数据
文摘
背景
尽管有强有力的证据表明感染的发病机理支气管肺的发育不良(桶),细菌培养方法的局限性杜绝气道生物相对于疾病的系统的研究成果。应用分子细菌鉴定策略可以提供新的见解的作用细菌的航空公司收购早产儿的风险桶。
方法
系列(72小时内、7、14和21天的生活)气管吸入样本收集从10早产儿出生时胎龄≤34周,和出生体重500 - 1250克需要机械通风至少21天。样本分析定量实时PCR检测为通过焦磷酸测序获得的总细菌负荷和细菌鉴定。
结果
受试者被诊断出患有轻微(1),中等(3),或严重(5)桶。一个病人死前确定疾病的严重程度。107487序列进行了分析,意味着3359(范围1724 - 4915)/样品。2的10个样本收集< 72小时的生活包含足够的细菌的DNA序列分析成功,其中一个来自一个主题暴露于绒毛膜羊膜炎。所有其他的样品表现出细菌负荷> 70册/反应。72生物被观察到。七个生物代表占主导地位的有机体(> 50%的序列)在31/32样品与积极的序列。主要生物代表>序列在13个样本总数的90%。葡萄球菌,Ureaplasmaparvum,Ureaplasmaurealyticum是最常发现占主导地位的生物,但假单胞菌,肠球菌,埃希氏杆菌属也确定了。
引用:Mourani点,哈里斯JK,桑塔格可,罗伯逊CE、Abman SH(2011)的分子识别细菌在气管吸入流体机械通风早产儿。《公共科学图书馆•综合》6 (10):e25959。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0025959
编辑器:Josef Neu,佛罗里达大学,美利坚合众国
收到:2011年6月24日;接受:2011年9月14日;发表:2011年10月10日
版权:©2011 Mourani et al。这是一个开放的文章下分布式知识共享归属许可条款,允许无限制的使用、分配、和繁殖在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。
资助:这项工作是由美国国立卫生研究院的资助,国家研究资源中心K23 RR021021,http://www.ncrr.nih.gov/和科罗拉多临床与转化科学研究所UL1 RR025780,http://cctsi.ucdenver.edu/Pages/index.aspx;国家心肺血液研究所R01 HL085703,http://www.nhlbi.nih.gov/;脱粒机的研究基金,http://www.thrasherresearch.org/。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。
介绍
摘要肺发育不良(BPD)最初被归因于机械通气和氧诱导肺损伤在婴儿早产,Northway及其同事于1967年第一次描述了[1]。炎症的发展中从这些干预措施和其他原因肺是一个占主导地位的理论基础thepathogenesisof桶[2],[3]。产前和产后的炎症,包括感染,可能直接影响肺的增长[4],使婴儿更容易患上桶[5],[6]。因为胎儿发育通常发生在一个无菌的环境[7],过早暴露和殖民新生儿呼吸道的细菌可能会影响新生儿的免疫反应,增加早期和晚期感染的风险,导致桶的后续发展。最近的研究表明,气道殖民与特定的生物在新生儿期与持续喘息的童年[8]早期,这表明特定的细菌接触和/或主机响应导致未来疾病。然而,对细菌接触的时间,而且在早产儿的航空公司,收购机制,促进或阻碍特定生物体的殖民,细菌或殖民的炎症反应与损伤发展的肺。
