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研究文章

支气管收缩引发TGF-β释放和在豚鼠肺气道重构的片

  • Tjitske a Oenema,

    t.a.oenema@rug.nl

    从属关系分子药理学、格罗宁根哮喘和慢性阻塞性肺病研究所,格罗宁根,荷兰格罗宁根大学格罗宁根哮喘和慢性阻塞性肺病研究所(GRIAC),格罗宁根,荷兰格罗宁根大学

    ⨯
  • 伤害Maarsingh,

    从属关系分子药理学、格罗宁根哮喘和慢性阻塞性肺病研究所,格罗宁根,荷兰格罗宁根大学格罗宁根哮喘和慢性阻塞性肺病研究所(GRIAC),格罗宁根,荷兰格罗宁根大学

    ⨯
  • Marieke Smit,

    从属关系分子药理学、格罗宁根哮喘和慢性阻塞性肺病研究所,格罗宁根,荷兰格罗宁根大学格罗宁根哮喘和慢性阻塞性肺病研究所(GRIAC),格罗宁根,荷兰格罗宁根大学

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  • Geny m . m . Groothuis

    联系药物动力学、毒理学和定位,格罗宁根研究所制药、格罗宁根,荷兰格罗宁根大学

    ⨯
  • 赫尔曼•穆尔

    从属关系分子药理学、格罗宁根哮喘和慢性阻塞性肺病研究所,格罗宁根,荷兰格罗宁根大学格罗宁根哮喘和慢性阻塞性肺病研究所(GRIAC),格罗宁根,荷兰格罗宁根大学

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  • Reinoud Gosens

    从属关系分子药理学、格罗宁根哮喘和慢性阻塞性肺病研究所,格罗宁根,荷兰格罗宁根大学格罗宁根哮喘和慢性阻塞性肺病研究所(GRIAC),格罗宁根,荷兰格罗宁根大学

    ⨯

文摘

气道重构,包括平滑肌改造,在哮喘气流限制的主要原因。最近的证据联系支气管收缩在哮喘气道重塑。涉及的机制知之甚少。可能的球员是TGF-β多功能的细胞因子,在气道重塑中发挥着重要作用。豚鼠肺片被用作在体外模型来调查机制参与bronchoconstriction-induced气道重塑。为了解决这个目的,机械bronchoconstricting刺激对收缩蛋白表达的影响和TGF-β释放了。肺片是可行的,至少48小时。醋甲胆碱和TGF-β1增强收缩蛋白的表达(sm-α-actin、sm-myosin calponin)后48 h。共焦荧光显微镜显示,增加sm-myosin表达增强的外围航空公司和中央航空公司。机械的研究表明methacholine-induced支气管狭窄介导的生物活性TGF-β的释放,导致收缩蛋白表达增加,作为抑制肌动蛋白聚合(latrunculin)或TGF-β受体激酶(SB431542)阻止乙酰甲胆碱的影响,而其他bronchoconstricting代理(组胺和氯化钾)模仿乙酰甲胆碱的影响。集体,支气管收缩促进TGF-β的释放,导致气道平滑肌改造。这项研究表明,肺片是有用的在体外模型来研究机制参与气道重塑。

引用:Oenema助教,Maarsingh H, Smit M, Groothuis GMM,穆尔H, Gosens R(2013)支气管收缩引发TGF-β释放和气道重塑在豚鼠肺片。《公共科学图书馆•综合》8 (6):e65580。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065580

编辑器:亥姆霍兹慕尼黑中心的Oliver Eickelberg /路德维希-马克西米利安-慕尼黑,德国

收到:2013年2月6日;接受:2013年4月26日;发表:2013年6月26日

版权:©2013 Oenema et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。

资助:这项工作是支持的格罗宁根药物研究中心和格罗宁根大学的。工作已经执行的一部分在格罗宁根大学医学中心成像和显微镜中心(UMIC),这是由NWO-grants 40-00506-98-9021和175-010-2009-023。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。

利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。

介绍

气道重塑是一个重要的病理特征的慢性哮喘[1]。气道重构包含所有航空公司的结构变化,包括气管平滑肌层的改造是其中一个最引人注目的慢性哮喘的病理特征[2]。气道平滑肌层的改造已建议在哮喘气流阻塞的一个主要原因[3],[4]。然而,这种病理机制仍不清楚。

支气管收缩期间,航空公司受到机械力,促进居民的基因表达和生长因子释放细胞[5]。因此,机械力可以促进组织改造。例如,压缩的气道上皮细胞导致改造的特点,包括upregulation TGF-β基因表达和蛋白纤连蛋白的表达[5]- - - - - -[8]。Grainge等人证明了重复醋甲胆碱引起的支气管收缩挑战可以诱导功能轻度哮喘患者的气道重塑[9],包括增加上皮TGF-β表达和牙龈saline-challenged相比,胶原沉积增加控制。此外,我们先前已经表明,治疗的致敏豚鼠抗胆碱能药物tiotropium抑制支气管扩张剂反复过敏原引起的气道重构的挑战[10],[11]。这些发现提供了新的见解的因果关系之间的关系持续的气流阻塞,在哮喘气道重塑。

