。基于LGEA数据库我们还策划一系列常用的肺程控标记(图S2c补充,补充表S3)。值得注意的是,先进的糖基化最终产品特定的受体(蒸机)(肺泡1型)和表面活性剂蛋白C (SFTPC)(肺泡类型2)都明显下调的体外文化,而SFTPB,另一个肺泡2型标记,显示重要upregulation 13天比第一天。大多数检测myofibroblast标记显示持续下降而成纤维细胞标记tenascin C (TNC)和血小板衍生生长因子receptor-α(PDGFRA)显示增加和波形蛋白(VIM)则没有改变。平滑肌肌动蛋白α2 (ACTA2), myofibroblasts的另一个成熟的标志,不能检测到。
显著改变之间的间叶细胞蛋白质,pro-fibrotic胶原蛋白(8)如胶原蛋白类型Vα1链(COL5A1) (Log2FC−0.7)和III型胶原α1链(COL3A1) (Log2FC−0.9)显著下调。考虑到胶原蛋白类的蛋白质是高度相关的纤维化进展(8),这就促使我们考虑监管的模式的胶原蛋白检测。数据显示,文化条件下使用,大多数检测胶原蛋白(图3)随着时间的推移,使之抑制包括COL1 COL4 COL6。此外,有大量upregulation MMP2 (Log2FC 2.1)和MMP14 (Log2FC 2.27);这两种金属蛋白酶参与降解纤维胶原蛋白(41)如COL1、COL2 COL3 COL5。两个组织金属蛋白酶抑制剂,TIMP2和TIMP3 [42),也发现(补充表S1)。虽然TIMP3没有显示任何重大变化(Log2FC−0.24,罗斯福0.507,13天与第一天),TIMP2调节随时间(Log2FC 2.39,罗斯福< 0.0001,13天与天1)。在这种情况下,重要的是要注意,TIMP2已被证明加强MMP2的活性(43,44),这是一个collagen-degrading酶(45]。
一般来说,在检测到的金属蛋白酶体外文化显示调节表达式(图3)。
代谢组学分析和活细胞成像演示hPCLS生存能力随着时间的推移体外文化
调查是否hPCLS来源于组织切除non-ILD患者新陈代谢活跃体外文化条件下,样本收获的蛋白质组学分析,然后水溶性和机械单一化提取代谢物。体外培养hPCLS(三个捐助者,两个复制每捐赠,每复制两个hPCLS)受到LC / MS-based没有针对性代谢组分析(32]。总共发现了3523种代谢物可再生产地(补充表S2)范围内的样本分析。这些,335种代谢物变化显著的数量从1到13天(补充表S2a;补充图S2e)。
通路显著变化的带注释的代谢物的分析并没有发现明显的浓缩的具体途径。我们分析选定的代谢物的变化敏感,改变组织的健康。这表明hPCLS新陈代谢稳定体外文化(补充图S2f)。具体来说,ATP水平hPCLS保持不变,随着时间的推移和L-Lactic酸水平显著地建立在文化、暗示一个新陈代谢活跃的3 d组织系统。谷酰胺是越来越多的在hPCLS新陈代谢无需经过任何氧化应激,描绘的稳定水平redox-sensitive代谢物cysteine-glutathione二硫化谷胱甘肽(补充图S2f)。
为了进一步评估hPCLS组织健康体外文化,我们执行生活/死细胞microscopy-based分析。这显示没有信号的变化与活细胞的数量(calcein-AM)从第一天到13天(补充图S2a),而死细胞的数量大大减少从第一天到第四天58%但仍不断从每天4到13。死细胞的数量减少了从第一天到第七天,每天7和13之间保持不变,表明hPCLS文化总有细胞死亡。相比之下,calcein-AM信号不随时间变化,表明活性细胞增殖发生取代死细胞(补充图S2a)。这是进一步支持的常数ATP代谢物水平随着时间的推移,(补充图S2f, g)。与这些数据一致,比较蛋白质组学分析每天13 - 1 (补充图开通)表明,途径抑制细胞增殖是表达下调。
TGF -诱导pro-fibrotic信号β1刺激体外hPCLS文化
