文摘
摘要肺发育不良(BPD)是一个早产的主要并发症,导致终身呼吸道发病率。美食家的研究调查了纵向健康状况极度早产出生的婴儿(EP;<怀孕26周)。我们的目的是描述的呼吸道微生物年轻人极度早产儿出生,有或没有新生儿桶,相比term-born匹配控制。
诱导痰收集从92年19岁的年轻人(51 EP和41控制)。典型的呼吸道病原体使用定量PCR检测。16 s rRNA基因测序完成74个样本(29 EP桶;9 EP没有桶;和36控制)。
早产组与桶最不同的细菌群落。Bacteriodetes的相对丰度,特别是普氏菌melaninogenica是早产组比对照组显著降低。这种下降是由一个无足轻重的平衡增加壁厚菌门。总普氏菌相对丰度与用力呼气量在1 s z分数(ρ= 0.272;p < 0.05)。典型的呼吸道病原体加载和流行之间的相似。
总之,极度早产与严重失调在青年不论新生儿呼吸道微生物桶的地位。这是一个转变的特点是社会组成远离Bacteriodetes表现在急剧下降普氏菌相对丰度。
文摘
我们第一次证明了极度早产导致明显失调气道微生物群与FEV在成年早期1阻塞性肺疾病的临床参数http://ow.ly/PYJS30myLP0
介绍
全球和国家生存的极度早产率稳步增长在过去的几十年中围产期和新生儿护理方面的进展;然而,摘要肺发育不良(BPD)的患病率居高不下(1,2]。桶是一种多因子的肺部疾病,主要在早产儿和发展可能导致终身呼吸道发病率。最初,病因学被认为是机械肺损伤,但最近更多的婴儿不成熟的一种“新”的桶被定义,特点是远端肺发育紊乱,逮捕alveolarisation,干扰正常vascularisation [3]。桶的长期后遗症包括阻塞性肺疾病和减少成年有氧能力,可以混淆,可以满足肺量测定的标准对哮喘和慢性阻塞性肺疾病(COPD) (4]。
美食家的研究是一个国家健康队列研究调查的结果在< 26周的早产儿在英国和爱尔兰在1995年3月和12月之间。这种独特的队列随访和评估为2.5,6,9,11,现在19岁(2,5,6]。11岁,出生的孩子极早产有更显著的胸部畸形,呼吸道症状、肺功能异常与气道阻塞的证据,通风不均匀性、气体捕获和气道高反应性和哮喘发病率的两倍,而他们的同学足月出生(5,7]。
研究提供了证据,细菌可能发挥作用在桶在早产儿的发展8- - - - - -11]。一个纵向研究描述特征的气道模式微生物生态失调桶前发展。这是特点是显著降低的丰富性和α-diversity时间;除了细菌群落组成的变化,与一个相对多元化和稳定的社区在早产婴儿没有开发桶(12]。然而,微生物演替扶持生态失调的程度描述的呼吸道微生物在婴儿期到晚年阶段没有被调查。另外,桶幸存者的呼吸道微生物如何不同于成年健康的微生物是未知的。本研究的目的是描述美食家的呼吸道微生物群在19岁,比较它与健康足月出生的同龄人的微生物。
材料和方法
批准的美食家研究是南安普顿和南西汉普郡研究伦理委员会5]。所有参与者给知情同意执行测试的生物样品与EPICure@19研究。
痰液样本收集和处理细节的描述补充材料。短暂,诱导痰收集从EPICure@19研究的92名参与者在他们后续访问19岁。鳞状上皮细胞的平均比例在一个整除的痰样本显微镜测量的质量控制。
样品被分配到三组基于参与者的病史;那些极度早产出生没有桶历史(EP没有桶);那些极度早产和新生儿出生桶(EP +桶);和全term-born参与者相同的年龄,曾被评为同学在早先的研究中对照组(美食家)。微生物调查失明组分配到分析完成。