的多功能细胞因子TGF-β气道重塑中起着重要的作用[12]。在哮喘患者的气道,这个pro-fibrotic细胞因子高表达,特别是在上皮细胞和嗜酸性粒细胞[12],[13]。TGF-β气道平滑肌细胞1可以诱导增殖[12],[14],[15]以及增加收缩蛋白标记物的表达,如sm-α-actin和calponin通过转录和转译控制[13],[14]。丝氨酸/苏氨酸激酶受体的激活TGF-β1将会引发的磷酸化Smad 2/3呢[16]核本地化,促进血清反应因素,而协同调节平滑肌特定基因的转录活性[17]- - - - - -[19]。此外,TGF-β1可以调节气道上皮细胞和成纤维细胞的细胞增殖,细胞分化和细胞外基质的合成蛋白质在这些细胞[20]。尽管证据存在,TGF-β调节机械压缩后气道上皮细胞,参与组织改造,直接支气管狭窄和TGF-β-induced气道重构之间的联系还没有被证实。

展示肺片已经被证明是有价值的在体外在药理研究和药物开发的工具[21]。肺片有各种优势与气道平滑肌细胞培养相比,因为所有肺细胞存在,和接触和cell-matrix交互是保存,这是重要的支气管收缩和气道重塑的监管机构[22]。此外,流失严重气道平滑肌细胞收缩能力的文化,与失去sm-myosin表达和收缩受体,是可以避免的[23],[24]。此外,大量的肺的肺片可以准备一个动物,它允许直接比较的实验治疗控制相同的动物[24]。使用展示从豚鼠肺片有额外的好处。例如,Ressmeyer et al .,表明,气道反应乙酰甲胆碱是几乎相同的展示从人类和豚鼠肺片[24]。此外,在其他小型实验动物相比,有巨大的解剖和功能相似之处天竺鼠和人类的航空公司包括小航空公司的存在[4]。

因此,在目前的研究中,用作展示肺片在体外模型来研究bronchoconstriction-induced气道重塑的机制。展示从豚鼠肺片与收缩刺激受体激动剂如醋甲胆碱、组胺和氯化钾,而且TGF-β的多效细胞因子1。收缩蛋白表达进行了研究以应对这些刺激气道重塑的一个标志。使用特定抑制剂,收缩蛋白表达的机制诱导增加支气管狭窄进行了研究,发现依赖mechanically-induced释放内源性TGF-β。

材料和方法

动物

远,男,指定无菌邓肯哈特利豚鼠(哈伦,希斯菲尔德,英国)(740±85 g)。本研究中所描述的所有协议格罗宁根大学动物实验委员会批准,格罗宁根,荷兰。动物们被安置在12小时光/暗周期在温度和湿度的房间里,食物和自来水随意。

展示肺片

展示肺片准备如[24]。简而言之,后euthanization注射戊巴比妥(Raamsdonksveer Euthasol 20%, Produlab制药公司,荷兰)气管插管,动物是通过主动脉abdominalis ex-sanguinated。肺是通过套管与低熔点琼脂糖溶液(5%最终浓度(Gerbu Biotechnik GmbH, Wieblingen,德国)CaCl2(0.9毫米),MgSO4(0.4毫米),氯化钾(2.7毫米),氯化钠(58.2毫米),不2阿宝4(0.6毫米)、葡萄糖(8.4毫米),NaHCO3(13毫米),玫瑰(12.6毫米),丙酮酸钠(0.5毫米),谷氨酰胺(1毫米),MEM-amino酸混合物(1∶50)和MEM-vitamins混合物(1∶100),pH = 7.2)。随后,肺部都放在冰至少30分钟,为了巩固切片的琼脂糖。组织核心是准备使用一个旋转磨金属从叶管(直径15毫米),其次是切片组织CaCl组成的介质2(1.8毫米),MgSO4(0.8毫米),氯化钾(5.4毫米),氯化钠(116.4毫米),不2阿宝4(1.2毫米)、葡萄糖(16.7毫米),NaHCO3(26.1毫米),玫瑰(25.2毫米),pH = 7.2,使用组织切片机(Compresstome™vf - 300切片机,Precisionary仪器,圣何塞,美国)。肺片厚度500µm被削减。

培养基

刺激之前,肺片孵化分别在24孔板最小CaCl组成的重要媒介2(1.8毫米),MgSO4(0.8毫米),氯化钾(5.4毫米),氯化钠(116.4毫米),不2阿宝4(1.2毫米)、葡萄糖(16.7毫米),NaHCO3(26.1毫米),玫瑰(25.2毫米),丙酮酸钠(1毫米),谷氨酰胺(2毫米),MEM-amino酸混合物(1∶50)和MEM-vitamins混合物(1∶100),pH = 7.2,在37°C在潮湿的气氛中。为了消除琼脂糖从组织和细胞碎片,媒介是30分钟后刷新,其次是2每小时清洗一次。在实验期间,肺片在杜尔贝科孵化的修改鹰的介质(DMEM)补充丙酮酸钠(1毫米),非必需氨基酸混合物(1∶100)、庆大霉素(45µg /毫升),青霉素(100 U /毫升),链霉素(100µg /毫升)和两性霉素B(1.5µg /毫升)37°c - 5%股份有限公司2。

乳酸脱氢酶释放

评估肺片的可行性,乳酸脱氢酶(LDH)释放量片进入孵化介质相对于总片含量测定。片被孵化6孔板(2片/)4毫升孵化中1,2,3或4天。最大LDH释放是由赖氨酸1% 2片Triton x - 100为30分钟37°C在实验的开始。上层清液存储−80°C。上层清液LDH释放是由常规临床化学UMCG(格罗宁根、荷兰)使用罗氏/日立模块化系统(罗氏,曼海姆,德国)。

线粒体活性测定

线粒体活动,作为额外的衡量组织的可行性,评估Alamar蓝色转化为其简化形式,如前所述[25]。肺片孵化了汉克斯平衡盐溶液,含有10% Alamar蓝色的解决方案(BioSource,打击士气,CA),至少30分钟37°c - 5%股份有限公司2[25]。

