文摘
患有严重哮喘的儿童(箍)差控制尽管最大治疗,而那些困难的哮喘(DA)差从未能实现基本的管理控制,包括坚持治疗。尽管公认为临床上截然不同,气道分子表型,包括先天淋巴细胞的作用(ilc)和他们的反应在DA类固醇,箍是未知的。
Immunophenotyping唾液和血液ilc和t细胞的箍,DA和non-asthmatic控制进行。白细胞纵向分析了预处理和post-intramuscular儿童去炎松箍。培养ilc进行评估来评估类固醇响应能力在体外。
2型辅助气道嗜酸性粒细胞,Th2细胞和ILC2s箍患者明显高于DA和疾病控制,而IL-17+淋巴细胞相似。ILC2s和Th2细胞明显减少了在活的有机体内肌内去炎松和在体外类固醇。此外,哮喘发作症状和减少全身性类固醇后抗类固醇IL-17反应尽管持久性+细胞和嗜酸性粒细胞。
儿科与箍箍和DA具有不同的气道分子表型的特点是升高2型细胞。系统性皮质类固醇,但不是维护吸入类固醇导致控制和改善症状加重伴随减少功能ILC2s尽管IL-17持续升高+淋巴细胞。
文摘
患有严重哮喘的儿童有不同的2型气道ILC2s较高的分子表型,Th2细胞和嗜酸性粒细胞比困难的哮喘,而IL-17+细胞是相似的。ILC2s全身性类固醇而IL-17很敏感+细胞是不变。bit . ly / 2 jmtw1r
介绍
儿科哮喘严重(箍)的特点是持续的控制不佳,尽管最大剂量的治疗和最优评估修改的依从性等因素,接触过敏原和烟。箍影响∼2%的儿童患有哮喘,但会导致重大的发病率(1),利用哮喘(多达50%的医疗资源2,3]。困难儿童哮喘(DA)的特点是可怜的控制,尽管最大规定治疗,但具体临床评估显示修改的因素,通常缺乏坚持维持治疗,明显的贫困的原因控制(4,5]。我们已经表明,儿科DA和箍具有不同的临床表型(6]。相比箍,哮喘管理的基础知识解决时,患儿DA低呼出一氧化氮的水平,改善肺功能,能够减少日常剂量吸入型皮质类固醇激素,同时保持控制。此外,DA病人继续发作明显少于箍6年后(6]。这表明孩子与DA steroid-sensitive疾病,而箍患者疾病抵抗最大维护皮质类固醇。作为一个群体,以儿童肺功能下降,标志着嗜酸性气道炎症和气道重塑1]。然而,是知之甚少的分子表型哒,和DA和箍是否可以使用分子以及杰出的临床表型。如果这是可能的,它可以防止不适当的政府steroid-sensitive患儿疾病的生物制剂。
这是承认箍是一种异构的疾病(7)和潜在的免疫机制尚未完全清楚。尽管传统上被认为是过敏性哮喘2型辅助细胞(Th2)介导的疾病,新兴的证据,从成人和儿童的研究,表明non-Th2机制可能贡献,特别是严重疾病(8,9]。白介素(IL) -33是一个天生的上皮细胞因子升高在儿科箍与气道重塑和抗类固醇疾病[反应严重10,11]。众多实验小鼠模型强调的重要性IL-33过敏性气道疾病的起始通过2型先天淋巴细胞的诱导(ilc) [12- - - - - -14]。ilc是一种罕见的淋巴细胞谱系,发现主要在粘膜表面,镜子的功能亚型。2型ilc与变应性疾病(15)和增加痰和支气管肺泡灌洗(BAL)从成人16和患有严重哮喘的儿童17]。虽然在严重疾病预测的重要性,对于他们的角色在温和的疾病所知甚少,或者常见的哮喘治疗,如类固醇,影响其功能或表型。
Th17通路也被建议作为重要的中介大人,实2严重哮喘[18]。虽然IL-17从儿科箍诱导外周血单核细胞(PBMCs)之后在体外刺激与类固醇(19),不知道IL-17+ilc或在儿科箍IL-17功能的重要性。
因为肺IL-33仍高企,尽管最大类固醇疗法在儿科箍10),我们提出的下游效应细胞,2型ilc居高不下,尽管类固醇和调解的病理生理学箍,虽然他们在DA会降低。我们分析了气道的表型和比例(诱导痰)和外周血CD4+t细胞和儿童ilc箍相比DA和年龄疾病控制。探讨类固醇在真正的严重疾病的影响,淋巴细胞的比例比较前后诱导痰全身性类固醇,和培养PBMCs刺激过敏原和类固醇。
材料和方法
主题