宏基因组DNA提取500µL Sputasol-treated痰样本使用试剂盒DNeasy血液和组织工具包(试剂盒,曼彻斯特,英国)按制造商的协议。提取的消极控制用于痰诱导和稀释的盐水Sputasol也执行。一个模拟相等的比例组成的社区链球菌引起的肺炎写明ATCC 49619,流感嗜血杆菌写明ATCC 8468和莫拉克斯氏菌属复活写明ATCC 25240年作为一个积极的控制运行。
细菌的流感嗜血杆菌,复活的和肺炎链球菌使用多路复用量化定量PCR (q),如前所述[13]。每个测试生物的细菌负荷计算每毫升集落形成单位(CFU·毫升−1)的痰和平均技术为每个样本一式三份拍摄。提供更多的细节补充材料。
一个序列库是由放大V5-V7地区的细菌16 s核糖体rna从宏基因组DNA使用785基因引物和1175反向引物。每个样本都被分配一个独特的一对组合的标准Illumina公司双重索引引物(Sigma-Aldrich,吉林厄姆,英国),产生的74个样本的扩增子预期大小(504个基点)。PCR产品清理使用Agencourt AMPure XP珠子(贝克曼库尔特、威、英国)去除DNA扩增子< 200个基点,是量化使用量子位dsDNA HS工具包(表达载体,生活技术,佩斯利,英国)。样本汇集克分子数相等的比例在10纳米。测序进行使用Illumina公司MiSeq平台使用服装测序引物,MiSeq试剂盒v2(500次)和PhiX控制V3工具包作为内部控制测序(Illumina公司Inc .、埃因霍温、荷兰)。提取负控制和没有模板PCR控制(水)运行整个扩增和测序过程揭示任何潜在的污染。更多细节在PCR引物序列中提供补充材料。欧洲核苷酸序列数据存入档案;研究加入号码是PRJEB27216。
在生物信息学的分析中,我们采用了工作流由微生物建立辅助缝合配对读取,质量过滤读取Q < 30 10%以上的基地和长度< 350个基点,嵌合体检查(14]。后续步骤是通过QIIME管道(v.1.9.1) [15集群基于97%),序列相似性为操作分类单元(辣子鸡)和分类学分类被分配到辣子鸡使用open-reference OTU挑选对绿色煤电数据库(v.13_8)。OTU表当时稀薄/样品4000读删除四个样本< 1000读(1 EP +桶和三个控制)。α-和稀薄OTUβ-diversity指数计算表。适当的统计显著性测试是使用SPSS计算(23节)或QIIME包装器脚本。邮票(v2.1.3) [16)是用于可视化数据。每当适用的假定值使用Benjamini-Hochberg纠正错误发现率多重比较的方法。
结果
一般特征的参与者
诱导痰液样本收集从92年年轻人常见的参与者;51极度早产出生在< 26周的妊娠和41足月出生(对照组)。均值±sd年龄19岁±0.5年。微生物分析完成了74个样本的放大16 s rRNA基因:36控制和38极度早产;29人新生儿桶,定义为接收补充氧气或呼吸支持36周postmenstrual年龄。人口临床和整个群体的医疗数据和记录的74个参与者的样本测序在19年后续访问报告表1。
在排序队列内,用力呼气量在1 s (FEV1)显著低于EP +桶组比对照组(平均差−0.91 L, 95% CI 1.24−−0.59 L)和EP没有桶组(平均差−0.81,95% CI 1.31−−0.32 L)。此外,在调整年龄、性别和身体大小使用z得分,FEV1z分数的EP +桶组与对照组相比明显降低,EP没有桶组;意味着差异(95% CI)−1.55(−2.05 - 1.05−)和−1.13(1.88 - 0.37−−),分别。