治疗肺片

肺片在6-well培养板,使用2片/。片是刺激与醋甲胆碱(10µM), TGF-β1(0.1,0.2,1和2 ng / mL),氯化钾(60毫米)或组胺(1µM)连续1或2天,表示。提到,肺片与肌动蛋白聚合的抑制剂pre-incubated latrunculin(0.3µM)或选择性抑制剂TGF-βI型受体的激活素受体激酶ALK5 SB431542(0.3µM) 30分钟。

MRC-5成纤维细胞的刺激条件刺激肺片的媒体

MRC-5肺成纤维细胞培养在火腿的F12培养基补充10%胎牛血清的边后卫,谷酰胺(2毫米),链霉素(100µg / L)和青霉素(100 U /毫升)。对于每一个实验,细胞融合和随后培养介质代替了火腿的F12培养基补充0.5%的边后卫,谷酰胺和抗生素的24小时。此后,细胞被刺激与TGF-β1 h1(2 ng / mL),醋甲胆碱(10µM)或从孵化条件媒体获得肺片。条件使用媒体被控制片和切片TGF-β对待1(2 ng / mL)或妇幼保健(10µM),存在和缺乏抑制剂latrunculin(0.3µM)或SB431542(0.3µM), 48 h。

免疫荧光

肺片刺激在6孔板,使用2片/。片与乙酰甲胆碱激发(10µM)或TGF-β1(2 ng / mL)连续2天。与细胞骨架洗两次后缓冲区(CB: MES(10毫米),氯化钠(150毫米),EGTA(5毫米),MgCl2(5毫米)和葡萄糖(5毫米)pH = 6.1),肺片与CB含有3%多聚甲醛固定(PFA) 15分钟。随后孵化与CB片缓冲区包含3% PFA和5分钟triton - x - 100为0.3%,紧随其后的是一个额外的2洗CB缓冲区。肺片被阻塞1 h cyto-TBS (Tris-base (20 mM),氯化钠(154毫米),EGTA MgCl(2.0毫米)2(2.0毫米),pH = 7.2),补充了BSA(1%)和正常驴血清(2%)。之后,一夜之间,肺片被沾染了鼠标sm-myosin抗体在4°C。洗后3次Tween-20 cyto-TBS含有0.1% (cyto-TBS-T) 10分钟,孵化与二级抗体(cyto-TBS-T Cy3-mouse, 1∶50)在3 h在室温下进行。肺片然后洗4次cyto-TBS-T 15分钟,其次是4用超纯水清洗。幻灯片和延长安装黄金anti-fade试剂(表达载体、布雷达,荷兰)。染色后,使用徕卡TCSSP2共焦显微镜幻灯片进行分析。所有条件在一个实验中分析了使用相同的微观设置相同的会话。激发波长为543 nm。

西方墨点法

肺片或MRC-5细胞被洗一次冰冷的磷酸盐(PBS、组成:氯化钠(140毫米),氯化钾(2.6毫米),KH2阿宝4(1.4毫米),Na2HPO4(8.1毫米),pH值为7.4),其次是溶解使用冰冷的SDS-lysis缓冲区(Tris-HCl(62.5毫米),SDS(2%)、氟化钠(1毫米),Na3签证官4(1毫米),抑肽酶(10µg /毫升),亮抑酶肽(10µg /毫升),抑肽素(7µg /毫升)在pH值8.0)。等量的蛋白质,由皮尔斯蛋白质测定根据制造商的指示,SDS聚丙烯酰胺凝胶上分离和转移到硝基,其次是标准的免疫印迹技术。所有乐队都规范化β-actin或者总Smad 2/3的表情。

抗体和试剂

氯醋甲胆碱是从ICN购买生物医学(Zoetermeer、荷兰)。人类重组TGF-β1获得了从研发系统(英国阿宾顿)。鼠标anti-α平滑肌肌动蛋白(sm-α-actin)抗体,鼠anti-calponin抗体,鼠anti-β-actin(β-actin)抗体,辣根过氧化物酶(合)共轭兔子anti-mouse免疫球蛋白抗体,组胺是购自Sigma-Aldrich (Zwijndrecht、荷兰)。鼠标anti-smooth肌凝蛋白(sm-myosin)从Neomarkers购买(免疫,Duiven、荷兰)。Cy3-conjugated二级抗体来自杰克逊ImmunoResearch(美国西树林PA)。兔子anti-phospho-Smad3 (Ser423/425)从细胞信号技术(美国贝弗利,MA)。兔子anti-total Smad 2/3 (fl - 425)购买在圣克鲁斯生物技术(德国海德堡)。抑制剂latrunculin和SB431542购买从Tocris生物科学(英国布里斯托尔)。所有其他化学试剂均为分析纯。

数据分析

数据给出平均值±SEM。统计学意义是由成对的学生t以及配对的双尾分布或单向方差分析观察,其次是Newman-Keuls多个比较测试在适当的时候。数据被认为是显著p < 0.05。

结果

肺片生存能力

确定培养的可行性展示肺片,LDH释放和线粒体活动进行评估后1、2、3和4天的孵化。我们观察到在LDH释放显著增加;然而,LDH释放仍低于15%的最大内容2天(图1一个),观察到以前Ressmeyer et al。[24]。LDH释放的时间进程是密切平行测定线粒体的活动,这表明显著减少活动开始3天(图1 b)。基于这些数据,我们使用肺片,培养2天。