TGF-β1是纤维化的细胞因子被认为是主调节器信号(46]。诱导pro-fibrotic信号在我们的文化系统中,我们使用TGF-β1 (10 ng·毫升−1)之前由其他组报道在小鼠模型系统(47]和hPCLS [11]。天1、4、7和10 (图1),从non-ILD hPCLS来源于组织切除患者补充新鲜培养基含有人类重组TGF-β1或车辆体外文化。上层清液从每个hPCLS (±TGF-β1)在文化分别收集天4、7和13所示。每个捐赠者,四hPCLS-conditioned上层清液(除了LT18,第四天)分别受到专利竞争ELISA检测选择neoepitope [48)如PRO-C1 pro-fibrotic标记(26),FBN-C C3M。与早期的研究一致(11,49),TGF-β1刺激(图4一)增加PRO-C1和FBN-C文化上层清液中发现,指示pro-fibrotic诱导信号,而C3M显示没有变化。
为了更好地描述hPCLS模型系统如何回应TGF-β1刺激,我们还分析了TGF-β1响应在蛋白质组水平(四个捐助者、两个复制每捐助两个hPCLS /复制)。这里,hPCLS (vehicle-treated和TGF-β1)收获13天体外文化。hPCLS受到2% SDS溶液化和机械破坏。随后,溶解产物受到LC / MS。共有6600个蛋白质平均每复制和捐赠者被检测到。
其中,3998蛋白质在8个复制是很常见的(四个捐赠者;补充表S4)和下游受到分析。微分分析TGF-β1-treated hPCLS相比vehicle-treated hPCLS(13天)表明,TGF-β1治疗导致重大改变109蛋白(Log2FC−0.58和0.58之间,罗斯福假定值0.05,3998个蛋白质,补充图S4a)。一个策划与纤维化相关的蛋白质过程的数据分析表明,蛋白质如COL1A2 COL3A1, COL5A1, FBN-C,血小板反应蛋白1 (THBS1) [50],THBS2 [51),versican (VCAN) [52),过渡委员会(5210)和FKBP prolyl异构酶(FKBP10) (53]显著调节(图4 b)。此外,显著改变蛋白质受到使用Cytoscape通路分析(补充图S4b)。这表明诱导pro-fibrotic途径如胚胎形态发生、ECM组织和白介素信号、pro-epithelial损伤的差别,对这些信号通路等表面活性剂的新陈代谢(54- - - - - -57]。蛋白质组学分析外周血IPF患者此前曾被证明有下调细胞增殖通路(58),类似于蛋白质组的TGF-β1-treated hPCLS分析在我们的研究中。
109蛋白显著调节(补充图S4a)在TGF-β1治疗策划针对LGEA数据库对细胞特定类型标记(补充表S5)。这一分析表明,大多数显著下调蛋白质(39 44)特定的上皮细胞而调节(64 65)是特定于间充质细胞,这表明TGF-β1刺激可能诱发EMT-based pro-fibrotic信号系统(5)文化条件下使用。以确认它是EMT需要进一步分析。elisa对文化上层清液和细胞的蛋白质组学分析分数显示高upregulation空泡在TGF-β1刺激(图4一,b)。蛋白质组学数据,典型的myofibroblast ACTA2标志不能被探测到,但其他标记,如肌球蛋白轻链激酶(MYLK) [40)和transgelin (TAGLN) [40]确实显示重大upregulation (Log2FC分别为0.52和0.69,;补充表S4)。这些数据符合最近的一些研究[11,19,20.]显示pro-fibrotic感应信号体外培养hPCLS使用TGF-β1刺激[11)或者鸡尾酒pro-fibrotic因素(19]。
这种upregulation pro-fibrotic因素是否与微分调节基质金属蛋白酶的结果在一个一致的和特定的ECM沉积(特别是纤维胶原蛋白)迄今为止没有测试。因此,我们调查是否观察到upregulation pro-fibrotic因素被翻译成沉积ECM的纤维胶原蛋白。
