肺Ureaplasma体与早产儿急性肺部炎症和慢性肺部疾病的发生有关吗

以前，我们报道了明显的肺部炎症的婴儿谁发展为慢性肺部疾病的早产儿。我们重新检查了这些没有临床或实验室感染证据的婴儿，并寻找Ureaplasma体对93份支气管肺泡灌洗液样本的RNA进行逆转录pcr检测，发现B组链球菌和其他微生物。呼吸窘迫综合征通气患儿6例(妊娠28周;出生体重880克)为阳性美国体11例(25周，800克)阴性。5例(83%)阳性和4例(36%)阴性婴儿发生慢性肺部疾病。每个婴儿都被生物品种1或生物品种2定植，但不是两者都定植。美国体在第1天的2个婴儿中检测到非常微弱，但在第10天的6个婴儿中检测到5个。阳性组第10天肺中性粒细胞、肺泡巨噬细胞、可溶性细胞间黏附分子-1、IL-1β及第1天IL-6、IL-8明显升高。在14至21日龄的6个样本中鉴定出多种微生物，但所有样本均为B组链球菌阴性。我们的数据表明美国体定殖与随后发展为慢性肺部疾病的婴儿肺部炎症的发展有关。

CLD仍然是早产儿常见的呼吸系统疾病。尽管治疗方式取得了重大进展，包括引入表面活性剂、各种机械通气模式和定期使用产前皮质类固醇，但发病率和死亡率仍然很高。许多危险因素已被确定，包括机械通气、氧气治疗、动脉导管未闭和医院感染。最近受到高度关注的一个领域是产前感染（1，2）．甚至在婴儿出生之前，已经注意到炎症反应，这种炎症似乎与新生儿呼吸系统疾病的发展有关（3，4）．支原体是引发炎症的候选者之一Ureaplasma体（5，6)．这种微生物已经从患有慢性阻塞性肺疾病的婴儿肺部分离出来，但是否美国体导致早产儿急性肺损伤的原因或是否与早产程度有关仍有争议(7）．一种证实或反驳这种关联的方法是研究肺部炎症反应之间的联系，目前已在患有慢性阻塞性肺病的婴儿中定期报道(8- - - - - -11)的存在美国体在患有慢性阻塞性肺疾病的婴儿肺部

我们之前的数据表明，促炎细胞因子IL-1和IL-6，强中性粒细胞趋化剂IL-8，可溶性粘附分子ICAM-1，以及炎症细胞，即中性粒细胞，在随后发展为CLD的婴儿肺部增加(8，9)．这些发现已被许多人证实（10，11)，目前普遍认为肺部炎症是慢性阻塞性肺疾病发展的危险因素（12）．触发和维持炎症反应的确切损伤因素仍然是难以捉摸的。机械通气和氧气治疗等产后因素可能是候选因素，产前感染也可能是一个因素（1，2）．在我们之前的研究中，我们排除了任何有感染证据的婴儿，包括膜长时间破裂、外周血中性粒细胞增加、中性粒细胞左移、CRP增加或血培养或气管内培养阳性(8，9)．我们重新检查了这些样本和数据，以确定是否美国体，通过RT-PCR和脲酶基因特异性引物进行鉴定（13）是否与增强的肺部炎症反应有关，以及这种生物的存在是否会导致CLD的增加。因为美国体可以分为两组，生物品种1号和生物品种2号(14），我们还确定了每个婴儿的定植模式阳性美国体．由于B组链球菌与新生儿的呼吸道疾病有关，我们使用了这种生物的特定引物来确定其在肺灌洗样本中的存在。此外，我们还使用了细菌16s核糖体RNA (rRNA)基因的通用引物，并利用随后的克隆和测序技术，确定了在通气早产儿呼吸道定植的生物谱，这些早产儿有发生CLD的风险。

