介绍

哮喘是一种异构综合征的断断续续的喘息和气道炎症在全世界影响3亿人。尽管其原因是未知的,许多研究表明微生物群在其病因学的作用[4]。病毒感染是季节性的重要诱发哮喘的发作[5],但有间接证据表明,细菌感染可能也扮演了一定的角色。无症状的新生儿的喉咙殖民链球菌引起的肺炎,流感嗜血杆菌,或莫拉克斯氏菌属复活的风险增加,在生命早期反复喘息和哮喘[6]。这些细菌一直伴随着哮喘的发作[7]和慢性阻塞性肺疾病(COPD)[8]。哮喘病患者抗生素的反应也表明急性和慢性细菌感染的重要性在疾病的发病机理[9]。流行病学研究一贯表明在早期生活赋予丰富的微生物环境保护发展的哮喘[1],表明需要理解的程度和性质正常呼吸道菌群。

除了哮喘、呼吸道感染、排除肺结核,导致全球疾病负担的6%,每年有420万人死于下呼吸道感染。值得注意的是,死亡在1918 - 1919年,1957年和1968年的流感大流行造成最常见的继发性细菌性肺炎引起的生物可能是以前出现在呼吸道[10],[11]。

慢性阻塞性肺疾病(COPD)与哮喘和有许多共同特征是全球第四大死因。传染性疾病的发作是一个常见的死亡原因,和慢性感染导致肺功能的逐步下降。

因此,尽管强有力的证据表明细菌感染和呼吸道疾病的发病机理,不幸的是,一个生物体的系统研究航空公司一直缺乏[12]。

只有1%的细菌可以在实验室里培养[13],所以文化不再是黄金标准的诊断感染。文化无关的分子方法已经表明,人类微生物群中更大的程度上比之前的认可[14],[15],[16]。人类是进化关系的认可与共生细菌对健康是必不可少的。生态变化改变这种共生关系会导致疾病[17]。

因此,我们使用多态细菌的分子分析16 s rrna基因特征的构成细菌社区成人受试者的航空公司包括哮喘和慢性阻塞性肺病患者。我们寻求复制的结果从这些成年人在一个额外的研究哮喘儿童参加诊所。

结果

24成人受试者进行了研究,包括5 COPD患者,8 11哮喘患者和对照组没有以前的历史哮喘或慢性阻塞性肺病和FEV1≥95%的预测(表1)。无菌干燥cotton-headed拭子是用来样本从鼻子和口咽(OP)的所有科目(n = 24),并通过鼻支气管镜检查路线被用来获得重复细胞学刷牙在左边上(LUL)在23个学科。所有受试者的临床感染的研究。

我们从测序克隆库16 s rRNAPCR产品23、24和21个样本鼻子,分别OP和LUL。非常弱的放大产品从三个学科获得最低的细菌复制数字和我们没有确定细菌序列从这些库。1081年排除可能的嵌合体,鼻后,1100 OP和1068 LUL序列进一步进行分析。

不同的个体细菌序列(定义为操作分类单位(辣子鸡))与DOTUR项目被确定。我们估计细菌多样性,或不同类型的细菌的数量(辣子鸡)可能存在,曹国伟1统计数据(使用截止≥97%的序列的身份)。这种分析建议的存在126辣子鸡(95%可信区间[CI] 97.7 - -194.8)在鼻腔样本,229年(95% CI 142.9 - -434.1)辣子鸡OP和128年(95% CI 106.9 - -179.0) LUL样本。这些估计数字表明,我们发现62%的辣子鸡的鼻子和68%的LUL辣子鸡,但只有35%的多样性相机会鼻子和LUL中的值具有可比性研究估计已经确定了68.3%和74.0%的人类远端食管辣子鸡[18]和前臂皮肤表面[19]分别。

我们结合鼻子,OP和LUL序列在一起产生一个全球DOTUR分析航空公司。这个发现190辣子鸡的97有超过一个序列。高度丰富的辣子鸡属于属普氏菌,链球菌,葡萄球菌,奈瑟氏菌属,棒状杆菌属和嗜血杆菌。(图1)。