自我报告哮喘的患病率相对较高的EP +桶组(59%)和对照组(38%),相比没有桶EP组(22%),尽管这没有达到统计学意义。稍后进一步讨论,很可能有显著的过度诊断“哮喘”,但我们并不认为道德停止哮喘治疗研究的目的。样本集合的时候,意味着±sd呼出一氧化氮分数(F伊诺)浓度是十亿分之16.59±14.10,25.57±27.71磅的早产和对照组,(p > 0.05)。均值±sd血液中嗜酸性粒细胞计数·μL 190±136细胞−1和232±156·μL细胞−1早产组和控制,分别(p > 0.05)。47%的EP组和对照组的50%规定吸入器。没有发现显著差异在三组对患者的数量规定支气管扩张剂吸入器,吸入糖皮质激素或那些使用抗生素治疗呼吸道问题在今年之前样本集合。男性和女性的数量,吸烟者和那些受到被动吸烟(>每周30分钟)三组相似。
微生物群落组成
细菌群落明显少多样和丰富的痰样本整个EP组比对照组;均值±扫描电镜超差1和费舍尔α指数之间的整个EP组和控制−39±13 (p < 0.05)和−分别为4.8±2.3 (p < 0.05), (补充图E1)。其他丰富和α-diversity指标包括观察辣子鸡和PD整个树的数量还显示显著减少多样化和丰富的微生物群EP组(补充图E2)。在EP组,观察到的趋势在所有前面提到的α-diversity指数表明,那些新生儿桶最多样化和丰富的微生物群落,而控制值最高(图1一个和b和补充图E2)。这一趋势是统计学意义只在测试时超1通过方差分析(p < 0.05)。然而,事后比较之间的差异EP组新生儿桶和控制是重要的(图1)。
主坐标分析的加权Unifracβ-diversity指数样本EP参与者聚集显著,无论新生儿桶状态;而控制样本被ANOSIM分散(p < 0.01和p < 0.05 PERMANOVA) (图1 c和补充图E1)。
细菌社区在门级是由厚壁菌门,其次是Bacteriodetes,然后变形菌门和放线菌。样品从EP组,有或没有桶,相对丰度明显降低(RA)的门Bacteriodetes相比对照组由克鲁斯卡尔-沃利斯检验(p < 0.05)。差异被无意义的增加补偿的相对丰度厚壁菌门(图2一个)。
更加关注微生物群落的组成在属水平,尽管自然个人间差异明显的痰从不同的参与者,在微生物概要文件的相对丰度普氏菌在EP组显著降低,而且没有桶,相比克鲁斯卡尔-沃利斯检验的对照组(p < 0.05) (图2 b和3)。这是无意义的和不一致的增加所抵消等属的相对丰度链球菌,韦永氏球菌属,罗思氏菌属和奈瑟氏菌属正常微生物群在航空公司(图2 b)。
普氏菌完全没有在两个消极的控制和RA出席0.4%提取负控制痰诱导矩阵,它有5198个读分为三个主要类群:丙酸菌属(RA 62%),葡萄球菌(RA 14%)和链球菌(RA) 6% (补充图E6)。Sputasol提取-控制了17读取和没有模板PCR -控制有两个读;相比之下,意味着±sd从研究样本24 089±5751读(图2 b)。这给了信心,环境污染的影响是最小的。的相对丰度普氏菌没有与鳞状上皮细胞的百分比的痰样本(斯皮尔曼ρ= 0.07,p = 0.61)。尽管如此,普氏菌关联与FEV明显吗1z分数(斯皮尔曼ρ= 0.272,p = 0.02) (图3 b),但不是自我诊断哮喘或使用哮喘吸入器(补充材料)。
挖掘序列数据,121操作(辣子鸡)属于属分类单位普氏菌,OTU 4458304的相对丰度占大多数的观察到的差异普氏菌学习小组之间的相对丰度(图3 c)。通过提取和基本的局部比对搜索工具(爆炸)搜索350 - bp代表序列的OTU反对国家生物技术信息中心(NCBI) 16 s rrna数据库使用核苷酸爆炸工具(17),相同的序列被确定为100%普氏菌melaninogenica压力(图3 d)。
