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研究文章

通气早产儿气道微生物群落的更替因BPD严重程度不同而不同

  • 布兰迪·瓦格纳，

    从属关系科罗拉多公共卫生学院生物统计系，科罗拉多大学，奥罗拉，科罗拉多，美利坚合众国，肺科，儿科，医学院，科罗拉多大学，奥罗拉，科罗拉多，美利坚合众国

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  • 玛莎·k·桑塔格,

    附属科罗拉多大学科罗拉多公共卫生学院流行病学系，丹佛，科罗拉多，美利坚合众国，奥罗拉

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  • j·柯克哈里斯,

    附属科罗拉多大学医学院儿科，奥罗拉，科罗拉多，美利坚合众国，肺科

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  • 约书亚。米勒,

    附属科罗拉多大学科罗拉多公共卫生学院流行病学系，丹佛，科罗拉多，美利坚合众国，奥罗拉

    ⨯
  • 林赛•莫罗

    附属科罗拉多大学科罗拉多公共卫生学院生物统计系，奥罗拉，科罗拉多，美利坚合众国

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  • 查尔斯·e·罗伯逊

    附属科罗拉多大学医学院传染病学系，奥罗拉，科罗拉多，美利坚合众国

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  • 马克·斯蒂芬斯，

    附属科罗拉多大学医学院儿科，奥罗拉，科罗拉多，美利坚合众国，肺科

    ⨯
  • 布伦达·b·波因德克斯特

    附属美利坚合众国俄亥俄州辛辛那提儿童医院医疗中心围产期研究所

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  • 史蒂文·h·Abman

    从属关系美利坚合众国科罗拉多州奥罗拉市科罗拉多大学医学院儿科系肺科，美利坚合众国科罗拉多州奥罗拉市科罗拉多大学医学院儿科系儿科心肺中心

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  • 彼得·莫拉尼

    peter.mourani@childrenscolorado.org

    从属关系儿科心肺中心，科罗拉多大学医学院儿科，奥罗拉，科罗拉多，美利坚合众国，危重病医学科，儿科，医学院，科罗拉多大学，奥罗拉，科罗拉多，美利坚合众国

    ⨯

通气早产儿气道微生物群落的更替因BPD严重程度不同而不同

  • 布兰迪·瓦格纳，
  • 玛莎·k·桑塔格,
  • j·柯克哈里斯,
  • 约书亚。米勒,
  • 林赛•莫罗
  • 查尔斯·e·罗伯逊
  • 马克·斯蒂芬斯，
  • 布伦达·b·波因德克斯特
  • 史蒂文·h·Abman
  • 彼得·莫拉尼
巴解组织
x

摘要

早产将发育中的肺暴露在细菌直接接触的环境中，通常通过气管插管促进。尽管有证据表明细菌感染与支气管肺发育不良(BPD)的发病机制有关，但对气道微生物群的系统研究有限。目的是确定机械通气早产儿气管吸入物中与BPD的发展和严重程度相关的早期呼吸道微生物组的特定模式。前瞻性纳入胎龄≤34周、出生体重500-1250g的婴儿。机械通气婴儿在入组、7、14和21日龄时收集了气管吸入样本。采用改进的NIH标准，氧还原试验测定BPD;没有BPD的婴儿由于数量少而被排除在外。取标本进行16S rRNA测序鉴定细菌，qPCR检测细菌载量。采用7天样本进行横断面分析，对至少有2个抽吸器的受试者进行纵向分析。对152例婴儿(分别为51例、49例和52例轻度、中度和重度BPD)气管吸入物进行微生物组分析。 Seventy-nine of the infants were included in the cross-sectional analysis and 94 in the longitudinal. Shannon Diversity, bacterial load, and relative abundance of individual taxa were not strongly associated with BPD status. Longitudinal analysis revealed that preterm infants who eventually developed severe BPD exhibited greater bacterial community turnover with age, acquired less葡萄球菌在出生后的第1天，有较高的初始相对丰度Ureaplasma．综上所述，机械通气早产儿气道微生物群落的纵向变化可能与BPD严重程度相关，而7日龄时气道生态的横断面分析未揭示与BPD严重程度相关。进一步的评估是必要的，以确定观察到的纵向变化是因果的，还是对临床管理或其他因素导致BPD的反应。