我们使用进化枝的分析来研究类群的分布和高度丰富的属不同气道水平(图2和表2)。鼻标本高度显著的特点是放线菌(特别是棒状杆菌属spp。) (P_c< 10⁻⁵¹),厚壁菌门(特别是葡萄球菌spp。) (P_c< 10⁻⁸⁹)。最常见的细菌在OP拟杆菌门(特别是普氏菌spp。) (P_c< 10⁻²⁵),LUL包含更多的样品嗜血杆菌种虫害比其他网站(P_c< 10⁻¹⁰)。

整个微生物群落的比较显示,鼻微生物群的所有表型明显有别于OP和LUL (图3)。OP的健康与OP哮喘病患者的样本和控制集群控制的LUL。哮喘和慢性阻塞性肺病患者的LUL样本聚集在一起,连同OP COPD患者的样本。这些研究结果表明,健康的微生物群LUL是类似于健康的OP,但LUL微生物群不同于正常OP和LUL样本在哮喘和慢性阻塞性肺病。分析还表明,微生物群在COPD患者改变在OP LUL,或许是由于暴露于香烟烟雾中这两个地区。

我们接下来研究LUL样品详细的呼吸道疾病的关系。两个系列的23个标本左侧上部叶(LUL)一式三份,细菌计数分析。的16 s rRNA拷贝数的估计指出一系列2 - 7500每40 ng细菌基因组总DNA,或平均的2.2×10³细菌基因组每厘米²表面取样(范围62 - 2.1×10⁵基于估计刷2厘米²和16 s rRNA每个基因组基因的一个副本。重复LUL刷牙了高度可再生的数量(枪兵的ρ= 0.667,P< 0.001)。我们排除了sample-specific PCR抑制在较低的对象复制数字通过展示放大等效强度为所有的人类DNA样本。

均值的估计每厘米2000细菌基因组²表面采样从LUL刷牙是比得上估计上三分之二的小肠[20]。呼吸道细菌计数是一个数量级低于50000 /厘米²确认的16 s rRNA放大的差点从正常皮肤[16],尽管20000年的最大计数我们观察到在一个哮喘接近这个数字。

基因组拷贝数估计在吸烟者明显降低(Mann-Whitney U测试Z =−3.92,P< 0.001)。吸烟的类似的效果观察重复样本(Z =−4.25,P< 0.001)和鼻计数(Z =−2.38,P= 0.016)。的标本RLL LUL在相同的范围。没有发现差异数年龄或性别。它可能有关,吸烟也已被证明能够影响细菌生长在炎症性肠病(IBD)[21]。

我们进化枝的协会进行分析测试的频率差异之间的特定类群和属学科组(图4一和表3和5)。我们发现门变形菌门的高度更经常发生在慢性阻塞性肺病(P_c< 10⁻¹⁴)和哮喘(P_c< 10⁻¹³)组相比,控制(表3)。相比之下,拟杆菌门成员更常见的控制而患病的学科(P_c< 10⁻⁴控制与慢性阻塞性肺病;P_c< 10⁻²控制和哮喘)。属的成员嗜血杆菌最密切相关的慢性阻塞性肺病(P_c< 10⁻⁴)和哮喘(P_c< 10⁻⁷)(表1 d)。

为了确认相同的细菌是否在健康和疾病相关的一组不同的病人我们研究一个额外的13(5女)哮喘和7(3女)控制个人通过三级转诊诊所招募困难哮喘在皇家主管布朗普顿医院(地铁站表4)。哮喘儿童的平均年龄为11.8±2.8年和控制为11.3±5.7。所有的科目考试前服用抗生素,感染的所有科目被认为是免费的。Broncho-alveolar灌洗(BAL)是通过光纤进行支气管镜,DNA提取,克隆库创建并测序。

我们分别获得1135年和670年序列哮喘和控制个体。基于97%序列的身份,这导致97 124.3 (95% ci 108.3 - -163.2)和68 85.1 (95% ci 73.7 - -119.4)辣子鸡哮喘和控制个体。一起把所有科目,131辣子鸡被检测到。

我们发现从类群的分布,变形菌门相比,哮喘儿童更频繁的控件(P_c< 10⁻¹³),而Bacterioidetes比在哮喘患者(更常见的控制P_c< 10⁻¹⁶)(图4 b和表5)。在属的水平,哮喘受试者的特点是多余的嗜血杆菌spp。(P_c< 10⁻¹²),葡萄球菌spp。(P_c< 10⁻²),而普氏菌种虫害在控件(更频繁P_c< 10⁻³⁰)。

