介绍

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种进行性和潜在致命性肺病，预计到2020年将成为全球第五大疾病负担[1]，[2]。慢性阻塞性肺病的特点是很大程度上不可逆的气流限制、粘液分泌过多、小气道纤维化和肺泡空间破坏(肺气肿)。[3]。在发达国家，慢性阻塞性肺病的主要原因是直接接触烟草烟雾，而在发展中国家，生物质燃料燃烧造成的室内空气污染也起着重要作用［4］。并非所有吸烟者都会患上慢性阻塞性肺病，但目前尚不清楚为什么有些人会。由于目前没有治疗方法能阻止COPD的进展，因此迫切需要对其发病机制有新的认识。

从最初对慢性阻塞性肺病的描述来看，它是一种导致非结核病患者生产性咳嗽和呼吸短促的独特临床病症[5]关于下呼吸道细菌在其发病机制中的作用一直存在相当大的争议。无论是长期的早期无症状阶段，还是直到最近不时出现的晚期急性加重阶段，都是如此[6]，可导致肺功能加速和持续丧失[7]。在某种程度上，这种争议的产生是因为经典的、基于文化的研究表明，健康个体的肺部是无菌的[8]，[9]，[10]而COPD患者的肺部被认为是定植的。最近，不依赖培养的微生物学技术证明，在健康期间肺部并非无菌，并记录了几种肺部疾病中肺部微生物组的变化[11]，［１２］，[13]，[14]，[15]。然而，肺细菌微生物组在COPD发病和进展中的作用仍不明确。

我们的两个目标解决了对肺部微生物组与吸烟和COPD相关的理解的两个空白。第一个是通过分析支气管肺泡灌洗液(BAL)来评估既没有疾病迹象也没有肺功能下降的吸烟者(“健康”吸烟者)的肺微生物组，BAL是对肺的广泛区域进行取样，并将其与健康的非吸烟者进行比较。第二个目的是通过分析手术移植的多个样本位置，确定肺显微解剖/微环境差异是否导致COPD局部细菌群落结构的差异。我们通过对细菌16S扩增子进行大规模平行焦磷酸测序来分析这两种类型的样本，这种技术提供了对常驻肺部微生物组的培养独立分析，并提供了以前无法用于肺部生物学和疾病研究的广泛分析。

方法与材料

结果

14例BAL患者的特点见表1。年龄范围为40-78岁(中位53.9岁)，其中7/14为男性，8/14目前吸烟。6例晚期COPD患者均为严重气流阻塞的男性(表2）.1例肺气肿与α -1抗胰蛋白酶缺乏症相关(cs# 6)。

为了解决我们的第一个目标，即确定三组之间的细菌总数是否存在差异，我们在高速离心后从BAL颗粒中分离出总DNA，并通过qPCR测定16S基因拷贝数。在我们研究的每个样本中，检测到显著水平的细菌16S基因信号(图1）.三个研究组之间无显著差异(Log 16S copy #/ml BAL: HS, 8.25±0.25;CS, 8.12±0.40;NS 8.24±0.66±SEM;p > 0.05)。总的来说，在我们14名受试者的BAL液中检测到的细菌水平与先前基于气道无菌刷牙的估计一致［１２］。因此，所有受试者的细菌水平都很显著，不吸烟者和终末期肺病患者之间没有显著差异。

为了比较受试者之间和组之间常驻肺微生物组的细菌群落结构(成员和多样性)，我们接下来使用454焦磷酸测序分析了从BAL样本中生成的16S扩增子文库。在对序列进行质量控制过滤之后，我们使用了rdp分类器[25]为生态分析对序列进行分类。与我们的qPCR分析一致(图1)，在每个BAL样本中都可以很容易地识别出肺驻留细菌群落（图2＆表3）.几乎所有的过滤读数(91%±1.5%平均值±SEM)都可以被分类到属水平，而不考虑受试者队列。我们研究对象肺部的优势门是变形菌门、厚壁菌门和拟杆菌门(图2一个）.在门水平上，大多数HS组之间的细菌群落存在异质性，这与健康不吸烟者(NS)和我们的两名轻度COPD患者(cs# 1和cs# 2)相似。相比之下，中度和重度COPD患者(cs# 3和cs# 4)缺乏细菌群落多样性，两名健康受试者(hs# 4和hs# 7)和一名从不吸烟的受试者(ns# 2)也存在这种情况。