引用：Wagner BD、Sontag MK、Harris JK、Miller JI、Morrow L、Robertson CE等。（2017）通气早产儿气道微生物群落周转率因BPD严重程度不同而不同。PLoS ONE 12（1）：e0170120。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120

编辑器:Heinz Fehrenbach，Forschungscentrum Borstel Leibniz Zentrum fur Medizin and Biowisenschapten，德国

收到：2016年6月27日;认可的：2016年12月29日；出版：2017年1月27日

版权:©2017 Wagner等。这是一篇开放存取的文章188滚球软件，根据知识共享署名许可协议，它允许在任何媒介上无限制地使用、分发和复制，前提是注明原作者和来源。

数据可用性:排序后的成对末端序列数据存放在NCBI短读档案中，登记号为SRP066782。完整复制报告研究结果的数据集和代码可在https://github.com/wagnerbd/BPD-microbiome-1．

资助:这项工作得到了戈伯基金会的支持，http://www.gerberfoundation.org；国家卫生研究所/国家中心研究资源K23RR021921；国家卫生研究所-国家心肺血液研究所R01 HL085703；国家卫生研究所/国家转化科学促进中心拨款编号UL1 TR000154。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或准备手稿。

利益冲突:作者宣称不存在相互竞争的利益。

介绍

早产婴儿患支气管肺发育不良（BPD）的风险很高，BPD是早产儿的一种慢性肺部疾病。BPD的特点是长期需要氧气治疗、频繁的肺部感染需要住院、哮喘、运动不耐受和肺动脉高压[1.,2.]BPD的原因是早期肺暴露于宫外环境的不良影响，以及需要支持性干预，如机械通气和高水平氧气输送[3.–5.].这些刺激可导致未成熟肺发炎，破坏正常肺发育[6.]因此，进一步了解早产后促进炎症和损害肺发育的危险因素和机制对于制定更好的预防和治疗策略至关重要。

过去的实验室和临床研究清楚地表明，对不良环境刺激的炎症反应可干扰早产后的肺生长[7.,8.].而产前和产后感染、高氧和机械通气作为引起炎症的刺激物受到了广泛关注[9]然而，气道定植和侵入对BPD发展的可能影响尚不清楚，很少有研究探讨这一问题[10,11]研究表明，即使没有明显感染，细菌暴露也可能影响免疫系统的成熟，而免疫系统的成熟反过来会调节肺部发育和对后期感染的反应。存在Ureaplasma在早产儿呼吸道中，即使没有感染的迹象，也与促炎反应和BPD风险增加有关[12]因此，出生后接触定植细菌可能会影响早产儿的免疫反应和随后的肺发育。

最近的证据表明，正常的肺中含有不同的微生物群，称为微生物群[13–16]．然而，标准的细菌培养方法不能有效地识别生活在呼吸道内的微生物的全谱，对于这些调查是低效的。微生物群遗传蓝图的分子检测可以以无偏倚的方式识别样本中的细菌，从而全面评估微生物群-表型关联[10,17–19]．研究呼吸道微生物组与疾病结局的关系是进一步将微生物-宿主相互作用与早产儿慢性肺病发病机制联系起来的新方法。

微生物组的生态变化，以微生物多样性减少和潜在致病菌控制为特征，与炎症反应增强和感染及其他免疫介导疾病的风险增加有关。囊性纤维化（CF）、哮喘和慢性阻塞性肺疾病（COPD）患者肺部的类似生态变化与肺部疾病恶化相关[20.–24]因此，我们假设机械通气早产儿早期呼吸道微生物组的特定模式（细菌负荷和多样性）与BPD的发展及其严重程度有关。我们用两种方法检验了这一假设：1）对7天龄时从机械通气早产儿身上采集的气管吸出物样本进行横断面分析；2）对至少采集了2次气管吸出物的机械通气早产儿进行纵向分析，评估其气道微生物组群的变化出生后的前3周。