在我们之前的研究中，我们只纳入了发生RDS的婴儿，这些婴儿要么完全康复，在空气中喂养，到28 d时胸片正常(RDS组)，要么发展到氧依赖，28 d后胸片异常(CLD组)。(8，9)．我们还纳入了4名肌肉疾病但胸片正常的婴儿，他们接受机械通气，吸氧<28%(对照组)。有任何感染证据的婴儿，包括膜长时间破裂、外周血中性粒细胞增加、中性粒细胞左移、全身感染、CRP增加或血培养或气管内培养阳性，均被排除在研究之外。如前所述获得BAL（15，16)．简单地说，婴儿仰卧，头转向左侧，将FG5导管插入婴儿右下叶，灌注两等份的1ml /kg生理盐水，在呼吸机呼吸2 - 4次后，将其吸回。离心分离细胞，半定量测定IL-1β、IL-6和IL-8 mRNA的表达（9)．上清液被用来测定感兴趣的试剂的浓度，即IL-1β， IL-6, IL-8和ICAM-1，如先前报道的那样(8，9)．少量灌洗液用血细胞计和Diff Quick染色测定细胞总数和差异计数(Dade Behring, Deerfield, IL, usa)。该研究得到了当地研究伦理委员会的批准，并在灌洗程序前获得了父母的知情同意。

采用通用细菌16s rRNA引物RT-PCR扩增BAL样品。

来自先前研究的cDNA（9)用于扩增细菌16s rRNA基因。以浓度为0.2 μM的引物FD1 (AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG)和rP1 (ACG G(T/A/C)T ACC TTG TTA CGA CTT)在Taq DNA聚合酶(Abgene, Epsom, Surrey, uk)存在下进行PCR扩增。在将cDNA模板添加到PCR混合物之前，用DNase I处理反应混合物以去除任何污染的细菌DNA，类似于Hilali所描述的方案et al。(17)．在每个50 μL反应中加入1微升DNase (Sigma Chemical, Poole, Dorset, U.K.)溶液，浓度为0.0625 Kunitz单位/μL，试管在37℃下孵育15分钟，然后在94℃下加热50分钟，使DNase失活。然后将cDNA模板添加到包含上述引物的PCR混合物中，在95°C下孵卵2 min，在95°C下孵卵30次，55°C下孵卵40 s, 72°C下孵卵2 min，在72°C下孵卵10 min。

PCR扩增后，用rD2 (G(T/A)A TTA CCG CGG C(G/T)G CTG)代替rP1引物，再扩增1 μL反应产物。随后的反应产物用1.2%琼脂糖凝胶电泳分离，并用溴化乙锭染色，并使用紫外照明进行观察。PCR产物从凝胶中切割并使用QIAquick凝胶提取系统(QIAGEN, Dorking, Surrey, uk)进行纯化。这些片段被克隆到pGEM-T Easy载体系统(Promega UK Ltd.， Southampton, U.K.)，并在对唯一克隆进行DNA测序之前，通过限制性片段长度多态性(RFLP)分析进行排序。所获得的序列最近的亲缘关系通过BLAST搜索数据库确定http://www.ncbi.nlm.nih.gov/．

用特异性引物RT-PCR扩增BAL样品对解脲U.和B组链球菌。

为了确认每个样本中完整的cDNA的存在，使用前面描述的引物在每个cDNA样本中扩增β-actin（9)．脲酶基因特异性引物美国体(U5-CAA TCT GCT CGT GAA GTA TTA C和U4-ACG ACG TCC ATA AGC AAC T)，如Blanchard所述et al。（13），被用来识别的存在美国体从BAL细胞小球中获得脲酶cDNA中的DNA。PCR扩增得到428 bp的尿素和尿素组分产物片段美国体脲酶复杂。美国体分别用引物UMS 125 (GTA TTT GCA ATC TTT ATA TGT TTT CG)和UMA 226 (CAG CTG ATG TAA GTG CAG CAT TAA ATT C)对生物品种1和生物品种2进行了扩增，扩增产物分别为403 bp和448 bp(14）．B组链球菌特异性引物Sag59 (TTT CAC CAG CTG TAT TAG AAG TA)和Sag190 (GTT CCC TGA ACA TTA TCT TTG AT)，如Ke所述et al。（18)，被用来识别这种生物存在于BAL获得的细胞颗粒中。PCR扩增得到B组链球菌cAMP基因153 bp片段。

对于每个感兴趣的基因，使用Taq DNA聚合酶(Abgene)在95°C下扩增2分钟，然后在95°C下扩增30秒，55°C下扩增40秒，72°C下扩增1分钟，然后在72°C下扩增10分钟。用琼脂糖凝胶电泳分离反应产物，并在紫外光照下检查凝胶以确定条带的存在与否。

