文摘
阻塞性肺疾病患者的α1抗胰蛋白酶(AAT)缺乏症(AATD)早些时候发生在生命而没有AATD患者。进一步理解这一点,本研究的目的是调查是否AATD改变嗜中性粒细胞特色礼物,由于等离子体的具体不足,而non-AATD慢性阻塞性肺病。
这项研究集中在中性粒细胞质膜,利用label-free串联质谱,中性粒细胞膜蛋白质组的比较在1 s (FEV用力呼气量1移植物AATD non-AATD慢性阻塞性肺病和AATD患者接受每周AAT增强治疗每组(n = 6例)。改变蛋白质表达AATD证实了免疫印迹,ELISA和荧光共振能量转移分析。
嗜中性粒细胞膜蛋白质组在AATD明显不同于慢性阻塞性肺病,增加初级颗粒蛋白的丰度和活动包括在AATD中性粒细胞弹性蛋白酶在细胞表面。所涉及的信号机制提高脱粒Rac2激活,随后导致proteinase-activated受体2由丝氨酸蛋白酶激活和增强活性氧产量。在体外和体外,AAT减少主要颗粒释放和方差描述等离子体膜是解决post-AAT扩张治疗在活的有机体内的影响,显著改变了AATD中性粒细胞膜蛋白质组的细胞non-AATD慢性阻塞性肺病。
这些结果提供强有力的洞察中性粒细胞驱动机制与AATD相关的呼吸道疾病。治疗AAT增强改性膜蛋白质组的一个典型的慢性阻塞性肺病细胞,对临床实践与影响。
文摘
中性粒细胞的COPD患者由于alpha - 1抗胰蛋白酶缺乏症”说明一个膜蛋白改变配置文件和初级颗粒胞外分泌模式相比,细胞慢性阻塞性肺病患者没有AATD,增加治疗的缺陷修正http://bit.ly/3balrrT
介绍
α1抗胰蛋白酶(AAT)是公认的有效的丝氨酸蛋白酶抑制剂,主要是中性粒细胞弹性蛋白酶(1]。AAT主要由肝细胞产生并释放到循环,产生等离子体浓度约为1.5 g·L−1。AAT不足(AATD)产生AAT水平低是一个遗传风险因素发展的慢性阻塞性肺疾病(COPD)。肺气肿,经常以计算机断层扫描(CT) (2AATD的),是一个重要的特性,传统panacinar在自然界中,与主要在慢性阻塞性肺病non-AATD小叶中心的疾病。AAT扩张治疗,包括静脉注入等离子体净化人类AAT,证明肺密度率减少损失(3,4]。此外,改善生化的影响双AAT剂量(120毫克公斤−1·周−1)AATD最近描述(5]。
尽管AATD患者肺部疾病通常开始在早期阶段与COPD患者相比,生活没有AATD,广泛的研究已经进行区分AATD和慢性阻塞性肺病non-AATD表型。这些研究包括评估并发症和生存post-lung移植(6),血浆和尿液生物标记(7,8),肺康复(2),生活质量(9)和差异适应疾病(10]。气道嗜中性与没有AATD慢性阻塞性肺病的特征,与中性粒细胞数量在增加上皮衬里无烟AATD患者与健康对照组相比,液,涉及许多与疾病相关的病理特性,包括无对手的嗜中性粒细胞elastolytic活动(11]。此外,气道嗜中性甚至被描述在AATD受试者患有轻度肺功能障碍(12]。增加中性粒细胞反应的可能的解释AATD提出的研究证明AAT具有消炎独立anti-protease活动的关键。这是特别相关的关于修改基本中性粒细胞功能包括白三烯(LT) B4全身的附着力(13],趋化性,以应对白介素8 (IL) (14二、三级颗粒),脱粒通过肿瘤坏死因子(TNF) -α信号(15),氧化激活(16)和AAT的正常化proapoptotic信号循环中性粒细胞(17]。以往的经验显示,AAT结合中性粒细胞等离子体膜,局部膜脂质筏(14]。这提出的问题是否AAT AATD-COPD增加治疗患者可以绑定循环AATD细胞在活的有机体内和修改AATD中性粒细胞non-AATD COPD的细胞类型。对于这一分析,我们选择检查中性粒细胞质膜,代表之间的界面细胞和它的环境,在很大程度上决定了细胞对刺激的反应。本研究的目的是为了执行第一个蛋白质组学分析等离子体膜的中性粒细胞AATD-COPD与慢性阻塞性肺病non-AATD个人相比,并阐明AAT增强治疗的影响。最后,我们的目标是识别的结果改变了膜蛋白表达对中性粒细胞的功能。