方法

研究设计与主题

该研究的患者标本和数据来自一个双中心(科罗拉多大学医学院，安舒茨校区和印第安纳大学医学院)的观察性纵向研究，该研究在2006年7月至2013年2月期间招募了一组早产儿。该方案由每个参与地点的机构审查委员会批准，并获得所有参与者的父母或监护人的书面知情同意。对出生时胎龄小于34周、出生体重在500至1250克之间的婴儿进行筛选以纳入研究。排除标准包括先天性心脏病的临床证据(入组前已知动脉导管未闭、卵圆孔未闭、房间隔缺损< 1cm、室间隔缺损< 2mm除外);致命的先天性异常;无效病例(出院前预期死亡)。受试者被要求在7天内登记。需要机械通气的婴儿在入组、7、14和21天(+/- 48小时)时采集气管吸入样本。本研究包括采用机械通气并至少收集一次气管抽吸剂的婴儿。横断面分析采用最接近7日龄但在5-9日龄内收集的气管吸出物，纵向分析纳入至少收集到2例气管吸出物的婴儿。 Infants who died, withdrew, or were transferred or discharged without undergoing BPD assessment at 36 weeks PMA were also excluded (图1)．收集详细的临床资料，包括产妇和分娩史，医院病程和生理评估。在PMA 36周时，使用NIH研讨会定义的修改评估BPD状态和严重程度[5.]，并应用沃尔什所述的氧还原试验[25]如前所述[26]．

缩略图
下载：
图1所示。研究参与者的登记、气管吸液收集和BPD状态。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.g001

标本采集及处理

如前所述采集气管吸出标本[10]简言之，通过气管插管（ETT）注入0.5 mL无菌0.9%生理盐水（不含防腐剂），然后进行3-5次呼吸机呼吸。将一根5或6法国无菌吸引导管插入ETT末端下方0.5cm处，并在缓慢拔出导管时将分泌物吸入连接的无菌样本收集器中。然后在4°C下以250g离心样品20分钟。去除上清液，并在-70°C下储存颗粒，直到进行微生物组分析。

实验室化验

定量PCR。

使用Qiagen EZ1高级自动提取平台（Qiagen Inc.，加利福尼亚州瓦伦西亚）进行DNA提取使用细菌卡和组织提取试剂盒。所有样品操作均在BSL2罩中以适当的层流进行。冷冻样品在4°C下解冻并旋转以确保混合。将用于提取的200μl等分试样转移到配备EZ1试剂盒的试管中。剩余样品储存在-70℃下。提取试剂按照制造商的指示，将药筒、洗脱管和针头支架装入EZ1样品架。选择100μl的洗脱体积，并运行EZ1 DNA组织试剂盒程序。带有DNA提取物的洗脱管储存在-20°C下。通过进行对照提取，确认DNA提取试剂不含细菌DNAng缓冲液或PCR级水。使用先前发布的定量实时PCR分析法测量细菌总载量[27,28]．

排序。

通过16S rRNA基因的广谱扩增和序列分析确定细菌谱[29,30]．简而言之，扩增产物是利用引物以16S rRNA的V1/V2可变区约300个碱基对为靶点生成的。聚合酶链反应使用琼脂糖凝胶密度测定法对产物进行标准化，以约等摩尔量汇集，凝胶纯化，并使用DNA清洁和浓缩试剂盒（Zymo，Irvine，CA）进行浓缩。使用量子比特荧光计2.0（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）对汇集的扩增子进行定量。将池稀释至4nM，并在室温下用0.2N NaOH变性。在加载测序仪之前，将变性DNA稀释至20pM，并加入10%的Illumina PhiX对照DNA。使用500循环版本2试剂盒在MiSeq平台上进行Illumina配对末端测序。

Illumina成对末端读取分析

如前所述，Illumina MiSeq配对端序列用python脚本通过配对读取中的条形码样本进行排序[29]．排序后的配对端序列数据以登录号SRP066782保存在NCBI Short Read Archive中。使用phrap对已排序的配对序列进行组装[31,32]．不能组装的成对就被丢弃。组装的序列末端在5个核苷酸的移动窗口上修剪，直到平均质量达到或超过20个核苷酸。超过1个歧义或少于200 nt的裁剪序列将被丢弃。潜在嵌合体鉴定与Uchime (usearch6.0.203_i86linux32) [33]使用城堡[34]Silva参考序列从后续分析中删除。组装序列与SINA（1.2.11）对齐并分类[35]使用Silva 111中的629125细菌序列[36]作为参考，以生成Silva分类法。将具有相同分类任务的序列聚类生成操作分类单元(OTUs)。这个过程产生了22,512,493个序列，350个样本(平均大小:64,321个序列/样本;分钟:6451;马克斯:196691)。商品覆盖率中位数在6,451个稀疏点处≥99.6%。软件包explicit (v2.10.5，www.explicet.org)[37]用于计算稀疏的Good 's覆盖率和alpha多样性(Shannon指数)测度。