定量label-free宋惠乔纤维胶原蛋白的成像分析
宋惠乔显微镜label-free成像方法,个人non-centrosymmetric分子被照亮的时候,产生的二次谐波信号较短的红光对于激光脉冲作为它们用于双光子显微镜(59]。在人体组织中,acto-myosin复杂的骨骼肌(胞质)60),大微管(61年)(胞质)和纤维胶原蛋白(59)(ECM)已被证明有生成所需的non-centrosymmetry宋惠乔信号。考虑到早期的发现,只有大型的纤维胶原蛋白存在于ECM的肺组织23],宋惠乔成像可以被认为是一个非常具体的和适当的技术定量测量矩阵在hPCLS沉积。
首先,我们比较hPCLS (PFA固定天0)来自发表non-ILD那些来自终末期患者的肺组织ILD (IPF和非特异性间质性肺炎)的病人。250µm厚,从天0 8毫米直径hPCLS化学固定。整个hPCLS成像(图5一个- c)。随后,获得3 d堆栈分析使用半自动图像分析管道(Jython script-image分析、补充材料)。原始宋惠乔强度值(补充图S5anon-ILD和ILD患者明显不同。量化这些相对折叠差异,综合宋惠乔信号(SHGi) log2转化为每个hPCLS (Log2SHGi),和平均的SHGi non-ILD hPCLS (4 non-ILD病人)计算和log2转变(Log2SHGic)。接下来,为每个hPCLS Log2SHGi之间的区别和Log2SHGic决心Log2SHGi healthy-norm(正常健康的捐赠者)。这里,ILD hPCLS是正常的总non-ILD控制按照对数公式,日志(m / n) =日志(m)−log (n)。分析显示更多的纤维胶原蛋白沉积在ILD hPCLS比non-ILD控制。我们观察到,宋惠乔信号来自航空公司或血管(图5 b)是non-ILD和ILD组织之间相似的强度,而间质胶原蛋白信号(图5 b相比,ILD)大幅增加non-ILD条件。
hPCLS变量量化宋惠乔信号由于空间形态的差异
整个hPCLS宋惠乔图像视觉分析(PFA固定,如果non-ILD病人,一天13)显示内在异质性的宋惠乔信号(图5 d)。显然,不同的航空公司hPCLS有不同的内容,血管和肺间质。因此,根据我们的观察(图5 b)和先前的报道,它是影响的实质间质(62年)在ILDs纤维化表型,我们设计了一种双向图像分析方法:1)从整个hPCLS宋惠乔强度进行分析比较差异和2)任何ROI宋惠乔信号来自血管或气道或没有信号是手动排除在分析(图5 e)。因此,只有hPCLS的间质分析比较不同(图5 e)。定量测量的两种方法的差异,如果我们使用宋惠乔图像hPCLS, PFA固定13天体外文化。使用图像分析管道,宋惠乔整个hPCLS强度(整体)和间质(roi)计算整个hPCLS(原始值补充图S5b)。分析褶皱差异,原始值宋惠乔强度(SHGi)全hPCLS或间质ROI值log2转换(Log2SHGi)和正常化的意思宋惠乔强度如果hPCLS (Log2SHGic)每个捐赠者(Log2SHGi unstimulated-donor-norm)。分析如果存在异构纤维胶原蛋白(来自航空公司或血管)使宋惠乔信号变量,我们分析了宋惠乔强度水平衡量整个hPCLS和ROI方法(图5 f)。整个hPCLS方差(0.39)是两倍的ROI分析(0.19)。此外,只有Log2SHGi ROI分析纤维胶原蛋白显示值正态分布按我们正常测试(表2Anderson-Darling测试D 'Agostino-Pearson测试和Shapiro-Wilk测试)。数据显示,ROI分析消除了固有的可变性hPCLS来自当前分析因素无关。这些数据表明,如果有微妙的变化发生在间质胶原蛋白纤维,ROI分析将更适合量化这些变化。