在属水平上(图2 b)，健康吸烟者(HS)和不吸烟者(NS#2和HS#4)的细菌群落除了每组各有一个个体外，差异相当大。对于样品中存在的每个门，通常有一到两个优势属(例如，假单胞菌，链球菌，普氏菌，梭菌属或韦永氏球菌属;图2 b和表3）.在两名轻度COPD患者(cs# 1和cs# 2)中也观察到类似的多样性，但在病情更严重的COPD患者(cs# 3和cs# 4)中观察到多样性的丧失。总体而言，我们受试者的肺部微生物群是多样的，但比口腔和肠道中通常发现的细菌群落更有限[26]，[27]。

接下来，我们使用主成分分析(PCA)分析了属级细菌群落数据，图3一)建立一个社区协调，并研究社区中哪些因素对不同科目之间的差异影响最大。该方法揭示了HS, CS和NS组细菌群落成员之间的广泛重叠。在一个群体中没有共同的细菌，而是不同群体之间的独特细菌，这将一个群体与另一个群体区分开来。因此，在肺部微生物群由单一细菌属主导的受试者中，来自群落内部的产物而不是入侵似乎是合理的。

我们的数据还表明，可能存在组成“核心”肺微生物组的细菌，即在健康受试者的BAL中发现频率非常高(占所有16 s读数的1%)。在超过75%的受试者中发现的候选属假单胞菌，链球菌，普雷沃氏菌和梭杆菌（表3＆图3 b）.嗜血杆菌，韦永氏球菌属，和Porphyromonas在超过一半的样本中也被发现。

我们还通过自组装操作分类单元(OTU)分析的互补方法分析了16S焦焦测序数据，该方法消除了分类方法固有的任何潜在的合并偏差。作为参考，两个全长16S序列之间3%的差异大致相当于基因组水平上的物种水平差异[28]。我们使用这种相似性水平来生成otu，并使用Shannon多样性指数的非参数形式计算多样性指数。与分类分析(图2 b)、基于otu的分析(表4)证实健康吸烟者(HS)中存在不同的细菌群落(np Shannon值越高表明多样性越高)，这与健康不吸烟者(NS)和我们的两名轻度COPD患者(cs# 1和cs# 2)相似。该分析再次发现，中度和重度COPD患者的肺部微生物组多样性要少得多(cs# 3和cs# 4) (表4）.

为了估算某一物种属内的平均物种丰富度，我们还将基于分类器的方法得到的属数与在3%同一性水平下得到的OTU数进行了比较。我们将分析范围分别限制在> %的属数和> %的OTU数。重要的是，该分析表明，人类肺部的物种水平多样性非常有限:每个受试者中每个属大约有两个OTU，但cs# 3除外，它有10个(表4）.总体而言，OTU和基于分类器的方法都表明，所有受试者的肺部都含有多样化的常驻细菌微生物组，在亚属水平上仅显示有限的丰富度。

为了解决BAL样本中的细菌是否反映了手术过程中使用的支气管镜对上呼吸道的污染这一关键问题，我们从8个在移植过程中切除的COPD肺移植体(6个单移植和2个双侧移植)中取样了多个组织部位。所有从移植肺中取样的组织都含有易于识别的细菌群落(图4）.由于BAL是对远至支气管段或亚段的多个气道和肺泡进行采样，我们首先将所有个体测序读数结合起来在网上从所有单叶组织样本中取手术标本，并进行单独分析。三个叶片的细菌群落分布均以该属为主假单胞菌（图4一、组织)，这与我们的严重慢性阻塞性肺病受试者(cs# 4)和其他一些人(图2）.因此，对外植体组织的直接取样表明，BAL样本中的细菌群落是肺部常驻微生物，而不是支气管镜污染的结果。