统计分析

所有数据均使用REDCap(研究电子数据采集)进行前瞻性收集和管理[38数据库在科罗拉多大学丹佛发展和信息服务中心进行。卡方检验和Wilcoxon秩和检验分别用于分类和连续变量的BPD组的临床特征比较，以解释测序深度、相对丰度（RA）的差异。计算每个分类单元的数量（特定分类单元的序列数/序列总数*100）。使用由5000棵分类树组成的随机森林（RF）对BPD组的微生物分类单元进行多变量横截面评估[39]．随机森林是一种适合多种分类树的集成方法，常用于处理高维数据。使用来自RF的接近矩阵的多维标度法来可视化基于微生物群落的BPD组之间的分离。研究人员使用Shannon Beta (Beta多样性的衡量标准)对一个受试者在不同收集时间内的社区进行了比较[40]。此方法扩展了beta多样性度量，使其适用于一组样本，而不仅仅用于成对比较。对于我们的示例，我们使用了以下方法(1)哪里Cijk是否对受试者进行序列计数我,从样本j和分类单元k，下标中的+表示指定指示器上计数的总和。

为了便于临床解释，Shannon-Beta表示为Hill数，表示样本组代表的有效社区数。该测量值取决于计算样本数，范围为1到N（在我们的研究中，N=4）.使用标准化转换重新缩放Hill数，以便在采集样本数量不同的受试者之间进行比较[41]．(2)哪里j我是受试者的样本数我．

计算每个受试者内成对样本的Morisita Horn（MH，β多样性）。使用对数正态模型和广义估计方程对BPD严重程度组的MH和总细菌负荷进行比较，以考虑重复测量。

使用广义线性混合模型，以受试者在标本采集时的年龄作为时间变量，对感兴趣的个体类群进行建模。一个β -二项结合点模型与放置在10天的结匹配，包括随机的受试者效应和组特定的离散参数。通过拟合三次函数，将一阶导数设为零并求解，确定了结的位置。该分析的详细内容见在线数据补充(S1补充信息)．RF使用RandomForest R软件包进行，所有其他分析使用SAS版本9.4软件进行(SAS Institute Inc.: Cary, NC, 2014)。

后果

患者人口统计和样本采集时间

有425名婴儿参加了家长研究。在333名需要机械通气的婴儿中，201名至少收集了一份气管吸液，其中155名至少有一份样本具有足够的细菌负荷，可以进行PCR以进行微生物组分析(图1).中描述了46名样本无法放大的受试者的特征S1表．入组年龄的中位数(范围)为3(0-8)天。在这些受试者中，只有3人没有发生BPD，因此他们由于人数不够进行比较而被排除在进一步分析之外。研究队列的特征列于表1．

缩略图
下载：
表1。受试者特征（n=152）。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.t001

跨BPD严重程度的微生物组横断面比较

横断面数据集仅包括年龄在5-9天的79名受试者:23名轻度BPD, 27名中度BPD和29名重度BPD (S2表).第7天气管抽吸物的细菌总负荷中位数为4.8 log10拷贝数/反应数，范围为3.6至7.5。BPD严重程度组之间无显著差异（p=0.63）。香农阿尔法多样性指数和均匀度（当群落由少量生物控制时，该指标很小）在BPD组之间无显著差异（两者均p=0.39），尽管重度BPD组的香农α多样性和均匀度中位数较高(图2)．BPD组每个受试者的细菌群落显示在图3．大多数样本由葡萄球菌(68%)和Ureaplasma(18%)。相对丰度葡萄球菌在BPD严重程度上没有显著差异(p = 0.47)。

缩略图
下载：
图2。Shannon多样性指数(上)和均匀度(衡量优势度)在5-9天的BPD严重程度组中的分布。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.g002

缩略图
下载：
图3。BPD严重程度组显示7天气管吸出物中细菌群落的相对丰度。

每条条代表一个主题的社区，不同的类群用不同的颜色表示。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.g003