材料和方法
研究设计
道德博蒙特医院的机构审查委员会的批准和书面知情同意收购获得所有参与者(批准号18/52)。健康志愿者(表1)表明没有任何疾病和无呼吸道症状;没有吃药,所有非吸烟者和证明MM表型与血清AAT浓度在正常范围内(1.5 g·L1)。Z-allele AATD患者(纯合,不吸烟者)是从爱尔兰alpha - 1抗胰蛋白酶缺乏症”招募注册表(表1),分为健康AATD个人(1 s,用力呼气量1)> 80%)预测,AATD患者气道阻塞(FEV1< 80%预测与阻塞性肺量测定法模式(即。FEV1/用力肺活量(FVC)比< 0.7)和肺气肿CT),或AATD患者增加治疗收到CSL等离子体净化AAT贝林(Zemaira)静脉注射的剂量服用60 mg·公斤−1每周体重。不吸烟的COPD患者(FEV1< 80%预测,阻塞性模式即。FEV1/ FVC比< 0.7和肺气肿与血清AAT CT)浓度在正常范围内招募了来自博蒙特医院(表1)。在前6周获得血液样本,所有患者恶化自由。
中性粒细胞分离和细胞化验
血液采样方法对等离子体和中性粒细胞分离、质膜隔离,定量label-free液体chromatography-tandem质谱质/女士,免疫印迹分析和ELISA中概述补充材料和方法。荧光共振能量转移(FRET)分析18)和细胞色素c还原分析(19)详细描述补充材料和方法部分。
统计分析
结果表示为±扫描电镜生物复制或独立实验如上所述在每个图的传说。数据分析使用GraphPad PRISM 8.0(美国圣地亚哥,CA)。学生的配对t检验分布在正常使用,当比较两个匹配组之间。单向或双向方差分析是用于独立组比较,紧随其后事后在适当的地方图基的多重比较检验。采用非参数魏克森讯号等级测试数据不正常(Shapiro-Wilk测试)。结果被认为是重要的时p < 0.05。使用初期发育蛋白质组学研究结果分析软件。单向重复措施(试)方差分析被用于依赖组比较。假定值的调整使用Benjamini-Hochberg错误发现率(罗斯福)为每一个蛋白质识别。差异蛋白质表达被定义为≥1.5倍的变化表达的假定值< 0.05。
结果
循环中性粒细胞质膜蛋白质组的改变在AATD与慢性阻塞性肺病
我们试图找出差异相比,AATD患者中性粒细胞质膜蛋白质组与慢性阻塞性肺病non-AATD (表1)。在推荐的时候,所有AATD患者胸部成像显示肺气肿,阻塞性肺量测定法(意味着FEV140.5±14.2%预测)减少了一氧化碳扩散能力(的意思DLCO38.3±7.01%预测)。循环血浆AAT水平测定常规浊度测定法,并在较低的范围内对所有六名AATD患者(0.29 g·L−1)。此外,AAT表型测试等电聚焦(IEF)揭示了特征Z-AAT蛋白质作为能源论坛三个合作,乐队,Z2, Z4, Z6,经典的阴极的转变(图1一个)。FEV1移植物慢性阻塞性肺病的人没有潜在的混杂并存病也招募了(n = 6)。能源论坛的合作,这些个体的两个决心是MZ杂合的,因此排除在进一步分析(n = 4, FEV的意思141±11.6%预测)。中性粒细胞质膜分数是由蔗糖梯度超速离心法分离纯度的孤立的分数CD16b经免疫印迹(图1 b)。标签免费串联MS / MS蛋白质组学分析后用胰蛋白酶消化的蛋白质。平均产量860蛋白质(范围765 - 1013),确定蛋白质的大小从5 kDa 434 kDa。慢性阻塞性肺病的蛋白质组学分析等离子体膜相比,中性粒细胞AATD展示15蛋白质差异表达(> 1.5倍变化;方差分析p < 0.05)。无人监督的皮尔森分层聚类分析差异表达蛋白质的证明增加丰富的质膜分数AATD患者(图1 c)。值得注意的是,15个差异表达的蛋白质,八个被确定为中性粒细胞颗粒的成分(补充表S1)[20.]。特别感兴趣的,中性粒细胞质膜分数从AATD个人证明增加丰富的关键主要颗粒成分髓过氧化酶(MPO、褶皱变化3.3;p = 0.03)和杀菌/通透性增加蛋白(BPI,褶皱变化8.4;p = 0.02) (图1 d)。总的来说,这些结果表明膜相关蛋白水平的变化循环从AATD患者中性粒细胞对慢性阻塞性肺病,有证据显示克隆中增加从初级水平的蛋白质颗粒。