讨论

我们的结果挑战传统医学教学,较低的航空公司是无菌的,和显示支气管树包含一个微生物菌群特征,健康和疾病之间的不同。不育的概念来自于一个有限的年龄实验获得健康的航空公司,是基于120年古老文化技术现在认可检测细菌的一小部分在复杂样品[13]。事实上,主要的殖民者在我们控制受试者厌氧菌等普氏菌。,只能生长困难的文化。微生物群随处可见即使在最不利的环境下,它将是非同寻常的,如果降低气道能够保持不育的高容量与口咽潮湿气流通过一个开放的沟通。

我们的结果显示强烈的相似性之间的呼吸道微生物群成人和儿科哮喘患者和控制(图4),尽管两种抽样方法(支气管刷牙和BAL)。引人注目的是,门变形菌门的成员非常与两组呼吸道疾病密切相关。门包含重要的潜在的病原体嗜血杆菌,莫拉克斯氏菌属和奈瑟氏菌属spp。

这些关联,尽管健壮的、尚未之间建立因果关系存在的病原体和呼吸道疾病。受试者的数量很小,不得代表大多数情况下的哮喘。我们成人控制是健康的,但童年控制临床适应症的支气管镜检查包括气管软化,gastro-oesophageal回流,房间隔缺损症状都可能导致呼吸道粘膜异常。过去也不知道在多大程度上使用抗生素以应对呼吸道疾病的症状可能会决定我们检测到细菌物种的模式。也有可能存在的病原体在哮喘气道是次要的粘膜未知异常的原因。

尽管有这些警告,它是惊人的嗜血杆菌,莫拉克斯氏菌属和奈瑟氏菌属种虫害发现哮喘气道的我们也可以携带的风险增加哮喘在早期生活中发现新生儿咽喉拭子[6]。应该因此被认为是可能的,这些病原体的存在可能有一些影响慢性气道炎症,即使低于常规文化的门槛。此外,较低的存在人类然而主导人口潜在的病原体可能提供一个全面的衬底否则自限性病毒感染后细菌感染[22]以及大流行性流感[10],[11]。

我们不知道任何试验的抗生素管理以外的哮喘的急性发作[9],但它可能是相关的,长期的成功所需的抗生素治疗慢性哮喘重叠综合征的湿咳嗽[23]。有效的疫苗的可用性流感嗜血杆菌也可以开辟新的治疗可能性为个人的呼吸道疾病的特点是持续存在的病原体。

我们的数据表明,葡萄球菌种虫害也存在于过剩与困难的哮喘儿童的航空公司,并很有可能更广泛的探索与哮喘儿童和成人将确定与疾病相关的各种生物,包括支原体种虫害和衣原体spp。[24]和链球菌spp。[6],可能定义亚型的综合症。纵向研究时需要遵循微生物群的变化的一个突出特征的急性加重哮喘和慢性阻塞性肺病。

拟杆菌门(特别是普氏菌spp)。对照组中更常见患病的个体。普氏菌革兰氏阴性厌氧菌承认是正常口语的一部分吗[25]和阴道菌群,主要从呼吸道分离厌氧革兰氏阴性杆菌感染及其并发症。他们在大量的被发现16 s rrna测序患儿的肺囊性纤维化[26]。我们的研究结果表明,普氏菌和韦永氏球菌属种虫害的正常菌群是一个独特的组成部分肺以及其他潮湿的上皮细胞,在正常的航空公司,他们的存在可能没有被普遍认可的,因为他们的厌氧培养要求。

拟杆菌的减少哮喘和慢性阻塞性肺病患者相比,控制也可能与疾病相关。IBD患者的一项调查显示,10倍降低总细菌负荷和拟杆菌的减少量与控制[21],与在我们的病人的发现一致。它可能是相关的普氏菌种虫害直接抑制其它细菌的生长[27]。共生的细菌引起紧张性信号在肠道上皮细胞,防止先天和适应性免疫反应的激活[28],[29]共生细菌,抑制免疫反应的病原体鼻粘膜[30]。有可能是类似的机制可能描述健康的航空公司。

材料和方法

批准的成人研究Connolly医院伦理委员会,和充分知情同意在写作从每个病人。批准的研究儿科患者被皇家主管布朗普顿医院伦理委员会,地铁站和书面知情同意从父母和适龄同意孩子在每种情况下获得的。