将微生物标记物、α多样性、总细菌负荷量和单个分类群的相对丰度（n=18，包括一个罕见类别——所有样本中罕见的标准为<1%相对丰度）作为预测因子输入RF，以确定最能区分3个BPD严重组的变量。由此产生的RF产生了74.7%的错误率，这表明社区组成和BPD严重性之间的关联性较差(图4)．它正确分类了3例(13%)轻度、9例(33%)中度和8例(28%)重度BPD婴儿。根据微生物标志物，RF不能很好地区分BPD严重程度组。作为敏感性分析，从临床特点出发表1也被作为预测因子纳入RF，但这并没有改善错误率(76%;S1图).包括9个前预测因子的减少子集也没有提高错误率（74.7%）。

缩略图
下载：
图4。由5000棵分类树组成的随机森林(RF)被用来对7日龄BPD严重程度组的微生物类群进行横向多变量评估。

变量重要性图有助于可视化变量的等级重要性。平均下降基尼指数确定了对区分BPD严重程度更为重要的特征。与随机噪声相比，具有较大值的特征表示贡献更多信息的变量；预测变量之间的指数分离随着特征在区分组间变得不太有用而降低（顶部）。使用7天气管吸出物样本RF的邻近矩阵绘制的多维标度图显示，BPD严重程度组之间的间隔很小，这与高错误率相对应（底部）。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.g004

BPD严重程度期间细菌群落随时间的变化

除了横向评估微生物群落，我们还评估了微生物群落随时间的变化。该分析包括来自94名受试者的233个样本(25名轻度、30名中度和39名重度BPD;S3表)。受试者的样本中位数为2，范围为2至4。总细菌负荷随时间平均增加1.05 log10出生后每增加一周的复制/反应(p < 0.01)。从每个受试者收集的纵向样本的细菌群落显示在图5， 3名无BPD的受试者的样本均在S2无花果．

缩略图
下载：
图5。每个受试者的纵向气道微生物组组成按采集日期显示。

从登记时（出生后第一周内）和目标第7、14和21天48小时内的机械通气婴儿中采集样本。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.g005

为每个受试者计算单一Beta多样性测度，即Shannon Beta多样性，以量化多个样本所代表的细菌群落数量。在轻度、中度和重度BPD组中，标准化后的中位数beta多样性值(数值越高表示观察到的社区越多)分别为0.16、0.24和0.31(组间范围相似:0到0.97)。除了单一Beta多样性测度，MH，成对Beta多样性测度，在每个受试者的成对样本之间进行计算。在三个严重组中，MH值(较低值表明微生物循环增加)的平均值(经重复测量调整后的SE)为轻度组0.69(0.58)、中度组0.53(0.41)和重度组0.48(0.39)。与轻度相比，重度BPD的MH值显著降低(p = 0.01)，轻度和中度之间仅略有差异(p = 0.08;图6)．S3图以标本采集的间隔天数显示MH值，表明中度和重度BPD组有更大的社区更替趋势(p = 0.04所有3组;p = 0.05轻度与重度BPD)。两种beta多样性指标都表明，随着BPD严重程度的增加，群落的更替率也在增加。

缩略图
下载：
图6。至少有2个样本的受试者的Morisita Horn（MH）值与疾病严重程度的方框图。

重度BPD患者的MH值显著低于轻度BPD患者（p=0.01），轻度BPD患者和中度BPD患者的MH值仅略有差异（p=0.08）。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.g006

考虑到葡萄球菌和Ureaplasma在许多样本中，我们对这些属进行了建模，以确定这些生物的相对丰度(RA)是否存在一致的趋势。为葡萄球菌，发展为轻度BPD的婴儿14天的平均RA值高于发展为重度BPD的婴儿(p = 0.04)。图7表明BPD严重程度组之间RA的趋势随着时间的推移存在差异。这些数据表明葡萄球菌尽管这些趋势在统计学上并不显著，但在出生后下呼吸道中，BPD的增加率更高，对于BPD较轻的婴儿，其绝对RA也更高(图7，顶部）。RA较高的婴儿Ureaplasma虽然这一趋势在统计学上也没有显著性意义(图7,底部)。对于这两种生物，重度和中度BPD组比轻度组有更多的变异性，这与beta多样性测量的结果一致，同样表明群落变化和BPD严重程度之间的关联。作为敏感性分析，将呼吸机使用时间和皮质激素使用情况作为协变量重新构建模型，结果保持不变(S1补充信息)．个体水平的数据不能很好地用平均趋势来表示，这为允许个体受试者偏离平均的更复杂的模型的需要提供了支持。