接下来，我们比较了个体组织部位，以确定晚期COPD患者肺内细菌群落是否存在微观解剖差异。每个耳垂有4到8个不同的组织位点，总共有44个组织位点。在术前CT图像中，这些受试者的任何组织部位均未见明显的支气管扩张改变。图4 b图示两例患者的CT图像;其他4名患者也出现了类似的结果(数据未显示)。然而，尽管结构正常，但同一肺内的细菌群落组成存在显著差异。这在受试者cs# 6的左上叶中尤为明显。嗜血杆菌在LUL的节段支气管中占主导地位。Stentrophomonas主要发生在左肺远端支气管。形成鲜明对比的是，假单胞菌主要分布在中上支气管和同一肺内的许多其他部位。额外的外植叶也表现出微观解剖的异质性。cs# 7RL的组织位点间差异最为显著，而cs# 8RL的所有组织位点几乎完全由假单胞菌（图5）.这些数据首次表明，细菌微生物组的显著区域差异可以存在于个体受试者中。

接下来，我们基于采样群落的Bray-Curtis距离构建了最近邻连接树，以比较cs# 5和cs# 6不同地点的细菌群落之间的beta多样性(群落间多样性)。图6）.大多数样品的布雷-柯蒂斯距离较低，说明样品之间的相似性较大。然而，CS#6 LUL节段样本和CS#6 LUL远端样本在主组之外聚类，并且彼此之间具有高布雷-柯蒂斯值，表明高度不相似。我们再次使用PCA排序来确定驱动单个样本之间差异的因素(图6 b）.这一分析表明，样品中的微观解剖变化是由显性驱动的假单胞菌，嗜血杆菌,或Sentrophomonas在现场。

对otu的分析(基于3%的差异)表明，同一肺内组织部位的otu数量甚至同一肺叶内的otu数量也存在显著的数值差异(表5）.一个有趣的观察结果是，在由单一属(假单胞菌)， otu的数量往往存在明显的异质性。例如，我们在cs# 5的右叶和cs# 3的BAL的许多区域观察到这一点(图2 b＆表3）.这些样本的OTU和基于分类器的分析彼此一致，并清楚地表明，在晚期COPD受试者的同一肺内，细菌群落可能存在显着的微观解剖差异。

讨论

这项研究使用细菌16S扩增子的大规模平行焦磷酸测序，提供了一系列受试者的微生物群的新信息，包括健康的非吸烟者，肺功能正常的吸烟者，以及伴有轻度或重度肺量测定疾病的稳定COPD受试者。我们展示了三个关键发现。首先，健康吸烟者的肺部含有一种细菌微生物群，在数量上是显著的，多样的(但成员数量有限)，与口腔或鼻咽部的报道截然不同[26]。其次，肺功能下降的受试者肺部细菌微生物组的多样性通常较低，最常见的是与由假单胞菌spp。第三，该研究首次描述了肺内众多的微观解剖部位可以引起细菌群落结构的显著差异。

我们目前的研究以前所未有的深度检查了肺部微生物组，平均每个样本约12,000个序列。这明显更大的测序深度增加了信心，我们有足够的肺部采样，以准确表征微生物肺群落。我们对来自健康吸烟者的BAL的研究与最近在健康个体中发现的多样化的细菌肺微生物群是一致的［１２］，这项研究在整个研究中总共有大约3000个序列读数。

重要的是，与肺功能正常的吸烟者相比，我们发现一些吸烟者的肺微生物群多样性较低，这表明肺微生物群的改变可能发生在没有肺量测量证据的受试者中。这种多样性的相对减少是持久的，是慢性阻塞性肺病特征的炎症变化的影响，还是可能部分促成疾病进展，这些问题都需要在更大的受试者群体中进行纵向随访。我们的结果与另一个粘膜部位胃肠道的发现一致，在胃肠道中，微生物群多样性的减少与炎症性肠病的发病率增加有关[30]，[31]。肺群落生态失调可以提供慢性阻塞性肺病患者长期观察到的持续炎症刺激[32]。因此，在肺部，与粘膜的其他部位一样，多样化的微生物群可能对健康很重要，包括定植抗性、上皮完整性和免疫调节[33]，[34]。