增加释放AATD初级颗粒酶
找到后水平的提高颗粒与AATD中性粒细胞的质膜,相关的蛋白质的过程主要颗粒脱粒比较AATD和健康的控制(HC)细胞之间。虽然MPO,主要颗粒的标记,也同样表现在整个细胞溶解产物(补充图S1),基底如果和TNF /N-Formylmethionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP)释放MPO水平和BPI的刺激,和额外的初级颗粒标记蛋白酶3 (PR3)增加出现在上层清液AATD中性粒细胞(图2一个)。作为西方墨点法只有半定量,随后的实验评估ELISA MPO水平和中性粒细胞弹性蛋白酶释放。对于这个分析,健康对照组的中性粒细胞,AATD (FEV1> 80%),AATD (FEV1< 80%)和non-AATD FEV COPD患者匹配1比较。Post-10最小刺激和相对于如果细胞,结果显示显著增加的脱粒细胞外MPO水平细胞上清液AATD (FEV1< 80%),与健康对照组相比(p = 0.04)或AATD (FEV1> 80%)(p = 0.03) (图2 b)。此外,显著增加水平的脱粒发现中性粒细胞弹性蛋白酶在细胞上清液的AATD (FEV1< 80%),与健康对照组相比(p = 0.0006)或non-AATD慢性阻塞性肺病(FEV1< 80%)(p = 0.006) (图2 c)。此外,通过调查膜结合中性粒细胞弹性蛋白酶水平为分析、健康控制细胞相比,结果显示显著增加等离子体膜结合AATD (FEV中性粒细胞弹性蛋白酶活动1< 80%)细胞静止10分钟后(p = 0.01)和肿瘤坏死因子/ fMLP刺激(p = 0.01) (图2 d)。
Rac2的核心作用主要颗粒胞外分泌被描述(21),峰值GTP-bound Rac2活动发生在30年代和5分钟的刺激22]。在最近的研究中,TNF水平/ fMLP刺激的活性鸟苷Rac2增加中性粒细胞溶解产物AATD (FEV1< 80%)个人与健康对照组相比(p = 0.02) (图3)。此外,通过包含Rac的抑制剂,NSC23766(50μM)和细胞外MPO的量化或中性粒细胞弹性蛋白酶ELISA, MPO和嗜中性粒细胞弹性蛋白酶脱粒AATD细胞显著减少(p = 0.01, p = 0.001) (图3 b)。总的来说,这些结果表明,Rac2 AATD中性粒细胞激活改变,这可能会大大有助于增加主要颗粒的脱粒。
中性粒细胞弹性蛋白酶诱导超氧化物阴离子生产
我们试图探索增加AATD初级颗粒胞外分泌的结果,与关注中性粒细胞弹性蛋白酶介导NADPH氧化酶激活和增强O2−生产。利用细胞色素c还原试验,当分析对气道阻塞,在O没有差别2−生产如果中性粒细胞的健康控制、健康AATD个人(FEV1> 80%)或与航空公司建立疾病(FEV AATD1< 80%)(图4)。此外,fMLP(100海里)只差的NADPH氧化酶激活健康控制或健康AATD中性粒细胞,证实这些细胞的un-primed状态(图4)。相比之下,然而,fMLP诱导显著增长了1.8倍2−生产的细胞AATD患者呼吸道疾病,建立与通畅AATD相比细胞(2.1±0.2 nmol O2−与1.2±0.3 nmol O2−每106细胞,分别;p = 0.015) (图4)。此外,当分析对TNF / fMLP刺激激活,在没有区别啊2−由健康的控制与AATD细胞与FEV来自个人1或non-AATD COPD患者(FEV > 80%1< 80%)(图4 b)。相比之下,然而,一个重要的区别是观察到O2−生产与FEV AATD细胞来自个人1< 80%健康的控制细胞(3.0±0.3 nmol O2−与2.1±0.2 nmol O2−每106细胞,分别;p = 0.01) (图4 b)。