缩略图
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图1所示。肺片生存能力。

LDH释放肺切片后1、2、3和4天的文化。最大LDH片的内容建立了裂解Triton x - 100 (A)为1%。数据显示3 - 7意味着±SE的独立实验。线粒体活动肺切片后1、2、3和4天的文化(B)。数据显示意味着±SE 5独立的实验。*:p < 0.05* * *:相比p < 0.001基底(单向方差分析,posthoc Newman-Keuls)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065580.g001

收缩蛋白表达在应对TGF-β1

TGF-β1是一个强大的细胞因子,诱导细胞生物过程导致气道重构[12]。因此,为了研究肺片作为的有效性在体外我们研究模型来研究气道重构,TGF-β的效果1治疗肺片的收缩蛋白表达。肺片剂量和时间的方式是孵化1或2天TGF-β的存在与否1(0.1,0.2,2 ng / mL)的表达和分析sm-myosin, sm-α-actin calponin。我们发现TGF-β1诱导时间和浓度增加的表达sm-myosin, sm-α-actin和calponin (图2 a - b)。sm-myosin的最大响应测量是通过孵化2 ng / mL TGF-β片1连续2天(图2 b)。这个条件被选为进一步实验细胞因子。

缩略图
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图2。TGF-β浓度和时间的影响1在收缩蛋白表达。

肺片治疗时间,concentration-manner TGF-β1(0,0.1,0.2,2 ng / mL) 1或2天,表示。sm-myosin肺片溶解产物进行分析,sm-α-actin,或使用β-actin calponin加载控制。代表滴TGF-β1全身收缩蛋白表达(A)的光密度分析sm-myosin表达式(B)。数据显示意味着±SE 3个独立的实验。*:p < 0.05,* *:p < 0.01* * *:相比p < 0.001基底(单向方差分析,posthoc Newman-Keuls)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065580.g002

收缩蛋白表达,以应对methacholine-induced支气管收缩

我们下一个决定是否也支气管狭窄引起的收缩蛋白的表达。刺激肺片10µM醋甲胆碱2天导致sm-myosin表达增加,calponin(69±0.23, 2.89±0.59倍归纳,分别)。然而,醋甲胆碱没有诱导的表达增加sm-α-actin (图3模拟)。

缩略图
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图3。醋甲胆碱刺激诱发肺片收缩蛋白表达。

与TGF-β肺片治疗1(2 ng / mL),醋甲胆碱(妇幼保健;10µM)或中等(基底)2天。存在的肺片溶解产物进行sm-myosin (B), sm-α-actin (C),或calponin (D)使用β-actin作为加载控制。代表墨迹图所示(一个)。数据显示在图形的意味着±SE是3 - 4个独立的实验。* * *:相比p < 0.001基底(单向方差分析,posthoc Newman-Keuls)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065580.g003

在查看这些数据,我们进一步研究了本地化的TGF-β引起的收缩蛋白表达增加1和乙酰甲胆碱的航空公司。因此,肺片与TGF-β孵化1(2 ng / mL)或醋甲胆碱(10µM)彩色immuno-cytochemically sm-myosin和可视化使用共焦荧光显微镜。染色强度内平滑肌束量化(图4 a - c)。区分外围从中央航空公司的航空公司,航空公司的直径测量。航空与直径100µm被视为边缘与直径超过400µm航空公司和航空中心。sm-myosin表达的增加,但是sm-α-actin(数据未显示),以应对醋甲胆碱和TGF-β1用共焦荧光显微镜观察,发现在外围航空直径小于100µM (1.8±0.3, 1.6±0.1 fold-induction醋甲胆碱和TGF-β1分别图4 a - b),并在中央航空公司,直径大于400µM (1.6±0.1 fold-induction醋甲胆碱图4 c)。

缩略图
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图4。定位sm-myosin TGF-β后表达1和醋甲胆碱治疗。

与TGF-β肺片治疗1(2 ng / mL),醋甲胆碱(妇幼保健;10µM)或中等(基底)2天。肺片被固定的,彩色sm-myosin和共聚焦免疫荧光显微镜分析。图片所示(一个)来自周边航空公司(直径小于100µm)。染色强度肌肉内包从外围量化和数据显示航空公司(B)和中央航空公司(直径大于400µm;C)意味着±SE的3个独立的实验。*:相比p < 0.05基底(单向方差分析,posthoc Newman-Keuls)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065580.g004

bronchoconstriction-induced气道重塑的机制

醋甲胆碱引起的支气管收缩导致上皮TGF-β的释放增加哮喘病人[11]。同时,气道平滑肌细胞和上皮细胞的共培养导致反应释放生物活性TGF-β收缩受体激动剂如lysophosphatidic酸和醋甲胆碱[26]。因此,我们观察到的收缩蛋白表达增加支气管收缩反应可能是由于肺片TGF-β的释放。建立生物活性TGF-β是否参与收缩蛋白表达增加醋甲胆碱,生物活性TGF-β决心从刺激条件媒体展示肺片,使用Smad-3磷酸化在人类MRC-5 bio-assay成纤维细胞。人类MRC-5成纤维细胞培养1小时与条件媒体获得methacholine-stimulated肺片,其次是分析磷酸化Smad-3,特别是由TGF-β激活。的磷酸化Smad-3被条件显著增加媒体methacholine-stimulated肺片相比,基底控制(图5一个)。控制,直接TGF-βSmad-3磷酸化的反应1和醋甲胆碱在人类MRC-5成纤维细胞。TGF-β1,但不是醋甲胆碱诱导直接磷酸化的Smad-3 MRC-5细胞(图5一个),证实乙酰甲胆碱的影响是由于释放生物活性TGF-β从肺片。