岁儿童(6 - 16岁)进行临床表示调查(血液检测和诱导痰)箍,DA或下呼吸道感染复发。临床描述、处理诱导痰和PBMCs进行如前所述[17]。箍(n = 16)儿童确诊哮喘控制较差,尽管最大剂量吸入糖皮质激素(≥800天μg·−1布地奈德当量)和优化底层修改的因素,如坚持(2]。DA (n = 6)患者规定最大剂量维持治疗,但可怜的依从性的证据解释了可怜的控制(20.]。肺量测定法和支气管扩张剂可逆性,分数呼出一氧化氮,痰诱导和控制症状(哮喘控制测试)都是在箍和DA的孩子。Non-asthmatic疾病控制病人(n = 8)持续或复发性咳嗽不应对抗生素(n = 6),囊性纤维化(n = 1)或原发性纤毛运动障碍(n = 1);这些都是集体称为“慢性炎症”。
研究从当地的研究伦理委员会批准了,父母的书面知情同意和适龄孩子同意。
流式细胞术
细胞培养4 h和phorbol-12-myristate 13-acetate [21,ionomycin和brefeldin沾一个可以解决的可行性污点(僵尸紫外线;BioLegend,伦敦,英国)和ILC t细胞标记。所有ilc lineage-negative (CD3, CD14、CD16 CD19, CD20、CD56、CD4, FcεR1)、CD45+。2型ilc CRTH2+或CD127+和/或IL-13+或il - 4+。Th2细胞CD3+CD4+表达CRTH2 / IL-13 / il - 4。Th17细胞(CD4+IL-17+)和IL-17+ilc (lineage-negative IL-17+)。抗体是CD45(生活技术,佩斯利,英国),血统的鸡尾酒,CD127, CRTH2, CD3, CD4, CD8, IL-13, IL-17A, GATA-3 (BioLegend) FcεR1(英国Altringham eBioscience)。数据收购BD Fortessa(美国BD生物科学、SanJose CA)和分析使用Flowjo v10(美国Flowjo、亚什兰或)。
PBMC文化
PBMCs培养(20 ng·- 2毫升−1)(t细胞)或IL-7 ng (ilc)(20毫升−1µg·25毫升−1屋尘螨(HDM)提取(爱格里尔实验室、数控、美国)和/或布地奈德(10−7更易·L−1)。文化上层清液收集72 h后细胞因子分析。
ILC文化
ilc从全血浓缩(成人轻度哮喘患者和健康对照组)使用RosetteSepTM人类ILC2浓缩设备(干细胞技术,剑桥,英国),按使用CD45流式细胞术+血统负的CD5 (CD1a CD3, CD4, CD8, CD11c, CD14、CD16, CD19, CD20, CD34, FcεRI和CD123) (BioLegend) CD161+,CD127+,CRTH2+和c - kitvar。为了充分区分血统RosetteSep后正面和负面的细胞TM抗体鸡尾酒染色,扩大家族面板使用。ilc培养- 2,IL-7 ng(5毫升−1ng)和IL-33(10毫升−1)(eBioscience)。ILC文化刺激作为PBMC文化的描述。
定量聚合酶链反应
培养ilc与350细胞溶解μL RLT缓冲区(试剂盒,曼彻斯特,英国)。总RNA提取使用RNeasy微工具包(试剂盒)和转换为互补。实时pcr进行使用Taqman快速掌握先进混合Taqman底漆/探针集使用IL13和NR3C1计算和数据正常化GAPDH和β-actin相对表达式。
免疫组织化学
的Cytospins ILC2s沾anti-Glucocorticoid受体(D8H2) XP®兔子马伯,后跟一个生物素化的山羊anti-rabbit免疫球蛋白二级抗体。图像是一个反向激光扫描共焦显微镜(SP5;位于德国徕卡微系统公司)。
统计数据