它已经表明,中性粒细胞弹性蛋白酶的存在增加活性氧(ROS)的生产通过劈理的蛋白酶激活受体2 (PAR2) [23]。我们提出的中性粒细胞弹性蛋白酶在AATD中性粒细胞会导致增加活性氧的生产通过劈理的PAR2细胞表面。中性粒细胞弹性蛋白酶的确认可以在中性粒细胞激活PAR2,细胞(1×106)治疗嗜中性粒细胞弹性蛋白酶(250 nM)和PAR2水平评估通过流式细胞术(补充图S2)。中性粒细胞弹性蛋白酶对中性粒细胞证明显著减少三倍的存在PAR2在细胞表面(p = 0.01) (图4摄氏度),表明PAR2激活(23]。中性粒细胞弹性蛋白酶的了解:PAR2激活触发ROS生产,控制,non-AATD COPD患者中性粒细胞的健康(FEV1< 80%),AATD患者FEV1> 80%或AATD患者FEV1挑战与TNF / fMLP < 80%,中性粒细胞弹性蛋白酶,中性粒细胞弹性蛋白酶结合AAT(5或27.5µM)或PAR2抑制性抗体(10μg·毫升−1)(图4 d)。健康控制中性粒细胞的挑战与中性粒细胞弹性蛋白酶表现出显著增长了2.1倍2−生产与未经处理的细胞(p < 0.0001),抑制通过包含5µM产生影响(p = 0.05)或27.5µM AAT (p = 0.0001)或PAR2阻塞Ab (p < 0.0001) (图4 d)。此外,中性粒细胞AATD患者FEV1水平证明显著提高O < 80%2−在应对生产中性粒细胞弹性蛋白酶相比健康的控制细胞(p = 0.0005)或匹配FEV non-AATD COPD患者的中性粒细胞1(p = 0.03)。水平的增加2−生产的细胞AATD患者气道阻塞被显著地抑制AAT(5µM, p < 0.0001;27.5µM, p < 0.0001)和PAR2阻塞Ab (p < 0.0001) (图4 d)。总的来说,这些结果证实了中性粒细胞弹性蛋白酶介导PAR2激活和O2−生产,强调进一步维循环等离子AAT的好处。
的在体外外生AAT对特异表达的影响主要由AATD中性粒细胞颗粒释放
我们接下来研究了AAT的影响在体外中性粒细胞脱粒。通过免疫印迹分析细胞外游离的上层清液,对肿瘤坏死因子的释放MPO水平/ fMLP刺激被发现显著降低在AAT的浓度增加。除以2的浓度梯度µM 27.5µM AAT施加的抑制作用TNF / fMLP介导MPO释放减少50%观察6.8µM AAT,而27.5µM AAT进一步降低MPO释放约75% (p = 0.02) (图5)。外生AAT的影响(2或27.5μM)在肿瘤坏死因子/ fMLP诱导颗粒脱粒AATD细胞主要是下一个检查。MPO脱粒的增加5分钟后刺激显著抑制细胞在健康控制和AATD 27.5μM AAT(分别为p = 0.02, p = 0.002) (图5 b)。总的来说,这些实验演示AAT的生理能力水平影响TNF / fMLP诱导中性粒细胞脱粒过程,AATD免疫调节财产损害,并可能影响经AAT扩张治疗,这是下一个探索。
AAT扩张治疗在活的有机体内修改中性粒细胞质膜蛋白质组
随后的实验调查AAT是否增加治疗导致中性粒细胞质膜蛋白质组的改变在活的有机体内,具体地说,结果表明修改是否主要由外生AAT颗粒释放在体外,可以确认在活的有机体内。等离子体和中性粒细胞分离增加治疗(FEV AATD患者142.9±13%预测)。2天输液,AAT的循环血浆水平显著增加,与水平相比之前治疗(∼的最低点1.4 g·L−1和0.8∼g·L−1分别;p < 0.0001) (图6)。理解是否注入AAT结合循环嗜中性粒细胞质膜,膜AAT AATD中性粒细胞的表达谱是评估通过流式细胞术(图6 b)。结果显示显著增加的膜结合AAT在第二天发现后治疗(平均荧光= 39)与天0治疗前(意味着荧光= 10.2;p < 0.001)。我们进行蛋白质组学分析的质膜分数中性粒细胞分离循环AATD个人接受AAT增强治疗的最低点AAT水平(0天)和配对样本2天治疗后(n = 6)。串联MS / MS蛋白质组学分析确定66内在中性粒细胞蛋白差异表达在0和2天的AAT增加治疗(褶皱变化> 1.5;在方差分析p≤0.05)。其中,65年0天丰度增加。层次聚类分析进行差异表达蛋白质和提出的热图(图6 c)。展示了视觉表达差异的嗜中性粒细胞质膜蛋白质组在AAT的跨度为扩张治疗。