我们也分析了如果有性别、吸烟状况或与年龄相关的间质胶原蛋白的差异如果hPCLS后13天体外文化(补充图S5c)。分析表明,平均纤维胶原蛋白含量较低的男性与女性捐赠者。平均纤维胶原蛋白含量> 65岁的捐助者高于那些< 65年。然而,无论是数据具有统计上的显著差异。人有更显著的纤维胶原蛋白含量比吸烟者(补充图S5c)。这些差异的潜在机制仍然是难以捉摸的。
hPCLS显示变量在TGF -纤维胶原沉积反应β1刺激
hPCLS源自non-ILD患者的肺实质与TGF-β1刺激和文化上层的收获13天体外文化。上层清液受到ELISA PRO-C1和FBN-C (图6,b)。数据显示一个明确的调节合成两种标记在TGF-β1刺激所有捐助者(n = 10)。分析如果ECM的合成调节蛋白(图4 b)和PRO-C1 FBN-C (图6,b)导致ECM沉积相应增加,我们采用label-free宋惠乔成像和图像定量分析管道测量纤维胶原的沉积,如果TGF-β1-stimulated hPCLS从non-ILD病人(来自组织切除)。的原始值iSHG间隙roi的车辆和TGF-β1-stimulated hPCLS价值观log2转换(Log2iSHG)和正常化的意思是SHGi (Log2iSHGc)每个捐赠者(3 - 6 hPCLS每捐助,18捐助者)。与持续高位PRO-C1和FBN-C由ELISA测量,Log2SHGi纤维胶原蛋白的值没有显著的额外的纤维胶原沉积(图6 e)的间质hPCLS刺激与TGF-β1相比,控制组织(图6 h,补充图S5d)。差异蛋白质组学分析的车辆和TGF-β1-stimulated hPCLS(13天,补充表S4)显示,一些特定的金属蛋白酶降解的原生胶原蛋白(类型I, II, III, IV, V,七世,X和XI) (45),也称为胶原酶,如MMP2 (Log2FC 0.68), MMP3 (Log2FC 0.65)和MMP14 (Log2FC 0.52),显示upregulation在我们体外文化系统TGF-β1治疗后,而MMP12 (Log2FC−0.97)和MMP9 (Log2FC−1.2)表达下调。这些数据符合最近的数据在pcl的小鼠模型,胶原蛋白I型和III和弹性蛋白高流动率由于MMP的活动(63年]。同时,H一个等。(64年潘]表明,抑制MMP活动使用Ilomastat (GM6001)增强胶原原纤维形成人类间充质干细胞在体外文化。
明尼苏达一起TGF -β1刺激显著增强沉积ECM的纤维胶原蛋白
鉴于不同的观察微分upregulation基质金属蛋白酶体外hPCLS文化(图3),如上所述(补充表S4),报告说,失衡的MMP的活动是至关重要的纤维组织(65年),另外14个捐助者的组合处理TGF-β1 GM6001,明尼苏达。这些14捐助者,媒体收集上层的13个七天。ELISA的hPCLS-conditioned PRO-C1和FBN-C(执行上层清液图6 cd)。结果表明,明尼苏达单独治疗(4捐助者)没有影响这些标记物的合成。TGF-β1刺激计划导致一致的upregulation这两个标记相比,如果hPCLS上层清液。伴随刺激TGF-β1和明尼苏达导致增加PRO-C1和FBN-C TGF-β1相比单独治疗(图6 cd)。
调查是否治疗hPCLS TGF-β1 +明尼苏达导致增加纤维胶原的沉积在肺ECM,我们分析了车辆、明尼苏达、TGF-β1和TGF-β1 + MMPi-stimulated hPCLS使用我们宋惠乔工作流。明尼苏达单独治疗没有显著影响间质胶原宋惠乔信号相比各自vehicle-treated hPCLS (图6 f)。伴随治疗TGF-β1和明尼苏达导致更多的纤维胶原沉积相比单独TGF-β1治疗(图6 f)。特定的分析数据(图6克)表明,TGF-β1治疗引起的减少和增加他人的控制hPCLS宋惠乔信号相比。这个微分响应TGF-β1治疗的原因目前还不清楚。然而,对于每个样本分析,伴随治疗明尼苏达导致持续高纤维胶原蛋白信号相比TGF-β1单独治疗。这些数据证实,金属蛋白酶表达/活动是hPCLS病原因素模型系统特征的沉积在TGF-β1刺激胶原蛋白纤维。