统计分析。

给出了出生体重和妊娠期的中位数。细胞和细胞因子浓度以均数±SEM和非参数Mann-Whitney检验给出U检验用于比较阳性组和阴性组的结果美国体．采用fisher精确试验比较有无肺损伤的婴儿美国体与慢性肝病的发展有关。

病人的特点。

从21名婴儿中获得93个BAL样本。其中17人因RDS发展为呼吸衰竭，其中9人发展为慢性阻塞性肺病，即。28 d龄时出现氧依赖。四名婴儿因非呼吸原因进行了通气。RDS[出生体重820克(范围570-970);妊娠，25周(范围，24-29)]和CLD[出生体重，990克(780-2130);妊娠期，28周(27-33)]p< 0.01)和出生体重(p< 0.05)。

BAL样品中解脲脲酶基因的检测。

使用特定的底漆美国体时，我们发现6名婴儿至少有一个阳性样本(表1)．除了一个婴儿，其他婴儿美国体在10 d时出现。相比之下，第1天的所有样本(第4天的婴儿2)均为阴性。因此，我们将阳性组的这些d1样本(以及婴儿2的d4样本)与阴性组的所有d1样本一起进行了两轮PCR，以确定是否存在低微生物负荷(即。使用的脲酶基因的特异性引物，对第一次PCR 30循环的产物再次进行30循环扩增美国体)．阴性组的婴儿都没有美国体在d1样本中检测到，但阳性组的两个婴儿在d1只有非常弱的检测信号(表1)．对照组的婴儿中没有一个呈阳性美国体．阳性组中有4名婴儿的所有样本都为生物变种1阳性，2名为生物变种2阳性。每个婴儿的所有样本都被生物品种1或生物品种2定植，但不同时定植。我们根据婴儿是否至少有一个阳性样本对CLD组和RDS组中的17名婴儿进行了重新分类美国体；患者数据显示在表2细胞和细胞因子数据显示在图1- - - - - -4．

虽然婴儿在美国体对照组体重较重(880克;范围，690-2310 g)，与阴性组(800 g;范围570-910 g)，差异无统计学意义。然而，阳性组的婴儿明显更成熟(28周;范围:24 ~ 33 wk)高于阴性组(25 wk;24-27周，p< 0.05)。6个婴儿中有5个(83%)呈阳性美国体但11人中只有4人(36%)发展为慢性肝病美国体-阴性组发展为CLD。阳性组未出现CLD的婴儿有严重的呼吸衰竭，他的双胞胎兄弟活了下来，他的双胞胎兄弟死于严重的RDS，但没有临床或实验室感染证据。两者之间存在着显著的联系美国体的发展(p< 0.05)。

婴儿的细胞和细胞因子数据为解脲脲阳性和阴性。

婴儿BAL液中细胞总数美国体阳性组为3.3 ~ 3.4 × 10⁵在1 ~ 7岁时增加至5.5 × 10⁵/mL在d 10岁时(图1一个)．此后，细胞总数减少到1.6 × 10⁵/mL，达到14.0 × 10的最大值⁵d 17岁时/mL。在美国体-阴性组，细胞总数为3.3 × 10⁵/mL在第1天下降至0.9 × 10⁵在逐渐增加到10.1 × 10⁵/mL / d对于BAL液中中性粒细胞计数，在生命的前7天，两组之间的计数相似，但在出生后7天，计数显著升高美国体-阳性组在d 10。在第17天，两组小鼠的计数均达到最大值(图1B)．两组肺泡巨噬细胞数量差异有统计学意义，均<0.8 × 10⁵/mL美国体-阴性组增加1.0 × 10⁵d 1 ~ 2.6 × 10⁵/mL后逐渐下降至0.2 × 10⁵/mL在d 14岁时(图1C)．第17 d进一步增加至3.1 × 10⁵/毫升。

BAL样品中sICAM-1的浓度与肺泡巨噬细胞相似，从第1天的430 pg/mL增加到第4天的4240 pg/mL，然后在第17天逐渐下降到217 pg/mL美国体-阳性组(图2)．在美国体-阴性组，BAL样品中sICAM-1的浓度从第1天的727 pg/mL逐渐增加到第14天的最大值2741 pg/mL。