基因本体论生物过程聚类分析进行差异表达蛋白质使用在线基因本体工具大猩猩[24]。基因本体聚类分析通常导致冗余项,因此在线REVIGO(减少和想象基因本体)工具被用来概括和想象的结果25]。REVIGO用于生成丰富生物过程集群的网络图(补充图S3)。最有意义的当前研究中,蛋白质的差异表达组丰富参与胞外分泌(基因本体术语0006887,浓缩得分1.64;p = 0.0008,罗斯福调整q = 0.03)。31 65差异表达内在的嗜中性粒细胞蛋白与基因有关本体术语(补充表S2)。个别蛋白质是由他们UniProtKB号码,MPO和proteinase-3 (PR3)强调了作为代表的主要蛋白质颗粒。最值得注意的是,初级颗粒MPO和PR3的原型成分增加0天相比,第二天AAT增强治疗(p≤0.05,褶皱变化分别为2.6和2.7)(图6 d)。
我们下一个旨在验证蛋白质免疫印迹结果。中性粒细胞分离膜天0和AAT增强治疗的第2天每组(n = 6)。免疫印迹微显示出了明显下降(p = 0.02)和大量的MPO PR3 (p = 0.02)的膜分数AATD患者第二天与0天AAT增强疗法(图7)。赞同,烦恼的结果分析显示,AATD中性粒细胞说明水平显著降低膜相关的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶活动第二天治疗后没有治疗的患者相比,中性粒细胞(p = 0.007) (图7 b)。此外,水平有显著降低的活性鸟苷Rac2 2 post-augmentation疗法相比,天0天预处理(p = 0.04) (图7 c)。此外,在肿瘤坏死因子/ fMLP纯化从AATD患者中性粒细胞的激活AAT的第2天0和扩张治疗,显著降低MPO水平被脱粒AAT增强治疗的细胞外环境2天(p = 0.007) (图7 d)。值得注意的是,记录水平增加治疗组相比没有统计学上不同的健康控制细胞释放的水平,表明正常化脱粒过程的治疗后(图7 d)。
调查是否AAT增加治疗转换AATD中性粒细胞膜蛋白质组AAT足够的慢性阻塞性肺病的细胞,从而证实AAT增强的效果在活的有机体内相比,我们接下来的质膜蛋白质组中性粒细胞与慢性阻塞性肺病的AATD个人(n = 6) 2天post-intravenous增加治疗(第二天)(图7 e)。只有一个蛋白质显著差异表达分析(呃domain-containing蛋白1,褶皱变化2.9;p = 0.03),这表明AAT增加治疗导致降级点蛋白质组的状态更类似于慢性阻塞性肺病AAT足够的中性粒细胞(图7 e)。此外,颗粒组成蛋白质并不在这个比较差异表达。总的来说,这些结果说明每周Rac2 AAT注入激活的效应和脱粒在活的有机体内显然,两者都是有关AAT在等离子体的水平。
讨论
这项研究表明AAT的能力增加治疗AATD-COPD中性粒细胞对膜蛋白质组的影响,和阐发的机制的缺乏导致初级颗粒释放增加,导致PAR2激活和ROS生成。