缩略图
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图5。支气管狭窄引起的释放生物活性TGF-β导致收缩蛋白表达。

人类MRC-5成纤维细胞刺激与TGF-β1小时1(2 ng / mL),醋甲胆碱(妇幼保健;10µM)或中等(基底),或与条件媒体从肺片获得文化治疗2天没有10µM醋甲胆碱。磷酸化MRC-5细胞溶解产物进行分析(ser 423/425)和总Smad-3。代表印迹和量化数据Smad-3磷酸化的反应条件媒体所示(一个)。数据显示意味着±SE 4个独立的实验。*:p < 0.05,而基底(成对的学生的t以及双尾分布)。肺片与latrunculin预处理(0.3µM), SB431542(0.3µM),或中等(基底)30分钟,其次是2天的醋甲胆碱治疗(妇幼保健;10µM), TGF-β1(2 ng / mL)或介质(基底)(B)。肺片存在sm-myosin溶解产物进行分析,使用ß-actin作为加载控制。墨迹是代表3所示实验。人类MRC-5成纤维细胞与条件刺激1小时从肺片获得媒体文化与醋甲胆碱治疗后(妇幼保健;10µM), TGF-β(2 ng / mL)或中等(基底),在没有出现latrunculin(0.3µM)或SB431542(0.3µM) (C), MRC-5细胞溶解产物进行分析磷酸化(ser 423/425)和总Smad-3。墨迹是代表3所示实验。肺片与latrunculin pre-incubated(0.3µM), SB431542(0.3µM),或中等(基底)30分钟,其次是2天刺激与醋甲胆碱(妇幼保健;10µM), TGF-β1(2 ng / mL)、组胺(,1µM),氯化钾(K+,60毫米)或中等(基底)(D)。肺片sm-myosin溶解产物进行分析,使用β-actin作为加载控制。墨迹是代表3所示实验。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0065580.g005

探讨支气管收缩是否参与methacholine-induced TGF-β收缩蛋白表达和释放,我们抑制肌动蛋白聚合latrunculin A latrunculin防止增加针对乙酰甲胆碱和TGF-βsm-myosin表达式1(图5 b)。此外,释放的生物活性TGF-β醋甲胆碱被latrunculin抑制,而latrunculin TGF-β没有直接影响1全身Smad-3磷酸化(图5 c)。此外,抑制TGF-βI型受体激酶与SB431542防止TGF-βsm-myosin诱导的表达增加1或醋甲胆碱(图5 b)。总的来说,这些发现表明醋甲胆碱引起的支气管收缩导致TGF-β的释放,增强收缩蛋白的表达。

建立收缩蛋白表达的增加是否只看到收缩受体激动剂乙酰甲胆碱,我们也刺激肺片与收缩受体激动剂组胺(,1µM)和氯化钾(氯化钾,60毫米)抑制剂的存在与否或SB431542 latrunculin。sm-myosin的表达在应对收缩增强受体激动剂乙酰甲胆碱、组胺和氯化钾,这些反应是同样被latrunculin和SB431542 (图5 d)。这表明,支气管收缩导致释放TGF-β收缩蛋白的诱导表达sm-myosin无论收缩受体激动剂使用。

讨论

经过验证的肺片作为在体外模型TGF-β诱导气道平滑肌改造,我们研究了诱导气道重塑的机制在支气管收缩反应。我们表明,收缩引起的支气管收缩受体激动剂包括乙酰甲胆碱、组胺和氯化钾,刺激的释放TGF-β从肺组织,导致一个增强的表达由气管平滑肌收缩表型标记,类似于什么是观察哮喘患者[27],[28]。

气道重构是一个多细胞的过程中,结构和信息交互和cell-matrix交互发挥重大的监管作用[29]。因此,肺片似乎是一个有用的在体外模型来研究多细胞改造过程大多数信息接触,和cell-matrix交互是保存在这个模型。这对其他器官系统已经建立,如肝片,CCl乙醇或4诱导肝纤维化可以充分模仿[30]- - - - - -[32]。肺片在文化的另一个优点是sm-myosin表达式的损失,是典型的人工气道平滑肌细胞没有观察到。豚鼠肺片的选择目前的研究是基于观察气道反应乙酰甲胆碱在豚鼠肺片非常类似于人体组织[4]。此外,豚鼠有很大的解剖和功能的相似之处比人类航空公司包括小航空公司与其他动物的存在[24]。

肺片的使用也有一些局限性。肺片作为一个主要的缺点在体外模型包括缺乏循环和水肿的形成[33]干扰的能力,明确的可溶性因子,包括TGF-β。此外,急速免疫法与本研究相关的持续支气管收缩可以发生在2天的文化与bronchoconstricting受体激动剂。然而,随着支气管狭窄仍可见文化的两天之后,其他收缩受体激动剂,包括组胺和氯化钾生产非常相似的结果,我们认为,即使快速抗药反应可能发生在某种程度上,它对整体的影响的结论是小的。此外,期间肺片可以保持文化是有限的。尽管如此,经过2天的文化,我们还测量了低水平的LDH释放和没有线粒体活动下降,表明良好的生存能力。非常重要的是,我们观察到一个回应TGF-β收缩蛋白表达增加1气道重塑的一个标志,凸显了这个文化系统的有效性。总的来说,这个模型提供了一个很棒的角度为未来的实验,特别是在学习研究问题的完整信息和cell-matrix互动是必不可少的。