样本大小是投机取巧,没有通知电力计算数据。非参数克鲁斯卡尔-沃利斯分析,其次是邓恩的修正为多个比较,被用来评估差异。Wilcoxon配对测试是用于成对数据。数据值。使用斯皮尔曼等级相关检验和相关性评估GraphPad棱镜v5(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。统计学意义是接受为p < 0.05。
结果
病人的特点
儿童的基线特征箍,DA和non-asthmatic控制所示表1。肌内管理去炎松在箍进行临床严重哮喘调查的一部分协议和评估是否适合附加疗法如omalizumab [4]。所有箍和DA病人已经使用了大剂量吸入类固醇,长期代理β-agonists和/或白三烯受体拮抗剂(表1)[2]。箍患者明显高于血清总IgE和痰液嗜酸性粒细胞DA和non-asthmatic控制。没有差别的年龄、体重、身高、用力呼气量在1 s (FEV1各处理间),或者用力肺活量(表1)。
气道嗜酸性粒细胞只有增加箍,当血液嗜酸性粒细胞高箍和DA控制
虽然血嗜酸性粒细胞升高被认为是严重哮喘的生物标志物在成人(22),他们的角色在儿科重症哮喘较不确定23]。我们比较嗜酸性粒细胞数量在血液及唾液箍,DA和non-asthmatic控制。血嗜酸性粒细胞也升高箍和DA控制相比,明显高于痰嗜酸性粒细胞只有在箍,并几乎检测不到DA和控制(图1一个)。之间没有相关性痰液和血液中嗜酸性粒细胞箍的孩子或DA (补充图S1)。痰中性粒细胞高在non-asthmatic控制复发性感染(图1 b),而淋巴细胞和巨噬细胞升高箍和DA (图1 cd)。血液中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞相似的所有三组(图1 bc和d)。
增加功能2型ilc气道和t细胞在儿科箍
我们以前确定2型ilc和t细胞在矿山和箍患者痰液的基础上表达的细胞外CRTH2标志+(17]。然而,为了获得更大的表型和功能定义,我们检查了所有林负的CD45+ilc IL-13的表达,il - 4和IL-17,可能驱动的疾病表型的细胞因子(补充图2)。箍患者明显高于痰ilc的频率(林负的CD45+比DA)和CD4 t细胞表达CRTH2 non-asthmatic控件(图2一个)。此外,更高频率的痰ilc和箍患者CD4 t细胞表达il - 4 (图2 b)和IL-13 (图2 c)相比,DA和non-asthmatic控制。然而,三组之间没有区别痰ilc的频率或CD4 t细胞表达IL-17 (图2 d)。值得注意的是,non-asthmatic控制与慢性炎症痰中性粒细胞升高(图1 bIL-17),但没有增加+ilc或CD4 t细胞(图2 d)。ilc和t细胞的数量增加生产能力2型细胞因子定义了箍的患者。因此,我们测量了水平的2型细胞因子在病人的痰。IL-13水平升高在箍患者相比,控制和IL-5显著增加在这些病人的数量(补充图3)。外周血ilc和CD4 t细胞表达CRTH2 IL-13或IL-17箍和DA(没有差异补充图4得了)。
气道IL-13的表型特征+ilc的箍,DA和控制
众多定义用于ilc、基于细胞外表达CRTH2或IL-7Rα(IL-13 (CD127)或胞内细胞因子表达+,il - 4+,IL-17+)。我们检查了细胞外标记和细胞内细胞因子表达,进一步定义气道ilc的表型在DA和箍。此外,为了确定是否只有CD127+ilc类固醇耐药严重哮喘患者,在最近出版的(24林),我们调查−CD45+细胞表达CD127 CRTH2或者IL-13。痰林负的CD45+IL-13+细胞表达2型标记CRTH2箍的明显高于DA (图3一),而林负的CD45+IL-13+细胞表达的一般ILC标记CD127在两组相似(图3 b)。林的痰负的CD45+IL-13+细胞箍,都CD127只有16%+和CRTH2+林,绝大多数(65%)的痰负的使用IL13+细胞不表达CD127,只有33%表示CRTH2 (图3 c)。因此,我们评估了林的频率负的CD45+IL-13+这是CRTH2+CD127+和CRTH2−CD127−相比,箍DA和控制。细胞表达CD127和CRTH2或两个标记在箍相比增加控件(图3 d林,e),这表明负的CD45+IL-13+细胞可能在驾驶箍功能重要。有趣的是,在类似的方式,大多数痰林负的CD45+IL-17+细胞(79%)没有表达CD127。没有林负的CD45+IL-17+细胞表达type2 CRTH2标志+(补充图5)。