利用串联女士分析,我们证明了循环的膜蛋白质组中性粒细胞AATD-COPD和FEV之间的不同1移植物non-AATD慢性阻塞性肺病的人。蛋白质组学结果显示初级颗粒蛋白包括MPO和BPI增加,中性粒细胞质膜的相互作用。因此,我们表明,在基线和对刺激的回应,中性粒细胞主要颗粒脱粒能力明显高于AATD患者中性粒细胞,MPO水平升高的,BPI PR3,中性粒细胞弹性蛋白酶释放而控制细胞。符合这一结果,显著增加的MPO水平和中性粒细胞弹性蛋白酶在AATD-COPD发现病人痰而AAT-sufficient慢性阻塞性肺病的人(26]。MPO释放增加的临床意义已经证明了MPO抑制剂的使用,减少了进程的肺气肿和小气道重构部分预防肺动脉高压时,显示一个潜在的治疗作用MPO抑制剂在阻塞性气道疾病的管理27]。目前的研究也证明中性粒细胞弹性蛋白酶活动增加AATD-COPD中性粒细胞表面与健康对照组相比。中性粒细胞弹性蛋白酶活动曾被证明能够诱导特异表达的分泌炎性刺激包括LTB4和引发11),从而生成一个周期的炎症。
以往的记录,囊性纤维化患者中性粒细胞(CF)释放更高层次的嗜中性粒细胞弹性蛋白酶与健康的控制细胞(28]。本研究的结果进一步扩展这一领域,表明这一现象并不是特定于CF, AATD-COPD细胞也释放显著水平的初级颗粒,MPO水平上升,BPI AATD细胞和中性粒细胞弹性蛋白酶检测膜,突显出断言炎症而不是内在细胞缺陷可能会造成。脱粒的MPO和中性粒细胞弹性蛋白酶从阻塞AATD患者中性粒细胞升高,比健康的控制细胞比例更大程度上,与高浓度的循环促炎介质中记录AATD [5]。是承认颗粒蛋白保持绑定到细胞表面时中性粒细胞的颗粒在胞外分泌与质膜融合。事实上,它已经表明,MPO结合膜通过CD11b / CD18 integrin-dependent机制(29日),中性粒细胞弹性蛋白酶可以重新绑定膜和液来自中性粒细胞(30.]。注意但是,虽然嗜中性粒细胞弹性蛋白酶被发现与中性粒细胞通过烦恼分析等离子体膜,蛋白质组学考试没有确定一个中性粒细胞弹性蛋白酶的差异。这种异常现象可能出现由于中性粒细胞弹性蛋白酶自我分解为质谱在蛋白质样品制备。嗜中性粒细胞脱颗粒的主要颗粒是由Rac2和本研究的测量GTP-bound Rac2 AATD中性粒细胞显著增加活动。有趣的是,尽管CF (28,31日)和AATD-COPD中性粒细胞分泌水平的提高主要颗粒,没有这样的相似性存在二级和三级颗粒释放;与健康的控制细胞相比,AATD [15)和CF细胞(32分别)释放更少。在CF,表明减少Rab27a激活导致减少二、三级颗粒释放,突显出不同的角色,Ras蛋白在中性粒细胞脱粒的规定,需要进一步研究探索他们的监管和参与气道疾病。
观察到过多的中性粒细胞脱粒AATD-COPD细胞促使我们的问题和可能的后果影响疾病进展。这不是一个简单的概念,然而,并不是所有AATD患者患有肺气肿或慢性阻塞性肺病甚至在那些有严重的缺AAT,肺病是可变的和最有可能的发展涉及到环境、职业或基因修饰符。尽管如此,气道氧化应激与困气,支气管炎的症状和肺功能损失(33]。基于先前发现的ROS生成后中性粒细胞弹性蛋白酶的激活PAR2疼痛的神经细胞(23),我们探讨中性粒细胞弹性蛋白酶激活中性粒细胞的PAR2结果证明重要的超氧化物阴离子生产。描述信号轴被包含抑制PAR2抑制性抗体和暗示PAR2拮抗剂可能作为新型抗氧化剂治疗阻塞性气道疾病,PAR2扮演了一个角色34]。另外,第二种方法可能包括调制的嗜中性粒细胞主要颗粒释放,从而消除PAR2兴奋剂的来源。与结果一致表明夸张脱粒反应AATD-COPD中性粒细胞在最近的研究中,AAT的生理水平显著降低初级颗粒胞外分泌的水平在体外证明了可检测的释放MPO水平。在中性粒细胞O AAT的效果2−生产扩大到5μM的中点。然而,虽然这AAT的浓度抑制过氧化物生产在体外,这可能并非如此在活的有机体内突变Z-AAT AATD患者可能聚合,具有减少anti-elastase能力(35]。AAT的免疫调节能力的好处在调节初级颗粒释放可能超越预防PAR2激活,AATD与自身免疫的发展和anti-neutrophil胞质抗体(ANCA) [36,37]。嗜中性粒细胞的主要抗原ANCA的目标包括组件主要颗粒包括胞吐MPO、PR3 [38),更很少,中性粒细胞弹性蛋白酶(39]。