讨论
hPCLS已成为一个高潜力的模型系统关键技术接近人体生理病理生理条件(11,19]。然而,描述的这样一个系统经历的固有的分子变化体外文化还没有被报道。
在这项研究中,我们报告第一次蛋白质组和代谢组变化hPCLS / 2周体外文化。这是大大超过7天之前报道(11,19]。这些程控数据(补充图S2c)来自管理我们的表型蛋白表达数据的RNA-seq LGEA数据库中的数据。比较LGEA数据库的排序列表,最近出版的单细胞测序结果的人类肺组织(66年- - - - - -68年]表明,一些标记分类LGEA数据库作为细胞特定类型实际上是存在于多个细胞亚型(如。TAGLN、ACTA2 PDGFRA) [68年]。尽管如此,我们表明,在四个主要类型的细胞中表达的蛋白质只402周后肺组织的存在体外文化(补充图S2c)。数据还显示(图3和补充图开通)的存在一个持久ECM降解炎症活动的2周期间体外文化,这是假定在健康的生理条件下不存在。这一发现挑战了一般假设在生理健康的条件保存在体外文化hPCLS [21]。这种炎症活动的来源目前不清楚。一种解释可能是由于样品制备,具体地说,组织切片。另外,它不能排除,使下降的炎症活动的发生事实的结果在我们的研究中使用的组织片来自tumour-adjacent地区,曾被证明是免疫活性(69年]。因为这些变化主要发生在第一次4天在文化、也许是明智的在将来的研究中开始调查之后这个“稳定时期”。然而,我们的研究表明,已经有损失蛋白表达的肺癌细胞标记,如SFTPC和蒸机,在文化的前4天。因此,根据问题解决了,我们认为它重要的比较结果在“稳定时期”文化的前4天。此外,这将是有趣的测试如果用细胞培养水平的氢化可的松治疗hPCLS可能有助于防止这种炎症活动。
存在的细胞如上皮细胞、内皮细胞和免疫细胞(补充图S2c)建议的可能性,这些细胞类型过渡到myofibroblasts在刺激与细胞因子如TGF-β1 [3),从而引发生理相关pro-fibrotic反击。符合其他研究[11),我们的蛋白质组学分析表明,许多pro-fibrotic标记是调节TGF-β1治疗后(图4一,b)包括pro-fibrotic纤维胶原COL1, COL3 COL5。hPCLS 13天体外文化,109年总蛋白质显著监管(两个,表达下调)。引人注目的是,64年的65个调节蛋白质具有间充质细胞类型的特点,和40的44个表达下调基因特定于上皮细胞类型(补充图自己)。这些数据表明,pro-fibrotic信号诱导hPCLS TGF-β1治疗后可能由于EMT (3]。上皮细胞蛋白质的差别或者,对这些随之而来的间叶细胞标记可以表明上皮细胞死亡或简单的损伤上皮与间充质伴随增加标记基因在间充质细胞。进一步测试这个假说,互补分析,如单细胞RNA-seq可以使用。现在重要的是,这些实验可能由于单细胞的最近进展和高质量的RNA制备从hPCLS70年]。此外,单一的细胞类型的动态可视化hPCLS和测试如果他们符合我们的蛋白质组学数据,我们的生活可以耦合的成像装置kramet al。(21]。
其他的研究(11,19)用hPCLS研究纤维化信号;然而,读出,ECM沉积在措施体外文化的缺乏。同样,在其他的模型系统中,间接ELISA等读数(26的胶原肽或血清中羟脯氨酸水平被用来推断纤维化如。在肝脏、肾脏或肺71年- - - - - -73年]。hPCLS模型系统,胶原蛋白定性监测使用抗体和免疫组织化学方法(19]。然而,在这些研究中使用的抗体不能区分纤维和non-fibrillar胶原蛋白类型。为了克服这些局限性,我们label-free宋惠乔成像应用于具体量化的胶原蛋白的纤维含量在ECM hPCLS。label-free成像的一个关键优势是能够形象深入纤维ECM-deposited胶原组织和具体措施。