使用多路qPCR加载和流行的气道细菌
加载和流行的三种细菌肺炎链球菌,流感嗜血杆菌和复活的在三个研究小组(类似图4)。EP +桶组中,28%的人肺炎链球菌,有14%流感嗜血杆菌和11%的生物都在一起;类似的模式在控制。均值±sd细菌负荷的肺炎链球菌和流感嗜血杆菌在这两组相似;4.44±0.1日志10CFU·毫升−1。EP没有桶组的历史,流感嗜血杆菌是最普遍的生物,57%的痰样本中发现这组±意味着什么sd负载4.51±0.88日志10CFU·毫升−1的痰。它被发现在36%的样本和21%的样品肺炎链球菌。肺炎链球菌是人口最多,±意味着什么sd细菌负荷4.96±1.08日志10CFU·毫升−1(图4)。
复活的是最普遍和最稠密的有机体。的平均负载复活的0.7日志10更高的EP +桶组与其他两组相比(p > 0.05,方差分析)。没有差异的患病率和负载的三个生物在整个学习小组在统计学上意义重大。
有显著相关性排序相对丰富的属莫拉克斯氏菌属和相应的qPCR细菌负荷(ρ= 0.472,p < 0.01;图5 c)。然而,相关性不显著嗜血杆菌和链球菌(图5一个和d)。这可以归因于共生体的存在这两个属的成员在正常痰呼吸道微生物群。在属嗜血杆菌,分为五个辣子鸡流感嗜血杆菌的相对丰度之间的关系流感嗜血杆菌辣子鸡测序和流感嗜血杆菌负载在qPCR统计学意义(ρ= 0.43,p < 0.01;图5 b)。比较的相对丰度进行排序qPCR负载和细菌数的定量模拟社区文化,Streptococcu年代占比例15%,嗜血杆菌未被充分代表的21% (图5 d)。进一步的数据敏感性和特异性的方法是提供的补充材料。
讨论
我们所知,这是第一个研究探讨呼吸道微生物在成人的幸存者相比,早产与足月出生的控制。迄今为止,先前的研究调查细菌和桶之间的关系涉及preterm-born婴儿(10- - - - - -12,18,19]。在当前的研究中,我们比较了呼吸道微生物在38个年轻人出生< 26周的妊娠(29人新生儿桶和九没有)和36 term-born控制,从同学招募6岁和11岁。
呼吸道微生物组剖面的三个学习小组是与先前的研究一致20.,21]。这是由厚壁菌门、Bacteriodetes变形菌门和放线菌。极度早产组显著减少多样化和丰富微生物群落与对照组相比。我们并没有发现显著差异极早产组的气道微生物组的概要文件,没有新生儿桶。两组样本的聚在一起在主坐标分析的加权Unifracβ-diversity指数无论新生儿桶状态(图1)。没有观察到显著差异在两组之间的丰富性和α-diversities;然而,这一趋势在α-diversity和丰富微生物群落的桶组略,但不是组明显低于没有桶,和明显低于对照组。这一趋势可能是重要的,但我们的研究没有足够的统计能力能够确认所有微生物多样性指数的差异。我们从Bacteriodetes演示了一个重大的转变,特别是由减少相对丰富的属普氏菌在这两个极其早产组,有或没有桶,相对于对照组。此外,普氏菌相对丰度与FEV显著相关1z分数,但没有与其他临床参数如吸烟状态、接触被动吸烟,自我诊断哮喘,F伊诺、血液嗜酸性粒细胞计数或吸入器的使用。