最近开发的分子方法表明,肺部健康的年龄较大的儿童和成年人与微生物丰富,导致气道殖民的新的理解和挑战了传统理论认为,人类更低的航空公司是不育的[9],[10]。这些方法进一步表明,传统文化并不是足够的调查的贡献对疾病的微生物群落。除了常见的细菌生物很容易培养,有明确的识别潜在的病理影响的其他细菌,如Ureaplasma,支原体,衣原体围产期感染的原因,可能会增加桶的后续发展的风险[11],[12],[13],[14]。因此,传统文化的方法可能不够敏感,提供有意义的信息,许多潜在的病理生物体早产儿可能会影响结果。文化无关分子技术提供机会鉴定生物样品中的细菌的全谱,这些方法可能会提供新的见解的角色的呼吸道细菌采集新生儿早产婴儿和桶的发展。分子细菌鉴定方法可以详细的总细菌负荷在一个示例中,细菌的多样性,和相对丰富的基于特定的细菌样本序列的相对比例。
因此,我们推测,不同微生物菌剂发生早期殖民在通风早产儿,出生后早期,应用分子连续气道细菌识别策略可以定义样品微生物的变化在婴儿患慢性肺部疾病的风险。为了研究高危病人的呼吸道微生物桶,我们进行了分子鉴定细菌的串行气管插管早产儿的吸入样本通过隔离rRNA基因收获PCR确定细菌社区的组成和收购的时机在更低的航空公司。我们比较这些结果通过临床表示标准实验室培养和抗生素的时间描述政府与气道细菌社区的识别。
方法
研究人群
所有的数据和样本获得作为一个前瞻性观察研究协议的一部分,多个机构审查委员会批准的科罗拉多。收到书面知情同意父母/监护人的所有参与者。同意并没有因为所有参与者获得婴儿。入学标准包括妊娠年龄34周,出生在前72小时内,和出生体重500 - 1250克。纳入本研究分析,婴儿还需要插管在上呼吸道的登记和保持至少21天与成功的气管吸入样本在每个4倍点(72小时内出生,7、14、21天的生活)。排除标准werelethal先天异常、复杂先天性心脏病材料(里面包括心房中隔缺损剪辑大于1厘米和心室septaldefect大于2毫米),或预期出院前死亡。孕产妇的病史包括怀孕和生育并发症、和主题数据,包括临床呼吸道获得文化和抗生素管理NICU收集的前瞻性研究。桶的地位在36周评估概念时代通过头部罩后氧气减少测试如前所述[15],在科罗拉多州丹佛市anddisease严重性categorieswere调整为海拔(1600米)。
标本采集和处理
气管吸入收集的滴剂0.5 mlof无菌0.9%生理盐水(没有防腐剂)通过气管导管(ETT)和吸入用于无菌导尿管插入0.5厘米低于埃特导管的尖端慢慢撤回。抽吸导管是保留分泌物的清除吸气额外1毫升无菌生理盐水。标本立即旋转250°C g×20分钟。上层清液被除去,剩下的小球resuspended 0.2 mlnormal盐水和储存在−70°C。
DNA提取、PCR和测序
从每个示例使用DNA制备试剂盒EZ1先进的平台。200µl临床样本中提取使用细菌卡按照制造商的说明和组织工具。每个样品的细菌负荷估计使用TaqMan定量PCR (qPCR)化验所描述的还[16]。在一式三份每个DNA样本化验,化验与变异系数(标准偏差/意味着)大于20%是重复。我们在可比的再现性验证试验呼吸道样本儿童患有囊性纤维化[17]。拷贝数使用标准曲线建立了由连续稀释10倍包含一个克隆的核糖体rna基因的质粒DNA。
使用条形码进行DNA测序引物(f - 338 r) 27日与先前报道的罗氏454 pyrosequenceras兼容[18]。每个DNA放大一式三份PCR检测,这是前池评估产品通过琼脂糖凝胶电泳。消极的控制每个条形码并行运行。任何消极的控制是积极的重复化验。正确的长度的扩增子的96 -格式标准化。扩增子浓度是规范化使用SequalPrep正常化板混合之前(表达载体)[19]。等于卷涨跌互现,集中通过蒸发和凝胶纯化使用蒙太奇凝胶净化设备(微孔)。由此产生的扩增子池使用罗氏按照制造商的说明测序基因组定序器FLX系统比较基因组学测序财团的设施在科罗拉多大学丹佛。
序列分析