BAL样品中IL-1β的变化模式在两组中大致相似，在第1天的低浓度在两组中都有所增加，在第14天达到最大值1653 pg/mL美国体-阴性组和2394 pg/mL在d 17美国体-阳性组(图3一个)．然而，后者的浓度似乎更大，在第7天显著增加。IL-1β mRNA表达增加美国体-阳性组从第1天的0.6(与β-肌动蛋白的比例)到第10天的最大1.2 (图3B)．在阴性组，IL-1β/β-actin比值在第1天为1.0，但此后一直<0.5。阳性组在7日龄时显著增加。

第1天肺灌洗液中IL-6的浓度美国体-阳性组与美国体-阴性组(图3C)．3周后其浓度降至1339 pg/mL。相比之下，在美国体-阴性组肺灌洗液中IL-6浓度除第14天升高至2394 pg/mL外，其余均<1286 pg/mL。IL-6/β-actin mRNA比值从0.4增加美国体-阳性组在第10天和第17天下降到0.4 (图3D)．在美国体-阴性组，除第10 d(1.5)和第17 d(0.8)外，IL-6/β-actin mRNA比值均<0.4。

在美国体-阳性组，第1 d BAL液中IL-8浓度显著升高(13.1 ng/mL)与2.2 ng/mL) (图4一个)．在第14天下降到6.7 ng/mL，在第21天增加到11.3 ng/mL。阴性组肺灌洗液IL-8浓度第1天为2.2 ng/mL，第10天升高至27.0 ng/mL，第21天下降至2.1 ng/mL。IL-8/β-actin mRNA比值在第1天较低(0.3)美国体-阳性组，但在第7天达到最大值(1.8)，然后在第14天下降到无法检测的水平(图4B)．相比之下，在美国体-阴性组，IL-8/β-actin比值在第1天升高至1.4，在第14天下降至0.5。在出生后的前10天，两组患者血清IL-8浓度相似，但在出生后10天，血清IL-8浓度似乎继续升高美国体-阳性组在d 14和d 17时，差异无统计学意义。两组血清IL-8浓度均低于BAL样本(图4C)．

为了了解为什么不是每个婴儿的样本都呈阳性美国体，我们假设BAL样本阳性美国体是否与肺泡巨噬细胞和促炎细胞因子增加有关美国体．肺泡巨噬细胞在BAL阳性的个体样本中增加美国体（p中性粒细胞< 0.05)，中性粒细胞无(NS)。此外，促炎剂IL-6 (p< 0.01)和IL-1 (p< 0.001)以及ICAM-1 (p阳性组BAL均升高(< 0.05)，IL-8 (NS)无明显升高。

BAL细胞中存在细菌核糖体rRNA基因。

当我们使用通用细菌引物RT-PCR检测16s rRNA基因时，只有6个年龄在14 - 21 d的样本被发现呈阳性(图5)．随后的克隆和DNA测序表明，在这些婴儿的呼吸道中定植了各种各样的生物，包括16S rRNA基因的恢复美国体．有趣的是，其他16S rRNA基因包括Stenotrophomonas maltophilia这是一种与囊性纤维化有关的有机体。Brevundimonas, Sphingomonas,假单胞菌所有种偶尔从临床标本中分离出来，通常具有可疑的临床意义。无处不在的金黄色葡萄球菌可能是污染物和Gemella haemolysans是胃肠道的共生动物(表3)．有趣的是，这些婴儿是长期通风的，与那些没有殖民的婴儿没有任何临床差异。由于乙型溶血B群链球菌通常与呼吸道疾病有关，特别是在足月和近期婴儿中，我们使用这种生物的特定引物来确定其在肺灌洗样本中的存在。我们所有接受机械通气的婴儿都接受了青霉素和庆大霉素治疗，RT-PCR检测没有一个样本为阳性(数据未显示)。