观察性研究,调查了肺部微生物普遍检测到普氏菌在肺组织和支气管肺泡灌洗的健康受试者20.,22,23]。建议Bacteriodetes相对丰度与健康的肺部微生物(24]。此外,减少之间的联系相对丰富的Bacteriodetes和慢性肺病已经频繁报道(23- - - - - -26]。转变社区组成从Bacteriodetes转向变形菌门一直在观察患有慢性阻塞性肺病(27,28和那些有哮喘28]。一个类似的趋势有一个从Bacteriodetes转向厚壁菌门,主要是链球菌,报道了Z挂et al。(29日在严重的哮喘。Hiltyet al。(28]报道转变远离Bacteriodetes(主要是社区成员普氏菌),对变形菌门(主要是嗜血杆菌),以及壁厚菌门在儿童哮喘。在这项研究中,L艾尔et al。(30.出生时相比,呼吸道微生物在早产儿和足月出生的婴儿,普氏菌中检测出气管吸入物在生命的第一天。在他们的研究结果,普氏菌RA在极低出生体重早产儿低而控制。在早产儿中,那些倾向于桶了普氏菌丰度;然而,这一趋势并不显著。
我们分析了测序数据,发现超越属水平p . melaninogenica是物种,总体上对观察到的减少的贡献最大普氏菌丰富的早产组与对照组相比。普氏菌物种是专性厌氧菌,被认为是投机取巧的口腔微生物群的成员,以及其他身体网站和孤立与其他混合厌氧的细菌感染和下呼吸道感染(31日]。大量的增加普氏菌相关的一些疾病,如牙周炎、风湿性关节炎、细菌性阴道炎和炎症性肠病32]。然而,其他普氏菌物种,如。P。媒介物和P。nigrescens通常与疾病(33]。很少发表p . melaninogenica,但这个物种是最常分离出的痰囊性纤维化在先前的研究和发现,厌氧菌的存在是与临床相关的稳定性(34,35]。
目前,还不清楚什么样的角色普氏菌在微生物体内平衡下呼吸道。许多研究肺相比,微生物在健康和疾病的建议普氏菌与健康有关,并迅速取代了变形菌门和厚壁菌门的成员在各种慢性肺疾病(24,26- - - - - -29日]。相反,一些研究建议普氏菌可能会导致肺部疾病的发病机理32,36- - - - - -39]。然而,必须注意观察推断整个属。的作用普氏菌物种在发病机制却没有得到足够关注,可能是因为普氏菌很难文化和通常不是孤立的常规微生物实验室的标本。因此,需要进一步的研究来理解的交互普氏菌物种与其他微生物与宿主的免疫系统,肺内的微生物群落,并描述菌株可能有利于呼吸系统健康。
一般来说,肺炎链球菌,流感嗜血杆菌和复活的被分类为典型的呼吸道病原体。这些生物通常驻留在人类无害鼻咽(40]。大量研究证明了这些生物的潜在后果在慢性阻塞性肺病13)和哮喘(28急性加重。因此,它是重要的去调查这三种细菌病原体的患病率和负载在我们组调查的可能性,减少大量的正常菌群可能开放利基机会致病菌。不幸的是,16 s测序方法的一个局限是16 s rRNA变异度高的地区表现出不同程度的序列多样性,并没有单一的高变区可以区分所有细菌组。在很多情况下,生物信息学管道提供可靠的鉴定到属水平对大多数生物的41]。由于这个原因,尽管16 s测序的高灵敏度和良好的相关性与qPCR负载,特异性特别是相对较低肺炎链球菌和h .流感同桌的成员,可能由于存在这些属正常呼吸微生物群。因此,qPCR可能是一个更合适的方法来确定特定致病菌的流行和负载。我们没有发现显著差异在细菌之间的负载和这些病原体的流行三个学习小组。
此外,我们比较我们年轻人常见的呼吸道微生物组配置文件队列与婴儿期早产儿微生物数据公布。无数的研究已经确定了呼吸殖民统治的一个重要的角色Ureaplasma在桶的发展10,11,18]。在我们的结果,Ureaplasma很少发现EP组在6痰样本(RA < 0.01%)(数据未显示)。在这项研究中,Lohmannet al。(12),显著的变化在随后的早产儿呼吸道微生物开发桶。出生后立即,早产儿呼吸道微生物主要是由变形菌门,尤其是不动杆菌物种,随着时间的推移,厚壁菌门的相对丰度增加,主要由驱动葡萄球菌这些婴儿发达桶,相比相对多元化和稳定的社区non-BPD组。葡萄球菌也与桶发展在另一项研究中19]。在我们的结果,不动杆菌和葡萄球菌很少是确定在我们的队列(RA为< 0.1%)。有趣的是,当检测到,葡萄球菌RA桶组略高于其他两组;然而,这种观察是没有统计学意义(补充图E5)。棒状杆菌属也伴随着严重的桶在早产儿的发展42]。在我们的结果,棒状杆菌属出席类似的RA三组∼1%。