序列数据(fasta和质量文件)被分配给样本条形码和低水平筛查质量缺陷(短序列< 150元长,> 1序列模糊,最好的阅读质量≥20在10元移动窗口)的软件程序BARTAB[20]。Non-bacterial序列被要求从数据集中删除与细菌核糖体rna二级结构密切匹配模型在地狱[21]。序列确定为潜在ChimeraSlayer嵌合体[22]也从数据集中删除。分类任务是由核糖体数据库项目分类器软件[23]。我们使用爆炸数据库包含细菌隔离席尔瓦ARB数据库(104年版)中标识分配物种的名字[24]。分类信息是用于构造序列组相同的分类等级,是用来计算生态为每个样本统计数据。香农多样性和超1计算,使用稀疏(100复制)来弥补每个样品的序列数的差异,使用biodiv功能包含在XplorSeq工具包[25],[26]。
结果
49岁的受试者参加更大的观察队列分析的时候,10位病人遇到了通风和抽样标准纳入本研究。列出10个病人的临床特点表1。病人从耐甲氧西林1死在40天的生活金黄色葡萄球菌脓毒症;这个病人没有进行尸检。其余患者都患有桶,从轻微到严重。所有患者接受广谱抗生素、经验或证实感染,在生命的前21天(图1)。
细菌组成每个样本在酒吧图表显示百分之一的总样本序列。每个物种可以识别颜色根据传说。天的抗生素管理都显示在每个图的顶端与实线depictingthe特定抗生素使用时间如上所述在右边的图。临床上获得文化的结果显示在每一个图的中间部分有一个“x”描绘他们获得的那一天。所有文化都来自气管吸入物,除非另有注明。(NG:没有增长,MURF:混合上呼吸道菌群,大肠泄殖腔:肠杆菌属泄殖腔,k .肺炎:克雷伯氏菌肺炎、MSSA:甲氧西林敏感葡萄球菌的球菌、铜绿假单胞菌:假单胞菌绿脓杆菌。
DNA从每个样本的平均产量32.9 ng /µl(范围:0.4 - -143.6)。共有107487个序列进行了分析,平均数量3359(范围:1724 - 4915)/样品。只有4的10个样本收集< 72小时的生活可检测细菌信号qPCR评估细菌负荷。进一步,这些样品中只有2包含足够的负载成功细菌社区的序列分析。所有样本收集从天7-21生活包含检测细菌负荷(> 70册/反应),并且每个样本细菌鉴定成功放大。细菌的分布载荷通过为每个主题所示的集合图2一个。七十二生物被观察到。生物识别每个样本的平均数量是7(范围2-23)。序列观察≥1.0%的总样本代表19生物体(序列总数的96.5%;1 - 9生物/样本)。曹国伟1非参数估计的实际样品中物种丰富度,预测平均8生物在每个样本(范围1-46)。生物多样性的样本,由香农指数,显示白天的集合中每一个主题图2 b。
一个。总细菌的分布载荷的样本。线连接每个病人的样本标记为与患者数量相应的临床资料表1。B。多样性的生物样本由香农指数。线连接每个病人的样本标记为与患者数量相应的临床资料表1。
占主导地位的生物体,定义为一个有机体代表>总额的50%的32个样本序列被确定像序列生物(7)表示。主要生物代表>序列在13个样本总数的90%(6生物)。细菌基因序列的分布为每个病人显示在样本图1随着临床的结果获得文化和抗生素的时间管理。Ureaplasmaparvum是两个积极的主要生物样本< 72小时,其中一个来自一个主题暴露于绒毛膜羊膜炎(课题4)。Ureaplasmaparvum或Ureaplasmaurealyticum代表9样本6的主要生物学科,5个样本的科目没有证据Ureaplasma在最初的样本。葡萄球菌物种代表19的主要生物样品(17凝固酶阴性葡萄球菌)。其中,葡萄球菌> 90%的序列并不代表样本。金黄色葡萄球菌是2的优势种(21)天收集样品。Pseudomonasaeruginosa(1样本;天14),粪肠球菌(1样本;天21),大肠杆菌(1样本;天21)中标识的其他主要生物样本。
基于怀疑医生管理这些病人肺部感染的研究过程中,19个额外气管吸入样本获得至少72小时内细菌培养的研究气管吸入集合(图1)。其中,14(74%)有积极的细菌生长,与特定的生物识别出11个样品和“混合上呼吸道菌群(MURF)”发表在剩下的3个样品。测序鉴定临床表示所有细菌增长文化(n = 11积极的文化)。六的11个文化增长2生物,然而,文化并不总是代表发现的细菌最多的生物序列通过分子识别方法(n = 5文化)。Non-cultivatable细菌,如Ureaplasma分子之间的差异的一个重要来源,战略文化的方法与标准。