在这项研究中，我们已经确定了美国体在没有临床或实验室感染证据的婴儿中进行RT-PCR，尽管这种微生物的培养不是常规的。几乎所有这些婴儿都患有慢性阻塞性肺疾病，肺部有明显的炎症反应。此外,美国体在几乎所有这些10日龄婴儿中都发现了这种细菌，但是，尽管使用了非常敏感的技术，在两轮RT-PCR后，只有两个婴儿的d1样本对这种细菌呈弱阳性。此外，每个婴儿的每个样本都被生物变种1或生物变种2定殖，没有婴儿被两种生物变种定殖。我们无法证明被这两种生物定殖的生物之间有任何差异。有趣的是，那些对美国体比那些对这种微生物没有反应的人更成熟。一些婴儿在14-21日龄时被多种生物定植，但是，使用特定的引物，在研究中的任何婴儿中都没有检测到导致新生儿严重呼吸衰竭的B组链球菌。

美国体之前已被证明与CLD的发展有关，但它与早产的关系留下了一个悬而未决的问题，即这种微生物是导致急性肺损伤还是只是一个无辜的旁观者(7）．在这项研究中，美国体与没有任何感染证据的不成熟婴儿相比，更成熟的婴儿有更大的机会患上CLD。应该记住，只有没有临床或实验室感染证据的婴儿才被研究。此外，与未定植的婴儿相比，这种生物的存在与明显的肺部炎症反应有关美国体．虽然机械通气和氧气也是发生肺部炎症的危险因素，但两组的通气参数相似，因此很可能是这些因素导致了观察到的不同模式。

我们和其他研究人员此前曾将CLD的发生与气道中性粒细胞增多联系起来(8，19），但在美国体-阳性组的肺泡巨噬细胞增加更显著(图1C)，尽管在10 d龄时也注意到气道中性粒细胞增多。Coalson的研究小组之前注意到，在早产和感染的狒狒模型中，肺泡巨噬细胞增加美国体(20)．我们的数据也与在小鼠模型中报道的数据相一致美国体最初气道中性粒细胞增多后气道巨噬细胞增多的感染(21）．Viscardi的小组对死后肺的研究表明，当婴儿被定植时，肺泡巨噬细胞占主导地位美国体但当他们没有气道中性粒细胞时(22)．

类似地，几位作者报道了在婴儿中被定植的促炎细胞因子的增加美国体(23，24)．我们的研究进一步补充了这一文献，表明在没有败血症临床或实验室证据的婴儿中，美国体必须被认为是急性肺损伤的重要因素，前炎症细胞因子的增加，特别是IL-6和IL-8，在这些婴儿出生时都有所增加。其他促炎因子，包括中性粒细胞、sICAM和IL-1β，在d 7-10岁时增加美国体积极的组织。尽管最近有关于胎儿全身炎症反应的报道(25），我们的数据表明，两组研究对象出生时血清IL-8没有差异。有趣的是，血清IL-8浓度至少比肺灌洗液低一个数量级，这表明进展为CLD的婴儿肺部存在局部炎症反应。

的发现使我们感到惊讶美国体几乎所有婴儿在第10 d时出现，而在第1 d时，一轮PCR后所有婴儿都没有出现。我们试图通过多轮PCR来确定该生物是否存在于第1天，但在第1天只能微弱地检测到阳性组的两个样本中该生物的存在。我们目前的理解是这样的美国体是通过生殖道获得的，然而d1样本在两个婴儿中要么呈阴性，要么呈极弱阳性。根据这项研究的性质，从任何有明显感染证据的婴儿身上收集的样本都将被排除在外，而且出生时的微生物载量很可能非常低，但我们的技术非常敏感，甚至可以检测到一种有机体。或者，技术限制，如。肺灌洗程序或生物体的生存能力，都可能影响结果。可能是这样美国体可能在产前或产后获得（26)．卡斯特罗-阿尔卡拉兹最近的一项研究et al。(27)报告了三种模式美国体早产儿定植:持续性，早期短暂性和晚期短暂性。在我们的研究中，那些与持续定殖相关的细胞与CLD的发展相关。显然还需要进一步的工作来确定生物体的获得是在产前还是产后。