24成人受试者进行了研究,包括5 COPD患者,8 11哮喘患者和对照组没有以前的历史哮喘或慢性阻塞性肺病和FEV1≥95%的预测(表1)。哮喘严重程度是基于吉娜标准(http://www.ginasthma.com/)。最近抽烟被定义为电流/(在过去两年),过去两年多(不吸烟),从来没有。受试者包括在研究吸烟的状态无关。所有患者的欧洲血统,从都柏林。患者接受常规治疗的24小时之前的调查。没有服用抗生素的病人的研究中,所有受试者临床感染被认为是免费的。

无菌干燥cotton-headed拭子是用来样本从鼻子和口咽(OP)的所有科目(n = 24)。随着异丙酚作为一种短效镇静剂代理和当地利多卡因麻醉上呼吸道,支气管镜检查是通过鼻路线执行。奥林巴斯Endotherapy一次性鞘细胞学刷子(型号bc - 202 d - 5010) 5毫米直径和10毫米长度是用来刷在左边上(LUL)和下叶(RLL)。LUL重复刷了,试图在每种情况下达成更多的远端。一个病人患有严重哮喘无法容忍一个支气管镜检查。LUL刷牙也因此进行了23个学科。十四的受试者(五个控制;三个COPD受试者和六个哮喘受试者)足够舒适允许RLLs抽样。约2厘米²支气管粘膜覆盖每一个刷牙。样本立即处理或存储在2毫升管在晚上−20°C之前被处理。

我们还研究了13个儿科患者困难哮喘和七non-asthmatic控件(表2)。困难的哮喘症状被定义为需要救助支气管扩张剂每周至少三天,尽管治疗至少1600µg /天的吸入布地奈德(或同等),以及定期长期代理β2受体激动剂(或以前的试验失败的表演β2受体激动剂),和/或定期强的松[31]。所有的受试者服用抗生素的研究和临床感染被认为是免费的。15个孩子是白人,三是非洲起源和一个孩子的混合血统(表4)。研究了父母和所有科目或完整的伦理批准给书面知情同意。

在儿科支气管镜检查受试者表现如前所述[31]。落下帷幕,三整除的生理盐水(1毫升/公斤,最大40毫升)被灌输正确的中部叶通过支气管镜和检索的流体机械吸。0.4 8毫升BAL液体之间检索和离心机和随后的颗粒保持DNA提取。三个病人的颗粒被用于不同的研究。因此我们再次离心剩余的上层清液和处理这些次要的小球。

样品在450年暂停µl裂解的解决方案(20毫克/毫升溶菌酶;20毫米三羟甲基氨基甲烷·盐酸,液pH值8.0;2毫米EDTA)和孵化1 h在37°C和偶尔的涡流。按照制造商的指示执行后续的DNA提取(DNeasy试剂盒)。纯化的DNA在40µl resuspended analar水和DNA的浓度决定使用Nanodrop nd - 1000分光光度计。长期存储样本保存在−20°C。股票包含20 ng /µl和10 g /µl总DNA样本准备LUL, RLL和鼻子和这些股票被储存在4°C。

量化每个样品的细菌的DNA含量,2µl每个准备工作包含股票被用作模板PCR反应16 s rRNA基因引物63 f -5′GCAGGCCTAACACATGCAAGTC-3′和355 r -5′CTGCTGCCTCCCGTAGGAGT-3′(最终引物浓度0.2µM)反应和循环条件如前所述[16]。包括一个标准曲线放大系列稀释已知数量的大肠杆菌在存在20 ng /µl人类DNA。左侧上部,下部叶样品用来计算功能复制数字是:C_t1=−3.62 x + 35.46 R²= 0.994;C_t2=−3.76 x + 36.30 R²= 0.996和C_t3=−3.73 x + 36.05 R²= 0.996。鼻拭子,使用的功能是:C_tN=−3.70 x + 35.91 R²= 0.997。复制数据计算方法大肠杆菌有4500000个基点。初步实验显示没有抑制放大大肠杆菌在人类DNA的存在和确认结果描述的地方[16]。基因组的差异统计数据评估使用非参数测试为Windows 16.0许可证。