潜在的病原体被不被文化包括测序Ureaplasma(3)文化,假单胞菌(1)文化大肠杆菌(1)文化。5的样品均获得临床迹象显示,没有细菌生长,研究样本配对透露葡萄球菌物种的主要生物3个样品,Ureaplasma占支配地位的生物物种在一个样本,在剩下的样品没有细菌放大。全身性抗生素是管理一段时间在第一次21天的病人。抗生素管理的平均持续时间是12天(范围、2-21)。时间在2个或更多的抗生素中值为10天(范围,三分之一)。所有样本收集后72小时的生活Ureaplasma物种作为主要有机体(n = 7)曾接受过2个或更多的抗生素研究样本之间的时间间隔。
讨论
我们进行了分子鉴定细菌的串行气管插管早产儿的吸入样本通过隔离rRNA基因收获PCR确定细菌群落的组成和收购的时机在这些婴儿的航空公司。我们发现在出生后的第一个72小时,大部分的气管吸入样品细菌负荷水平低或者检测不出来。然而,7天内的生活,持续与不同物种存在于细菌殖民化插管早产儿的航空公司。96.9%的细菌检测样品表现出一种占主导地位的生物,葡萄球菌和Ureaplasma物种最频繁的占主导地位的生物。所有物种分子方法确定检测到临床传统文化,但也发现潜在的病原体,包括Ureaplasma,没有检测到标准的细菌培养方法。因此,提高解决细菌检测关于总体细菌负荷,物种多样性在微生物或特定生物的鉴定指导药物治疗有可能产生进一步洞察桶的发病机制和早产新生儿呼吸末的结果。
这些研究结果非常重要,因为早期呼吸道感染和炎症损害肺泡发展已被证明[27],为桶的发展作出贡献[28]。炎症损伤破坏肺增长促炎细胞因子的产生[29]。虽然促炎细胞因子与桶的发展和不良结果相关[30],[31],[32],变量的评估促炎症反应,特异性和缺乏上下文(围产期的所有方面的识别环境导致疾病)阻止了细胞因子作为桶足够的生物标记物的使用。在产前和产后感染、氧过多和机械通气引起太多的关注引发炎症刺激,可能造成的影响气道殖民桶还不太清楚的发展并产生了矛盾的结果[33]。的存在Ureaplasma在早产儿呼吸道,即使没有感染的迹象,已经与桶的促炎症反应和风险增加[34]。虽然早期试验的红霉素治疗的治疗Ureaplasma在早产儿中未能显示受益[35],[36],[37],[38]最近阿奇霉素治疗试验显示,显著减少桶的端点或死亡小组的患者被发现是殖民或感染Ureaplasma[39]。因此,Ureaplasma桶仍是合理的,但仍未经证实的贡献者。Ureaplasma在至少一个占主导地位的生物样本6的10个婴儿在我们的研究中。Ureaplasma晚被发现的主要生物样品即使不是在最初的样品中检测到,建议产后收购的可能性和/或环境因素的存在,比如抗生素管理,鼓励这个属的选择。抗生素管理之间的关系Ureaplasma殖民,桶的风险应该在将来的研究中进一步探讨。暴露在殖民细菌可能会影响早产婴儿的肺免疫反应和后续发展。演示的改进解决细菌检测技术结合评估炎症可以改善我们的理解发展中宿主免疫反应的早产儿暴露于病原体及其关系。
低分子方法与传统的理论,人类航空公司被证明无菌肺部健康的微生物菌群的年龄较大的儿童和成年人丰富[9],[10]不充足,传统文化的方法调查的贡献对疾病的微生物群落。我们的研究结果与以前的报告[40]表明,微生物群落存在插管早产儿的早期的航空公司。快速积累的证据表明,微生物群落发挥重要作用在人类生理机能[41],[42]。一些疾病已经与这些微生物群落组成和多样性的变化[43],[44],[45]。一些显示微生物群的有限的多样性和相对缺乏的共生的有机体与炎症,增加有关屏障通透性,和疾病状态[46],[47]。呼吸道微生物群的早期评估肺囊性纤维化等疾病、哮喘和慢性阻塞性肺病[9],[10]也揭示微生物的变化与健康的病人相比,成分表明呼吸道微生物群的构成可以发挥直接作用在肺部疾病的病理生理学。新生儿口咽的殖民与链球菌引起的肺炎,莫拉克斯氏菌属复活,Haemophilusinfluenzae这些生物的组合,但不是殖民Staphylococcusaureus童年,明显与持续喘息[8]。孩子生活在农场暴露于更广泛的微生物比孩子生活在城市环境中,和这些孩子出现相对免受哮喘和特异反应性[48]。这些研究表明呼吸道微生物群在生命早期还可以调节宿主免疫反应和未来的肺部疾病。