支持在体外结果表明AAT调节初级颗粒释放的能力,我们从AATD-COPD孤立的等离子体和中性粒细胞患者接受AAT增强治疗。结果显示,2天post-augmentation治疗水平的循环AAT在健康控制正常范围(27.5μM),水平,显著提高了AAT发现绑定到膜的循环AATD嗜中性粒细胞。中性粒细胞质膜蛋白质组学和基因本体论差异的聚类分析的第2天0和AAT增加治疗显示降低质膜的表达MPO和PR3,表明减少初级颗粒释放。蛋白质组学研究结果证实了西方墨点法,AAT疗法可以减少旺盛Rac2激活,如图所示的绑定三磷酸鸟苷水平下降。在我们的研究中,AAT治疗扳平比分AATD-COPD中性粒细胞质膜蛋白质组COPD的细胞,所表示的一致的表达除了一个蛋白最初显示在第0天比较差异表达。结果的结论是明确的,证明AATD患者中性粒细胞膜而non-AATD COPD患者匹配FEV不足1是改变,很可能由于缺乏循环体。进一步指出,强调是AAT的影响在第二天的治疗和最突出的几乎所有穿了一天0。此外,快速的发现(随机、安慰剂对照试验增加治疗缺alpha -蛋白酶抑制剂)临床试验证实了60 mg·kg的好处−1·周−1AAT治疗肺气肿放射检查进展放缓,然而增加治疗并不阻止肺功能的下降。这表明可能需要重新评估设置剂量的60 mg·kg−1AAT,增加剂量比目前锻炼可能会导致增强临床益处,最近建议(5]。
许多应该讨论了本研究的局限性。首先,中层AAT等离子体水平的重要性和突变形式的人类AAT蛋白,观察在MZ -和SZ-AATD表型,中性粒细胞主要颗粒脱粒尚未完全解决,尽管我们的在体外数据显示与增加AAT滴定表现型改善。的流行的MZ和深圳表型AATD要大于ZZ表型在这项研究评估。因此,进一步的研究需要阐明中性粒细胞质膜改变,考虑到大量的人杂合的AATD [40]。此外,由于招聘标准的参与本研究的第二个限制是相对较少的AATD患者接受扩张治疗。尽管这个缺点,然而,这项研究提供了证据的影响注入AAT的质膜蛋白质组和脱粒过程循环嗜中性粒细胞。
总之,中性粒细胞从AATD患者最严重的ZZ突变说明造成的膜蛋白的改变配置文件增加Rac2激活,传授过多的初级颗粒脱粒。这个缺陷被治疗纠正AAT扩张治疗,大大改变了膜蛋白质组的影响,慢性阻塞性肺病non-AATD细胞。这些结果强调了重要的角色,AAT在调节中性粒细胞生物学和AAT的重要性增强AATD患者的治疗管理。
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补充方法和材料erj - 01678 - 2019. -补充
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我们感谢患者和健康志愿者慷慨地参与了这项研究。
脚注
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作者的贡献:美国兰德斯,t . McEnery k . McQuillan议员墨菲,o·科尔曼,m·亨利·p·霍金斯p .点击率、密纹唱片李维斯和净收益McElvaney研究设计。兰德斯,t . McEnery k . McQuillan议员墨菲,O.J. McElvaney, O.F. McElvaney, a . Bussayajirapong o·科尔曼和m .亨利进行实验,分析和解释数据。t . McEnery密纹唱片李维斯和净收益McElvaney写的手稿。
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利益冲突:净收益McElvaney报告赠款MRCG HRB融资方案,在进行这项研究的。
利益冲突:议员墨菲没有披露。
支持声明:支持这项工作,密纹唱片里夫斯承认资金从美国阿尔法一个医学研究基金会和慈善机构组织/健康研究委员会爱尔兰。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2019年8月23日。
- 接受2020年1月30日。
- 版权©2020人队