测序分析16 s rRNA使用引物339 f -基因放大5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAGT-3′[15]和907 r -5′-CCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′[32]。25µl PCR反应是建立包含2µl模板,2.5µl 10×缓冲区(罗氏应用生物系统公司),和最终的浓度1.5毫米Mg, 6% DMSO, 0.5µM底漆,0.8毫米总核苷酸(0.2毫米)和1 u HotStart聚合酶(罗氏应用生物系统公司)。循环条件是95°C的一个周期为5分钟,然后32 95°C的周期30年代,55°C 30年代和72°C的60年代之后,最终扩展72°C的5分钟。

放大后,PCR产品1%琼脂糖凝胶上分离,并带相应的目标产品(∼550 bp)被切除。PCR产物的克隆和测序,21日,23日,24日和20个主要LUL,鼻子,OP和BAL样品分别。放大产品的低浓度3样本是归因于低细菌计数和阻止可靠的测序。PCR产品从凝胶中提取片使用Qiaquick提取工具根据制造商的指示(试剂盒)和resuspended 40µl analar水和储存在4°C到进一步使用。

纯化PCR产品被克隆到pGEM-T简单向量(Promega)按照制造商的指示。48至72每结扎殖民地是随机挑选出来的。质粒DNA使用试剂盒纯化质粒Miniprep装备根据制造商的说明和使用底漆SP6测序。在实例序列从SP6底漆是低质量,替代DNA链使用T7引物测序。色谱图上传到了核糖体DNA序列数据库(http://rdp.cme.msu.edu/),矢量序列修剪(使用露西程序)和剩余序列质量控制检查(使用phr)。高品质下载序列,引物地区另外削减,只有全长序列从359年到906年(大肠杆菌编号的16 s rRNA包括基因)进行进一步分析。

序列与纳斯特[33]和ClustalW。手动校准是策划和结果检查嵌合体与柏勒罗丰版本3[34]在绿色煤电网站(http://greengenes.lbl.gov)。使用标准稍微调整设置(匹配长度核心= 400和窗口大小为200)假定的嵌合体是识别和排除在后续分析。

距离矩阵计算高质量的一对明智的距离序列创建绿色基因网站(http://greengenes.lbl.gov/cgi-bin/nph-index.cgi),屏蔽hyper-variable地区巷面具效用。辣子鸡指定使用DOTUR(基于距离OTU和丰富的决心)[35]由furthest-neighbour算法。曹国伟1丰富多样性的措施被同一个程序估计。创建的系统发育树,砍掉97%是集和每个OTU被分配一个有机体的名字基于核糖体数据库的系统发育位置使用序列匹配(20最佳匹配序列定义taxanomic排名)和与NCBI BLAST结果相比的百分比序列的身份。

进化枝的关联分析作为协会的映射方法[36]。的方法是基于这样的观察:每条边在种系发生树定义了一个分裂的辣子鸡。P值计算之间的协会组织和分裂和疾病之间的联系个人和分裂的状态。双尾确切概率测试执行每个分裂,紧随其后的是一个保守Bonferroni调整中的应用[37]多个测试。

UNIFRAC度量措施之间的距离社区分支长度的百分比,导致后代从唯一的一对环境代表在一个单一的系统发育树,即进化的一部分,是独特的微生物群落之一。度规因此之间的差异反映了血统,适应具体住在一个环境或其他人[38]。系统发育树的基础上16 s rRNADNA序列作为输入来衡量之间的区别细菌社区哮喘,慢性阻塞性肺病和控制使用UNIFRAC。

为图1的数字16 s rRNA基因phylotypes(辣子鸡)计算99%序列身份DOTUR最远的邻居聚类的项目。使用单一序列对于每个OTU,进化距离计算与Jukes-Cantor (tree-Markov)模型和phlyogenetic树由Neighbour-Joining方法,生成的1000棵树。引导树节点的信心水平显示值≥50%。所标明的链球菌和奈瑟氏菌属粘膜/新铸的卢比/黄颜色是如前所述[39],[40]。

细菌社区比较PCR库确定加权UniFrac和所显示的关系未加权的两组与算术平均法(UPGMA)。序列的相同的表型与临床网站是汇集和序号标注。树有100%的身份作为输入。仅从他们3个人网站导致细菌序列(包含20 24个人;2871 3259年的序列)。

序列是存储为基因库入世GQ360090-GQ365143。

确认

我们感谢简·亨森在国家犹太医院在丹佛为她鼓励从事这项研究。