宋惠乔成像分析non-ILD和ILD patient-derived hPCLS显示更高水平的纤维胶原蛋白在ILD-derived hPCLS比组织从non-ILD捐助者(图5 b,c),显示的定量特性成像工作流程建立。我们的图像分析显示,记录间质胶原蛋白水平的函数的年龄,性别和吸烟状况(补充图S5c)连同其他肺重要器官可以被证明是一个强大的工具来检测敏感性ILD的人类。这可以结合其他分子技术来确定根本原因,给小说见解疾病机制。有趣的是,表达的增加pro-fibrotic标记TGF-β1-stimulated hPCLS,揭示了我们的ELISA和蛋白质组学分析(分别PRO-C1和COL1A2),并没有导致相应的沉积在ECM(显著增加图6 e- g)。这个观察可能解释为微分调节基质金属蛋白酶和各自的酶活动non-ILD patient-derived hPCLS TGF-β1治疗(补充表S4)。在这里,我们观察到,MMP9 MMP12明显下调;这两种基质金属蛋白酶可能在hPCLS免疫与响应相关的作用,因为这些酶都被描述规范的CD14受体影响的宿主防御(74年]。唯一的检测TIMP TIMP3,显示无显著变化。然而,MMP2和MMP14调节(补充表S4)。后者已经知道使用COL1 COL2和COL3基质(45];因此,在这种情况下,upregulation可能导致增强坳退化之前沉积(45]。支持这一假说,伴随治疗TGF-β1 GM6001,明尼苏达,增加PRO-C1和FBN-C(的水平图6 c,d)条件上层清液,增加纤维胶原沉积相比TGF-β1单独治疗。与现有文献一致,这些数据强调的重要性MMP活动纤维胶原沉积,因此纤维化的发展。因为GM6001是一个广泛的明尼苏达,还需要更多的实验来确定哪个基质金属蛋白酶特别是参与这个过程。这也将是有趣的定量调查对纤维胶原沉积的影响通过刺激hPCLS炎性分子的鸡尾酒,因为已经成功演示了定性的影响lsafadiet al。(19]。
肺纤维化是一种衰老相关疾病(75年开发多年。因此,增加纤维胶原蛋白沉积在2周内只能将温和,观察到这里。然而,我们表明,伴随治疗TGF-β1和明尼苏达导致明显增强纤维沉积响应TGF-β1治疗体外模型系统,展示我们的综合方法的潜力。同样有趣的是,并不是所有的病人的样本回应TGF-β1:18个捐助者的测试,两个显示没有区别,8显示信号,增加8显示减少信号(图6 e- g,补充图S5d)。将捐赠者的反应根据他们的性别、吸烟状况和年龄(补充图S5d, e)并没有透露任何明显的因素可能解释这些TGF-β1响应的变化。一种解释可能是某些hPCLS比其他人更倾向为ECM沉积由于空间起源的肺。组织空间变化发展中纤维化病灶被报道肺纤维化发展的特点(76年]。我们可以因此不排除这种可能性,宋惠乔信号的变化来响应TGF-β1治疗是由这样的空间变化。我们也可以不排除这样一种可能性,即变异性TGF-β1活动是由刚度的变化(77年,78年hPCLS ECM的。
我们multiomic hPCLS描述表明,他们新陈代谢可行的,包含所有lung-relevant细胞类型2周体外文化。这些数据支持的想法hPCLS模型系统可以用于研究人类肺physiology-related分子过程。然而,明显存在局限性。我们的蛋白质组学分析表明,hPCLS在基质金属蛋白酶文化经历重大的改变,胶原蛋白和促炎症通路。这与所提出的或认为早期的研究(79年)缺乏这种multiomic分析。最近的研究表明,在疾病的发作,如。初始纤维母细胞激活和ECM积聚,招募循环免疫细胞进一步加强纤维化(80年]。hPCLS模型系统,这些细胞生存,但他们不断的补充,因为它发生在人体是失踪。添加这些循环细胞来自同一个捐赠者hPCLS文化在不同的日子将会是一个强大的工具来建立他们的角色在肝纤维化进程。此外,肺生理方面的合规等循环氧含量和机械张力的变化缺乏。关键除了改善当前实验文化设置可能因此hPCLS生物反应器系统中模拟这些肺生理的重要组成部分。