总的来说，我们的结果为描述的作用提供了一个统一的框架假单胞菌和嗜血杆菌COPD的发生、进展和/或恶化在使用非培养技术之前，嗜血杆菌这种微生物最常从COPD肺样本中生长吗[35],假单胞菌经常提到[36]。目前的研究表明，即使在健康的条件下，这些生物也普遍存在。虽然必须进行更大规模的研究，但我们的数据支持一个模型，即肺部微生物群落中有机体的优势与疾病相关。

我们还表明，由于肺气道微结构的局部差异，从肺部不同气道采集的样本可能包含非常不同的细菌群落。这一结果在一个移植受者的左上肺叶气道中最为明显(图4)，其中细菌群落由一个细菌属(嗜血杆菌)，而在其他气道中没有检测到高水平。之前的一项研究［１２］发现慢性阻塞性肺病与存在嗜血杆菌在左上裂片的无菌刷中的属。乍一看，这一发现似乎与由假单胞菌在我们的研究中使用BAL样本，在COPD严重急性加重的研究中使用气管内吸入物[13]。然而，由于COPD病理在解剖学上可能是异质的，我们观察到肺微结构允许在疾病期间发展不同的局部微生物群落，这为所有基于细菌在COPD进展中的作用的培养和独立研究提供了一个统一的假设。

肺部细菌群落在空间上的不同可能对我们理解肺部健康和疾病非常重要，因为微生物组的解剖变异正在成为解剖其他身体部位疾病机制的焦点。例如，与未患病的邻近区域相比，易患皮炎的皮肤区域具有不同的微生物群落[37]。同样，牙齿之间微生物群落结构的差异也容易导致同一口腔内的疾病[38]。从机制上讲，与无疾病的牙齿相比，患有牙周病的牙齿中的微生物群落在局部富含产甲烷太古菌[38]。虽然这些微生物不会致病，但有证据表明，它们改变了当地的环境，使已知的致病细菌能够茁壮成长。类似的致病性共向相互作用也可能存在于肺部。我们观察到肺上叶最显著的微观解剖群落差异，这与COPD肺气肿最常始于肺上叶的临床观察相一致。

我们研究的局限性包括缺乏口咽样本和相对较小的样本量。而后者是一个未来研究的问题，前者将在这里处理。口咽样本作为肺部微生物学研究的对照，其根源在于认为肺部应该是无菌的;因此，口咽取样的目的是为了排除污染。然而，尽管缺乏这个样本，我们可以证明，我们已经确定的肺部微生物群不是污染的结果。首先，在有关BAL中检测到的16S含量过高，无法与污染相符(图1)，但高到足以与低水平的殖民化相一致。第二，尤其是变形菌的优势假单胞菌。在BAL样本中，与鼻腔完全不同，鼻腔以放线菌门为主[26]口咽部，主要是厚壁菌[26]。在一些实验对象中，变形杆菌在口咽中有较大的存在，但从未遇到假单胞菌[26]。最后，当直接对外植肺的气道取样时，鉴定出的细菌与BAL样品中鉴定出的细菌相同。然而，我们所有的晚期COPD外植体都缺乏在“健康吸烟者”对照中观察到的多样性。总的来说，这些数据有力地证明，肺部的气道是一个独立的微生物栖息地，我们的结果不仅仅是污染的结果。

总之，这些结果表明，在研究COPD时，需要以系统的、解剖学相关的方式考虑肺微生物组和宿主炎症反应。我们相信CT成像将是这一努力的核心。通过证明一个人的肺部可以同时容纳“健康”微生物群的一般区域和包含“致病”群落的单个位点，我们的研究结果表明，肺部病原体和宿主免疫的相互作用可能有助于局部疾病进展的机制，即使没有明显的恶化。

支持信息

致谢

作者感谢dr。詹姆斯M.贝克，詹姆斯C.霍格，荷马Twigg，卡洛斯H.马丁内斯有益的讨论;Catherine Spino博士和Glen Feak博士提供数据库支持;赵刘健协助组织处理;克里斯蒂·盖蒂和凯瑟琳·梅尔德鲁姆为患者招募提供支持;以及玛丽·弗里尔、乔伊斯·奥布莱恩和丽贝卡·威克斯的行政支持。我们还要感谢斯科特·多德博士对焦磷酸测序的帮助。