TGF-β的多效细胞因子是一个重要的生长因子参与哮喘气道重塑过程[12]。增加TGF-β在肺组织的表达和支气管肺泡灌洗液的哮喘患者[34]。TGF-β促进气道重塑的重要方面,包括成熟的气道平滑肌细胞收缩表型标记蛋白的表达增加[35]。事实上,我们之前显示TGF-β诱发的表达增加收缩表型标记sm-α-actin和calponin人类气管平滑肌细胞在时间的方式,表现为协同作用增强的毒蕈碱的受体刺激[13],[14]。慢性哮喘患者显示增加sm-α-actin和肌球蛋白轻链激酶染色的航空公司[27],[28]。同意这些数据,我们表明,肺片在文化展览的时间-浓度增加收缩表型标记包括sm-myosin,以应对TGF-β。这意味着TGF-β反应肺片在气道平滑肌细胞所观察到的类似系统。

我们的研究提供重要的见解收缩蛋白的诱导表达背后的机制以应对bronchoconstricting代理。我们先前的研究通过培养气道平滑肌细胞发现毒蕈碱的受体刺激没有影响细胞增殖,细胞因子的生产或收缩蛋白表达自己的但要求功能与生长因子相互作用(例如PDGF-AB, TGF-β),细胞因子(例如TNF-α)或香烟烟雾提取物诱导这些细胞反应[13],[36]- - - - - -[39]。合作的监管由TGF-β收缩蛋白表达,醋甲胆碱被发现与增强GSK-3和4 e - bp1磷酸化有关[13]。目前的研究表明,肺片,保存哪些信息交互和收缩性,引起的支气管收缩醋甲胆碱能充分促进收缩蛋白的表达,包括sm-myosin和calponin,解释为释放生物活性TGF-β可能功能与醋甲胆碱诱导收缩表达式。其他bronchoconstricting代理,包括组胺和氯化钾也足以导致这些影响。值得注意的是,醋甲胆碱引起的支气管收缩并没有增强sm-α-actin收缩蛋白的表达。我们之前证明sm-α-actin积极地区豚鼠气道大sm-myosin积极表明肌动蛋白阳性面积相比,肌凝蛋白-细胞存在于平滑肌包[10]。此外,allergen-challenged豚鼠显示更大的感应sm-myosin表达式sm-α-actin相比[10]。虽然我们不能直接比较过敏原与醋甲胆碱的影响,与我们当前的数据显著的相似之处,表明sm-α-actin不如sm-myosin容易监管在豚鼠气道。TGF-β响应本身也是影响肌动蛋白聚合抑制剂latrunculin,表明基底的航空公司,导致释放TGF-β或需求诱导平滑肌肌动蛋白聚合的特定的基因表达,也为了应对TGF-β[40]- - - - - -[42]。综上所述,这表明支气管收缩引起生物活性TGF-β的释放,导致收缩蛋白表达。

醋甲胆碱引起的支气管收缩反应或屋尘螨,epithelial-TGF-β水平增加患者的哮喘[9]。航空公司的人类肺活检,疣状显示,TGF-β主要是局部支气管上皮车厢,和一定程度上的平滑肌细胞[43]。机械刺激支气管上皮细胞诱导TGF-β的释放,牙龈过程中扮演了重要角色在哮喘[8]。针对静态跨膜压力,鼠上皮细胞也促进TGF-β的基因表达,endothelin-1 response-1和早期的增长[44]。此外,机械刺激诱导上皮细胞纤连蛋白产量的增加[5]。这可能表明TGF-β的主要来源在气道上皮细胞,这释放生长因子在支气管收缩机械刺激的反应。尽管如此,气道平滑肌也可能发挥重要作用作为爱说三道四的人等人表明,气道平滑肌细胞可以激活TGF-β通过αVβ5整合蛋白支气管收缩的影响在体外[26]。此外,阻断αVβ5整合蛋白的减少增加了ASM层引起的在活的有机体内ovalbumin-challenged小鼠模型[26]。此外,在应对收缩受体激动剂lysophosphatidic酸醋甲胆碱,哮喘患者气道平滑肌细胞释放TGF-β在更大程度上比气道平滑肌细胞健康对照组[26]。因此,上皮细胞释放TGF-β和随后的激活潜在的形式转变为α的生物活性形式Vβ5整合蛋白对气管平滑肌的支气管收缩的影响机制中观察到我们的学习。

我们的发现慢性哮喘管理具有重要意义。支气管收缩可以促进气道重构,支气管扩张剂药物的好处可能超过他们的急性对肺功能的影响。在体外和在活的有机体内研究支持这一假说。在小鼠哮喘模型,水平TGF-β减少在支气管肺泡灌洗液(BALF)抗胆碱能药物tiotropium。此外,tiotropium抑制气管平滑肌增厚和气道纤维化在这个模型[45]。Tiotropium治疗也抑制收缩蛋白表达的增加,气道平滑肌层增厚,以回应allergen-challenge在几内亚猪[10],[11]。事实上,抗胆碱能类有多个抗炎和anti-remodelling属性在动物研究(进行审核,看Kistemaker, Oenema el al。[46]),然而,这种现象的潜在机制仍不清楚。β-Agonists,广泛规定作为哮喘患者支气管扩张剂的药物,也可以减少,虽然只是部分,TGF-β-induced人类支气管平滑肌细胞收缩蛋白表达[47]和其他改造过程[12]。