这项研究的主要局限与小样本大小和无法诱导痰在所有科目,这可能不是随机的,因为它是更具挑战性的诱导痰在健康受试者相比,那些有呼吸系统病变。为临床安全原因,降低高渗盐水力量用于痰诱导人贴上哮喘患者中可能会占一些组之间的差异。尽管食盐水的微生物特征矩阵负控制非常不同于在痰液样本,这将是有用的调查的影响不同盐水质量优势的示例中,DNA提取、PCR抑制。此外,哮喘可能被视为一个潜在的糊涂。哮喘患病率是自我报告;我们没有目的测试证实或反驳;和许多受试者规定哮喘吸入器。美食家和其他早产群组研究曾报道,桶幸存者往往气流阻塞在以后的生活中,可以作为哮喘(贴5,43,44]。然而,在协变量分析中,哮喘状态并不是一个重要的协变量由阿多尼斯和ANOSIM (p > 0.05)。此外,所有的微生物组描述参数(α-和β-indices)也没有普氏菌RA是不同的科目贴上哮喘患者和nonasthmatics之间,在整个队列或对照组(补充图E3)。在所有sputum-based研究上呼吸道污染是一个问题。诱导痰是最好的可用的样本在一群年轻的成年人与肺部疾病其中许多额外的发育问题防止研究支气管镜检查。这将是有用的直接比较微生物签名并行上下呼吸道样本。
总之,年轻人极度早产出生在19岁表现出显著的生态失调。这是一个转变的特点是远离Bacteriodetes特别是清单微生物群落结构显著减少的相对丰度属普氏菌,经常描述的其他慢性肺部疾病。p . melaninogenica在这个属物种显示大多数变异。典型的呼吸机会致病菌的患病率和负载不受这种失调,和我们没有确定失调的持久性模式相关的发展新生儿桶桶在婴儿期的研究报道。
补充材料
确认
性格Rofael要感谢任务部门在埃及埃及高等教育和英国文化委员会资助她博士作为Newton-Mosharafa计划的一部分。n马洛接收一部分资金从卫生部的国家卫生研究所(NIHR)伦敦大学学院的生物医学研究中心的资助计划(UCLH) /伦敦大学学院医院。本研究进行了NIHR / Wellcome UCLH临床研究机构。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
作者的贡献:杰麦克休,d·索兰托jr赫斯特的想法怀孕的;性格Rofael和r . Troughton加工样品和实验室工作;性格Rofael进行生物信息学数据分析;性格Rofael,麦克休杰和d·索兰托解释数据;j·贝克曼收集样本和临床数据;和n马洛是美食家研究的首席研究员。性格Rofael从所有其他作者写的手稿与贡献。
利益冲突:性格Rofael报告个人费用和非金融支持从牛顿Mosharafa奖学金,在提交工作。
利益冲突:杰麦克休没有披露。
利益冲突:r . Troughton没有披露。
利益冲突:j·贝克曼没有披露。
利益冲突:d·索兰托没有披露。
利益冲突:n·马洛报告个人费用咨询公司从诺华和夏尔,外提交的工作。
利益冲突:jr赫斯特报告拨款,个人费用和非金融支持教育活动和咨询委员会工作,和支持参加会议,从使药物治疗慢性阻塞性肺病的制药公司,在提交工作。
支持声明:项目拨款支持的美食家研究是由英国医学研究理事会,英国。
- 收到了2018年7月2日。
- 接受2018年10月27日。
- 版权©2019人队