有趣的是,美国体在阳性组的所有婴儿样本中均不存在。采样技术可以解释这种观察，因为存在美国体不可能均匀分布于整个肺。另外，这种生物的存在似乎与肺泡巨噬细胞的存在有关。因此，我们比较了所有阳性样本美国体阳性样本与肺泡巨噬细胞以及IL-1、IL-6和sICAM-1之间有很强的相关性。这可能是在肺泡巨噬细胞数量多的地方，检测到的可能性美国体也增加了。数据表明，单个样本可能会错过的存在美国体．很难解释为何超过21 d龄的所有样本均为阴性(表1)，但这可能与采样技术或肺泡巨噬细胞减少有关，也可能与婴儿解决感染有关。这一观察结果不太可能是由于抗生素治疗，因为没有一个婴儿使用红霉素治疗。

虽然我们的研究受到一些因素的限制，但我们通过RT-PCR检测β-actin的存在，确保所有样本都有足够的cDNA。样品采集时，培养为美国体或其他支原体不常规。事实上，只有少数主要从事研究的中心定期培养支原体。显然，我们的数据表明，常规培养可能适用于有发展为慢性呼吸衰竭风险并可能长时间保持氧依赖的婴儿。的类型美国体可能是必要的，因为它意味着有机体对抗生素的耐药性，因此适当使用抗生素(14）．许多母亲患有绒毛膜羊膜炎的早产儿似乎不会患上RDS(6）因此不太可能出现在这项研究中。这些婴儿很可能有更大的流行感染美国体还有其他微生物，如长时间胎膜破裂或有胎儿炎症反应的妇女(28)．在我们的研究中，重点是那些出生时没有任何临床或实验室感染证据的婴儿，因此排除了那些母亲患有绒毛膜羊膜炎、长时间胎膜破裂或胎儿炎症反应的婴儿。我们的研究结果表明美国体可能比之前想象的更普遍。

出生时IL-6和IL-8升高，10 d时中性粒细胞、肺泡巨噬细胞、sICAM和IL-1β升高，炎症反应似乎存在差异(图1- - - - - -4)．然而，有大量的危险因素可能导致早产儿发生CLD。直到最近，大多数研究都集中在产后因素，特别是机械通气和氧毒性(29)．但有产前因素，包括子宫感染（1，2），可能会引发注定会患上慢性阻塞性肺病的婴儿肺部的炎症过程（3，4）．很有可能在婴儿中美国体肺部炎症过程在出生前开始，并在出生前由CLD的危险因素维持。据报道，如果肺已经被感染或定植，氧气会加重肺损伤美国体(30）．因此，尽管两组的通气要求相似，但阳性组的肺损伤更大，因为存在美国体．

只有少数样本和婴儿的16 rRNA呈阳性。所有样本均来自因呼吸衰竭而长期通气的婴儿，阳性样本来自14-21日龄的健康婴儿，这表明长期通气与各种临床意义存疑的细菌类型有关，尽管生物体的存在Stenotrophomonas maltophilia有趣的是它与囊性纤维化有关。令人鼓舞的是，我们没有在任何样本中检测到B组链球菌。这可能是由于所有的婴儿都使用了青霉素和庆大霉素的联合治疗。

产前感染作为新生儿呼吸道疾病的一种可能原因，近年来受到广泛关注。我们的数据表明一种这样的微生物，即美国体至少在一定程度上是慢性阻塞性肺病患儿肺部炎症的原因(8- - - - - -12)．这种炎症过程是否可以通过使用适当的抗生素来预防，需要更详细的调查。从这项研究中可以清楚地看到，更新、更敏感和更准确的技术在理解新生儿急性肺损伤的机制方面发挥着作用。

拜尔港:

支气管肺泡灌洗液

CLD:

早产儿慢性肺病

c反应蛋白:

C反应蛋白

ICAM:

细胞间粘附分子

RDS:

呼吸窘迫综合征

rt - pcr:

逆转录PCR

作者感谢参与这项研究的婴儿的父母和汉默史密斯医院的工作人员。

从属关系

1. 莱斯特大学儿童健康系，英国LE2 7LX莱斯特

   Sailesh Kotecha, Rachel Hodge, Robin Miralles和Michael Silverman

2. 莱斯特大学微生物学系，英国莱斯特LE2 7LX

   J安德鲁沙伯和威廉D格兰特

相应的作者

对应到Sailesh Kotecha．

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