总之,使用肺片作为在体外模型中,我们的研究结果表明,支气管收缩可以诱导释放TGF-β促进收缩蛋白表达。因此,我们的数据表明,支气管扩张剂可能有益影响气道重构,在未来的研究应遵循。还我们的数据表明,使用精密切肺片是一个合适的模型来研究在支气管收缩反应气道重塑过程。

确认

工作已经执行的一部分在格罗宁根大学医学中心成像和显微镜中心(UMIC)。

作者的贡献

构思和设计实验:t h . Maarsingh GG h·穆尔RG。进行了实验:陶女士分析数据:道RG。造成试剂/材料/分析工具:GG Maarsingh。该报写道:道RG。

引用

  1. 1。Postma DS,华W(2006)重构在哮喘和慢性阻塞性肺病。Proc是Thorac Soc 3: 434 - 439。
  2. 2。Al-Muhsen年代,小约翰逊,哈米德Q在哮喘(2011年)重建。J过敏Immunol 128: 451 - 462。
  3. 3所示。Wiggs BR, Bosken C,削减PD,詹姆斯,何克JC(1992)的模型气道狭窄在哮喘和慢性阻塞性肺疾病。145年我和牧师说:1251 - 1258。
  4. 4所示。党卫军,白TR,贝茨JH,黑杰,布朗RH, et al。(2007)气管平滑肌动力学:在哮喘气道阻塞的常见途径。欧元和J 29日:834 - 860。
  5. 5。斯沃茨,Tschumperlin DJ,卡姆RD,德拉赞JM(2001)机械应力是引起不同的细胞类型之间的沟通矩阵重构。98年《美国国家科学院刊年代:6180 - 6185。
  6. 6。Tschumperlin DJ,碎片JD,斯沃茨妈,西尔弗曼,哈雷KJ, et al。(2002)支气管上皮压缩调节MAP激酶信号和HB-EGF-like生长因子表达。是杂志肺细胞摩尔杂志282:L904-L911。
  7. 7所示。Tschumperlin DJ,德拉赞JM(2001)机械刺激气道重塑。164 J和保健:S90-S94。
  8. 8。Tschumperlin DJ,碎片JD,菊池T,德拉赞JM(2003)机械应力触发从支气管上皮细胞选择性释放纤维介质。我和细胞杂志28:142 - 149。
  9. 9。Grainge CL,刘LC、病房JA Dulay V, Lahiff G, et al。(2011)支气管收缩的影响在哮喘气道重塑。郑传经地中海J 364: 2006 - 2015。
  10. 10。Gosens R, Bos Zaagsma J,穆尔H(2005)保护作用的溴化tiotropium气管平滑肌的发展重构。171 J和保健:1096 - 1102。
  11. 11。Bos坚持,Gosens R, Zuidhof AB, Schaafsma D, Halayko AJ, et al。(2007)抑制allergen-induced tiotropium和布地奈德:气道重构的一个比较。欧元和J 30: 653 - 661。
  12. 12。Halwani R, Al-Muhsen年代,Al-Jahdali H,哈米德问(2011)的角色转变增长factor-β在哮喘气道重塑。我和细胞杂志44:127 - 133。
  13. 13。Oenema助教,Smit M, Smedinga L, Racke K, Halayko AJ, et al。(2012)毒蕈碱的受体刺激增强TGF-β1-induced气道平滑肌细胞收缩蛋白表达。是杂志摩尔杂志L589-L597肺细胞。
  14. 14。戈德史密斯,宾利JK,周L,贾Y,比KN, et al。(2006)将增长factor-β诱发气道平滑肌肥大。我和细胞杂志34:247 - 254。
  15. 15。陈G,哈利勒N (2006) TGF-β1增加气道平滑肌细胞增殖map激酶的磷酸化。和Res 7: 2。
  16. 16。Baarsma哈,Menzen MH Halayko AJ,穆尔H, Kerstjens哈,et al。(2011)β-catenin TGF-β1-induced所需信号是通过气道平滑肌细胞细胞外基质生产。是杂志肺细胞摩尔杂志301:L956-L965。
  17. 17所示。Camoretti-Mercado B,刘HW Halayko AJ,活力四射SM,凯尔JW, et al。(2000)的生理控制顺利通过监管核易位血清反应阳性基因表达的因素。275年J临床生物化学:30387 - 30393。
  18. 18岁。Camoretti-Mercado B,费尔南德斯DJ,位于年代,丘吉尔J,马L, et al .(2006)抑制转化生长因子依赖factor-β-enhanced血清反应由SMAD7转录。281年J临床生物化学:20383 - 20392。
  19. 19所示。Halayko AJ, Tran T, Gosens R(2008)表型和功能可塑性的气管平滑肌:角色的小窝和窖蛋白。Proc是Thorac Soc 5: 80 - 88。
  20. 20.Wahl SM(1994)将增长factor-β:好的,坏的和丑陋的。J Exp 180: 1587 - 1590。
  21. 21。赖特D, Sharma P Ryu MH Risse PA,非政府组织M, et al。(2012)模型来研究气道平滑肌收缩体内,体外和体外:了解哮喘的影响。Pulm杂志26:24-36。
  22. 22。老Ceresa CC,诺克斯AJ,约翰逊(2009)使用一个三维细胞培养模型来研究气道平滑muscle-mast细胞在气道重塑的交互。是杂志肺细胞摩尔杂志296:l1059 - 66。
  23. 23。Halayko AJ Camoretti-Mercado B·福赛斯SM,维埃拉我,米切尔RW, et al。(1999)发散在气道平滑肌分化路径文化:诱导功能收缩细胞。是杂志276:L197-L206。
  24. 24。Ressmeyer AR,拉尔森AK, Vollmer E, Dahlen SE, Uhlig年代,et al。(2006)描述的豚鼠肺片:展示与人体组织进行比较。欧元和J 28: 603 - 611。