IPF肺纤维化病灶发展,而不是弥漫性纤维化,这些被广泛的特点是J的等。(76年]。这里开发的图像分析方法着重于间质肺实质的,可能在未来帮助识别的进展和发展以定量的方式这样的焦点。我们建议,这里描述的补充方法,使用label-free成像hPCLS一起测量可溶性标记,如PRO-C1 FBN-C C3M,可以使胶原合成与降解的动态特征(分数合成)体外在肝纤维化进程。此外,解剖单一细胞的作用在调节各种pro-fibrotic刺激的影响,我们的工作流可以耦合到新成立的单细胞分析管道在hPCLS的年代tegmayret al。(70年]。
因为宋惠乔不需要固定样本,作为免疫化学的情况,这种label-free方法应该允许延时监测ECM沉积的动力学研究在较长一段时间。最初的概念验证实验表明此方法的可行性补充图S6)。住宋惠乔成像将允许纤维胶原沉积的动力学,以及回归,是评估治疗或药物干预。
总之,我们宋惠乔成像装置和分析管道建立了这将是一个强大的工具为研究纤维化。
补充材料
补充材料
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补充表S1。列表中所有的蛋白质,他们Log2FC第一天和相应的罗斯福值。这些数据来自质量规范的分析如果hPCLS随时间(天1、4、7、10、13)体外文化。erj - 00221 - 2020. - table_s1
S1a补充表。列表的所有的蛋白质显著监管13天第一天相比,他们Log2FC对第一天在不同的日子(4、7、10、13)和相应的罗斯福值。这些数据来自质量规范的分析如果hPCLS随时间(天1、4、7、10、13)体外文化。erj - 00221 - 2020. - table_s1a
补充表印地。列表的胶原蛋白和基质金属蛋白酶从第一天发现,4,7,10日和13日Log2FC对第一天在不同的日子(4、7、10、13)和相应的罗斯福值。这些数据来自质量规范的分析如果hPCLS随时间(天1、4、7、10、13)体外文化。erj - 00221 - 2020. - table_s1b
补充表S2。列表的所有代谢物中发现随着时间的推移如果hPCLS。列表包含Log2FC对第一天在不同的日子(4、7、10、13)和相应的罗斯福值。这些数据来自hPCLS的代谢组学分析。erj - 00221 - 2020. - table_s2
S2a补充表。的所有注释列表代谢物中发现随着时间的推移如果hPCLS。列表包含Log2FC对第一天在不同的日子(4、7、10、13)和相应的罗斯福值。这些数据来自hPCLS的代谢组学分析。erj - 00221 - 2020. - table_s2a
补充表S3。列出所有的特异性蛋白质检测,Log2FC第一天和相应的罗斯福值。这些数据来自质量规范的分析如果hPCLS随时间(天1、4、7、10、13)体外文化比较LGEA数据库。erj - 00221 - 2020. - table_s3
S3a补充表。列出所有的特异性蛋白质检测,显著监管13天第一天相比,他们Log2FC第一天和相应的罗斯福值。这些数据来自质量规范的分析如果hPCLS随时间(天1、4、7、10、13)体外文化比较LGEA数据库。erj - 00221 - 2020. - table_s3a
补充表S4。列表的所有的蛋白质检测到13天在车辆和TGFβ1 hPCLS治疗。关于vehicle-treated Log2FC天13 hPCLS。这些数据来自质量规范的分析车辆和TGFβ1对待hPCLS(13天)体外文化。erj - 00221 - 2020. - table_s4
S4a补充表。列表的所有的蛋白质显著监管TGFβ1对待hPCLS相比vehicle-treated hPCLS。这些数据来自质量规范的分析车辆和TGFβ1对待hPCLS(13天)体外文化。erj - 00221 - 2020. - table_s4a