只有2出生后72小时内收集的10个样本表现出足够的细菌负荷序列分析,表明降低早产儿的航空公司通常有相对较低的细菌负荷。这两个样品是来自一个婴儿暴露在绒毛膜羊膜炎和显示Ureaplasmaparvum绒毛膜羊膜炎的一个已知的原因,占主导地位的有机体。虽然多样化的样本中检测到的细菌是这十个婴儿,生物的多样性远远小于检测样品中的呼吸道样本年龄较大的儿童和成年人[9],[10]。此外,细菌多样性与年龄无关的婴儿或桶严重性。
抗生素的使用管理治疗证实或潜在感染可能长期影响呼吸道微生物群落的组成。潜在的负面影响包括消除共生的细菌和选择其他致病菌,尤其是那些不容易被临床培养技术和促进慢性气道炎症。进一步的研究将需要调查抗生素的潜在作用呼吸道微生物群的构成和对肺癌早期发育的影响。
对我们的研究有几个局限性。首先,小样本大小在这个试点研究排除了严格的评估存在的特定的细菌,细菌负荷,或物种多样性桶的风险。所有的婴儿本研究包含在不到28周妊娠,需要机械通风至少21天,代表一个非常高的风险人口严重的桶。串行评价早产儿呼吸道微生物的不发展桶很重要,以确定呼吸道微生物的组成与桶的风险。由于早产婴儿不开发桶通常不需要长时间机械通气支持,无创性气道需要抽样的方法。第二,所有婴儿在这个研究与全身抗生素治疗,可能会影响微生物的进化组成、限制的能力确定气道出生后殖民的自然习得。气管内管的存在也影响微生物降低航空公司的访问。尽管我们试图比较文化的分子检测方法的临床结果,样品没有同时获得。因此,两个结果之间的差异不能单靠方法。此外,抽样的气管吸入物不能充分反映细菌暴露在肺泡级别。 Simultaneous sampling of the upper airway, lower airways and alveolar samples are required to provide a more complete assessment of bacterial colonization. Finally, future studies are needed to more directly link the presence of specific airway organisms, airway bacterial load, and diversity of the microbiota with altered innate immunity and inflammatory cytokines to better understand how early colonization impacts lung inflammation.
总之,早期与不同物种存在于细菌殖民化插管早产儿的航空公司,并且可以以细菌负荷和物种多样性。分子检测Ureaplasma物种在晚期早产儿的航空机械通气过程中概念,提供了进一步的支持Ureaplasma可能参与桶的发病机制,需要进一步调查。细菌的分子识别降低早产儿的航空公司有可能产生进一步了解桶的发病机制和确定新的治疗目标。
作者的贡献
构思和设计实验:PMM JKH MKS沙。进行了实验:PMM JKH CER。分析了数据:PMM JKH MKS沙。造成试剂/材料/分析工具:JKH CER MKS。该报写道:PMM MKS沙。
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