  25. 25。Gosens R, Baarsma哈,Heijink IH, Oenema助教,Halayko AJ, et al。(2010)从头合成的β-catenin通过h和MEK调节气道平滑肌的增长。美国实验生物学学会联合会24:757 - 768。
  26. 26岁。爱说三道四的人,约翰•AE快活L, Habgood,土耳其宫廷J, et AL。(2011)整合素αvβ5-mediated TGF-β激活在哮喘气道平滑肌细胞。J Immunol 187: 6094 - 6107。
  27. 27。贝纳永L, Druilhe Dombret MC, Aubier M, Pretolani M(2003)气道结构改变有选择地与严重哮喘有关。167 J和保健:1360 - 1368。
  28. 28。Leguillette R, Laviolette M, Bergeron C, Zitouni N,教授的P, et al。(2009)肌球蛋白,transgelin,和肌球蛋白轻链激酶:表达式和函数在哮喘。179 J和保健:194 - 204。
  29. 29。Tschumperlin DJ,德拉赞JM(2006)慢性机械力对航空公司的影响。为杂志68:563 - 583。
  30. 30.平顶山C, Lepreux年代,峡谷C, Sarrazy V,钢坯F, et al。(2010)纤维发生的细胞表型修改改造期间正常的人类肝脏在培养和病理切片。肝脏Int 30: 1529 - 1540。
  31. 31日。Westra IM,范教授BT Groothuis通用,Olinga P(2012)评价组织纤维化的展示片。Xenobiotica 43: 98 - 112。
  32. 32。van de Bovenkamp M, Groothuis通用,Draaisma, Merema MT, Bezuijen霁,et AL。(2005)展示肝片作为一种新的模型来研究toxicity-induced肝星状细胞激活生理环境。Toxicol Sci 85: 632 - 638。
  33. 33。Henjakovic M,马丁C, Hoymann HG, Sewald K, Ressmeyer AR, et al。(2008)体外肺功能测量在展示肺片(pcl)化学乙酰老鼠代表一个合适的替代体内研究。Toxicol Sci 106: 444 - 453。
  34. 34。Vignola, Chanez P, Chiappara G, Merendino A, E, et al .(1997)将增长factor-β表达式在哮喘和慢性支气管炎的粘膜活检。156 J和保健:591 - 599。
  35. 35。Halayko AJ,索尔维J(2001)平滑肌细胞表型可塑性的分子机制。J:杂志90:358 - 368。
  36. 36。Gosens R,内尔SA Grootte Bromhaar MM,麦凯年代,Zaagsma J, et al。(2003)毒蕈碱的M3受体调节有丝分裂发生在气管平滑肌的胆碱能合作。我和细胞杂志28:257 - 262。
  37. 37岁。Gosens R, Dueck G,校长E, Nunes RO, Gerthoffer WT, et al .(2007)合作的监管GSK-3毒蕈碱的和PDGF受体与气道肌细胞增殖有关。是杂志肺细胞摩尔杂志293:L1348-L1358。
  38. 38。Gosens R,里克•D,穆尔H, Ninaber DK,瑞芭KF, et al。(2009)毒蕈碱的M3受体刺激增加香烟烟雾诱发引发人类气管平滑肌细胞分泌。欧元和J 34: 1436 - 1443。
  39. 39岁。Nanninga我Oenema助教,Kolahian年代,里克•D, Hiemstra PS, et al。(2010)炎性机制的毒蕈碱的受体刺激气道平滑肌。和Res 11: 130。
  40. 40。Somlyo美联社,Somlyo AV(2000)信号转导,g, rho-kinase和蛋白质磷酸酶平滑肌和non-muscle肌凝蛋白II。杂志522:177 - 185。
  41. 41岁。Rosenfeldt嗯,领导的Y,沃特森KR,没吃KS, Panettieri RA Jr, et al。(2003) Sphingosine-1-phosphate刺激人类气管平滑肌细胞的收缩。美国实验生物学学会联合会J 17: 1789 - 1799。
  42. 42。Sandbo N,刘,Kach J, Ngam C,邱DM, et al。(2011)延迟应力纤维介导肺myofibroblast分化形成应对TGF-β。是杂志肺细胞摩尔杂志301:L655-L666。
  43. 43。Magnan,危险性,雨B, Peuchmaur M,蒙蒂G, et al .(1994)将增长在正常的人类肺:factor-β优惠支气管上皮细胞的位置。胸腔49:789 - 792。
  44. 44岁。莱斯勒B,李RT、Randell SH。德拉赞JM,卡姆RD(2000)的分子反应大鼠气管上皮细胞跨膜压力。是杂志肺细胞摩尔杂志278:L1264-L1272。
  45. 45岁。太年代,Oda N, Yokoe T,田中,山本Y, et al。(2010)溴化tiotropium对气道炎症的影响和改造在哮喘小鼠模型。Exp过敏40:1266 - 1275。
  46. 46岁。Oenema TA, Kistemaker LE meur H, Gosens R(2012)监管的气道炎症和重塑毒蕈碱的受体:观点抗胆碱能治疗哮喘和慢性阻塞性肺病。生命科学91:1126 - 1133。
  47. 47岁。——戈德史密斯,赫汉森MB, Wolbert MP,宾利JK(2007)调节气道平滑肌alpha-actin表达式由糖皮质激素。是杂志肺细胞摩尔杂志292:L99-L106。