缩略图
下载：
图7所示。土壤相对丰度（RA）模型葡萄球菌（上）及Ureaplasma(下)BPD严重程度随时间变化。

较细的线对应于随时间变化的特定对象值，粗线表示基于模型估计参数的平均趋势。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.g007

讨论

我们通过横断面和纵向分析评估需要机械通气的早产儿的下呼吸道微生物组，以确定早期呼吸道微生物组与BPD严重程度之间的关系。在7天大时的横断面评估中，没有证据表明细菌群落与后来的BPD严重程度相关。呼吸道细菌载量和Shannon多样性并没有显示出与BPD严重程度紧密相关的显著模式，无论是其自身还是与临床因素相结合。通过几种方法对气道微生物群落的长期调查表明，可能存在与BPD严重程度相关的时间趋势。尽管特定的微生物不一定与BPD的严重程度相关，但在最终发展为严重BPD的早产儿中，气道微生物群落的变化更常见。具体来说，越严重的BPD婴儿，随着出生时间的增加，细菌群落的更替更大，获得更少葡萄球菌在出生后的第1天，有较高的初始RAUreaplasma．

这些发现很重要，因为它们揭示了早产儿气道微生物组的模式和序列可能是预测BPD严重程度的标志物。虽然这些数据没有提供证据表明气道微生物组直接与BPD有关，但它肯定表明这种可能性值得进一步研究，并可能增加我们对BPD机制的理解。该人群中的预测性生物标志物对渴望获得预后信息的家庭具有巨大的益处，并将有助于指导早期预防和新的治疗策略。识别与结果相关的微生物组模式也将导致临床试验，评估促进有益细菌定植和防止病原菌获得的干预措施（例如益生菌、明智使用抗生素、营养支持的途径和内容），最终预防或减轻早产儿慢性肺病。

目前对早产儿气道微生物组的评估有限[10,11]．我们之前在这一领域的研究仅观察了10名婴儿，他们都被纳入了目前的研究[10]，以及Lohman的研究等．对25名婴儿进行了研究[11]．这项研究代表了来自多家医院的152名早产儿，这增加了研究结果的通用性。以前的研究和现在的研究表明，早产儿的呼吸道可能在出生时不是无菌的，并很快获得细菌群落，通常由单一的有机体主导。这些婴儿呼吸道的细菌可能来自母亲或暴露于NICU的局部环境。不幸的是，这项研究的目的不是评估这些习得途径的不同影响，因为大多数婴儿在出生几天后才收集了他们的第一个样本。这是罗曼的研究et．艾尔.发现不动杆菌是他们机构中经常出现的主导生物[11]，而我们的研究是在两家学术中心附属的多家医院进行的葡萄球菌和Ureaplasma。这些差异表明，婴儿气道中的细菌可能与医院单位本身的细菌群落有关，需要进一步调查。然而，机械通气婴儿气道中定植的不同细菌的范围表明，对特定细菌的简单检测不会成为BPD的可靠生物标志物，可能需要对整个微生物群落进行评估。

的作用Ureaplasma在发展BPD方面仍有争议[42–46]．研究发现，患有更严重BPD的婴儿倾向于有更高的RAUreaplasma在他们的早期过程中，它有可能对BPD做出贡献[42].慢性宫内感染Ureaplasma在早产绵羊模型中，暴露似乎下调了宿主对急性LPS暴露的反应[47]．然而，存在Ureaplasma可能是早产的一种功能，因为Kemp等人发现宿主杀菌活性与胎龄直接相关，杀菌活性似乎与功能性补体活性相关[48]．

细菌群落的更替率是否与BPD的严重程度直接相关是一个有趣的问题。当然，早产儿之间的治疗差异，特别是与抗生素使用有关的治疗差异可能导致这些发现。更严重的BPD患儿可能更经常使用抗生素治疗，因为他们的临床病程更严重，可疑感染的发作更频繁。未来的研究将必须评估抗生素给药对呼吸道微生物组的影响，以及与BPD的发展和严重程度的潜在关联。

微生物组的生态变化与其他人类系统的炎症增加有关。微生物组的获得和组成的特定模式与成人和早产儿肠道的炎症和上皮屏障功能改变有关[49–51]。炎症一直是BPD病理生理学的一个关键驱动因素，被认为是由多种病因引起的，包括产前和产后感染、机械通气和氧中毒。然而，由于早产儿的免疫系统仍在成熟，简单的细菌定植可能足以驱动炎症反应因此，进一步的研究应彻底评估气道微生物组、宿主免疫反应和临床治疗（包括使用抗生素影响早产儿肺发育）之间的相互作用。