补充表S5。列出所有的特异性蛋白质检测,Log2FC对vehicle-treated hPCLS(13天)和相应的罗斯福值。这些数据来自质量规范的分析车辆和TGFβ1对待hPCLS(13天)体外文化和比较LGEA数据库。erj - 00221 - 2020. - table_s5
补充表S6。这些数据来自时间进程质量规范分析。这里列出了所有的蛋白质检测。列表分为每个捐赠者和复制的值。例如:Day04_F-S-LT21_rep1,指变化对第四天第一天,女(F)捐赠,主动吸烟者状态(S),被称为ID LT21和属于复制。这些值不是Log2转换,因此一个值为1时表示没有变化,低于1意味着减少以上1意味着增加对第一天如果hPCLS。erj - 00221 - 2020. - table_s6
S7补充表。这些数据来自车辆和TGFβ1对待hPCLS(13天)质量规范分析。这里列出了所有的蛋白质检测(NA意味着没有检测到供体或复制)。列表分为每个捐赠者和复制的值。例如:Day04_F-S-LT21_rep1,指变化对第四天第一天,女(F)捐赠,主动吸烟者状态(S),被称为ID LT21和属于复制。这些值不是Log2转换,因此一个值为1时表示没有变化,低于1意味着减少以上1意味着增加对天13 vehicle-treated hPCLS。erj - 00221 - 2020. - table_s7
S8补充表。ELISA的原始值的测量每个hPCLS每捐赠。erj - 00221 - 2020. - table_s8
补充表S9。ELISA的原始值的测量每个hPCLS每捐赠车辆或者TGFβ1刺激。erj - 00221 - 2020. - table_s9
S10补充表。原始的ELISA的测量值每捐赠车辆,每个hPCLS TGFβ1、明尼苏达和TGFβ1 +明尼苏达多项刺激。erj - 00221 - 2020. - table_s10
斐济代码间质和nor-interstitial ROI的选择erj - 00221 - 2020. -补充
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确认
技术援助从生物材料Christa Stolp银行海德堡(BMBH)组织装配。维姬的帮助我们也愿意承认巴雷特(GSK斯蒂夫尼奇)与Krumdieck帮助训练。我们真诚感谢凯特琳Strohmer和安娜Rutkowska-Klute (Cellzome-GSK)帮助建立宋惠乔成像。Pepperkok团队和所有EMBL的核心设施也承认他们的支持,手稿和富有成果的讨论准备数据分析。
脚注
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利益冲突:M.M.汗没有披露。
利益冲突:d Poeckel没有披露。
利益冲突:a . Halavatyi没有披露。
利益冲突:j . Zukowska-Kasprzyk没有披露。
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利益冲突:A.J.费舍尔报告从葛兰素史克赠款,在进行研究,从辉瑞和赠款,Nuformix和Genentech外提交的工作。
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支持声明:这项研究是由一个联合EMBL-GSK博士后项目,由德国肺癌研究中心(DZL)。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2020年2月3日。
- 接受2020年12月9日。
- 版权©2021人队。
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