本研究有几个局限性。首先，由于气道微生物组分析需要使用气管插管进入下气道，我们无法评估不需要机械通气的婴儿的气道微生物组。因此，我们没有足够数量的机械通气婴儿这并没有发展成BPD。由于缺乏对照组，我们无法确定气道微生物组是否能够区分患有和不患有BPD的患者。此外，由于无创通气技术和无创表面活性剂管理技术的进步，早产儿出生后接受通气的人数减少此外，本研究的结果应仅限于需要有创机械通气支持的婴儿。此外，我们在该队列中没有抗生素施用的数据，因此无法评估其对气道微生物群的潜在影响。最后，这些数据来自二次分析因此，这些结果应被解释为产生假设，并且旨在评估整个微生物组（细菌、病毒和真菌）的相对作用的前瞻性研究是有必要的。

随着利用细菌16S核糖体RNA基因测序对细菌群落的分子检测在研究微生物组对健康和疾病的影响方面取得了势头，越来越明显的是，所采用的方法的不同会导致结果的不同。Hiergeist等人通过对同一样本使用不同的DNA提取和16S rRNA测序技术，证明了9个不同中心的细菌群落检测的可变性，从而引起了人们对这一问题的关注[52]．虽然他们确实发现，在中心内重复使用相同的技术进行分析产生了可靠的结果，但他们确实意料之中地发现，不同中心之间的技术差异导致了细菌检测的巨大差异。大部分的变异可能是由16S rDNA扩增子测序所选择的引物和被覆盖的高变(V-)区域的差异造成的。因此，在试图从一个实验室复制到另一个实验室的结果时，必须仔细注意用于细菌分子检测的方法。在这项研究中，我们采用了跨位点的标准样本收集方案，样本处理、测序和生物信息学在一个实验室使用一致和经过良好审查的方法进行。此外，对横断面和纵向标本应用与本研究相同的技术足以确定在同一时间点从不同受试者采集的标本中是否存在细菌组成的差异，以及个体受试者随时间的变化是否存在差异。然而，由于技术上的差异，确定这些差异的精确效应量是比较困难的。

总之，机械通气早产儿气道微生物群落随时间的纵向变化可能与BPD的严重程度有关。需要进一步评估这些变化是因果关系，还是对治疗或其他导致BPD的因素的变化作出反应。

支持信息

S1补充资料。贝塔二项式参数估计。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.s001

(多克斯)

S1表。样本未扩增的受试者的受试者特征（n=46）。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.s002

(多克斯)

S2表。横断面队列的受试者特征（n=79）。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.s003

(多克斯)

S3表。纵向队列的受试者特征(n = 94)。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.s004

(多克斯)

S1图。使用由5000棵分类树组成的随机森林（RF）对7日龄BPD组的微生物分类群和临床数据（7日龄前可用）进行多变量横断面评估（左）。

使用RF的邻近矩阵绘制的多维比例图显示BPD组之间的间隔非常小，这与高错误率相对应（右）。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.s005

(PDF)

S2无花果。3例无BPD诊断的受试者的微生物组成。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.s006

(PDF)

S3图。来自至少2个或更多样本的受试者的Morisita-Horn多样性值与疾病严重程度。

在中度和重度BPD组(轻度25例，中度39例，重度30例)有更大的社区流动趋势。粗蓝线表示平均趋势。

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0170120.s007

(PDF)

致谢

作者感谢Lucy Fashaw和Leslie Dawn Wilson对这项研究的出色协调和支持。作者感谢所有参与这项研究的婴儿和他们的家庭。

作者贡献

  1. 概念化：JKH PMM。
  2. 数据整理：MKS JKH JIM LM CER。
  3. 正式的分析:BDW CER。
  4. 资金收购:PMM沙。
  5. 方法：BDW MKS JKH CER MS。
  6. 项目管理:BBP PMM。
  7. 资源：JKH PMM。
  8. 监督:PMM。
  9. 可视化：吉姆·m。
  10. 书面–原稿：BDW JKH PMM。
  11. 写作–回顾和编辑：BDW MKS JKH CER BBP SHA PMM。

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