气道2型淋巴细胞减少箍在系统性皮质类固醇
评估临床和免疫反应系统性类固醇箍,患儿痰诱导前进行肌内去炎松管理和4周后,作为我们的临床协议(25)(图4一)。简单,孩子们以评估肺量测定法,呼出一氧化氮和症状评分上午再次接受去炎松和4周后(图4一)。肺功能(FEV没有变化1%预测)去炎松后12个月(图4 b),但有一个显著减少呼出一氧化氮分数(图4 c)和症状的改善评估使用哮喘控制测试4周后(图4 d),减少哮喘发作(定义为短期课程规定的口服糖皮质激素去炎松后的一年,与前一年相比)(图4 e),之后政府曲安奈德。痰液嗜酸性粒细胞的频率(图4 f)和水平的痰液嗜伊红的过氧化物酶(嗜酸性粒细胞激活的标志)持平后去炎松(图4 g)。详细的表型出现痰淋巴细胞群显示林负的CD45+和CD4+t细胞表达要么CRTH2+或使用IL13+减少,这表明这两种细胞类型类固醇敏感的航空公司在活的有机体内(图5一个- d)。此外,量化2型介质在痰浮层显示减少IL-13和IL-5去炎松后,即使嗜酸性粒细胞数量保持升高(图5 e)。
功能使用IL-13定义外周血2型淋巴细胞+类固醇敏感在体外
来测试假设ilc不仅回复柔和的炎性环境产生的类固醇抑制在活的有机体内,但自己类固醇敏感,我们培养PBMCs九道箍病人敏感HDM隔绝。细胞被刺激与HDM提取有或没有布地奈德然后ILC t细胞亚群进行分析。刺激与林HDM导致显著增加负的CD45+IL-13+ilc和CD4+使用IL13+t细胞,在PBMC培养HDM-sensitised箍儿童(图6,b)。然而,有一个显著减少IL-13的数量+ilc和使用IL13+当PBMCs t细胞培养与HDM和布地奈德(图6,b)。此外,PBMC的HDM刺激后分泌IL-13水平文化是减少了布地奈德(图6 c)。
IL-13+先天淋巴细胞直接回应类固醇
为了确定一个纯粹的ilc人口(CD45+,林负的,CD161+,CD127+,CRTH2+和c - kitvar,IL-13+)直接回应类固醇治疗,外周血细胞分类和培养重组- 2,IL-7和IL-33斜向2型表型(24),≥4周ILC2s (> 99%)。ilc排序从成年人由于道德的限制阻止大量的血液被获得的孩子隔离这种罕见的细胞群。孵化的在体外培养细胞与布地奈德导致减少的数量ilc表达IL-13一起减少IL-13文化上层清液蛋白质含量(图8,b)。ilc,不是抗原特异性,但可能对一个复杂的HDM组件如脂质和蛋白质,没有直接回应HDM刺激(图8,b)。此外,在布地奈德的存在,IL-13迅速表达下调基因表达(图8 c)。此外,我们寻找的糖皮质激素受体表达和显示组成型表达的NR3C1,ilc的表达水平增加的布地奈德(图8 d)。糖皮质激素受体的表达纯化ilc证实了免疫荧光的蛋白质水平(图8 f)。这些数据表明明确的存在足够的剂量的类固醇,林功能负的CD45+IL-13+类固醇敏感。
讨论
尽管儿科箍被公认为抗类固醇气道嗜酸性粒细胞(反应的特点是严重的特异反应性和1,25),淋巴细胞群驾驶疾病仍知之甚少。我们展示了ilc的数量增加,表达2型标记CRTH2和IL-13航空公司从箍在稳定的疾病相比,孩子用DA和疾病控制的病人。2型ilc气道,t细胞和嗜酸性粒细胞升高箍尽管之前评估以确保最佳坚持维护大剂量吸入类固醇治疗。相比之下,淋巴数量和嗜酸性粒细胞升高在航空公司DA的孩子,表明这些是临床和分子不同的表型,DA的特点是更多steroid-sensitive疾病。与我们的假设相反,我们发现,尽管气道CRTH2+IL-13+ilc增加箍在基线,他们减少了高剂量全身性类固醇在活的有机体内和类固醇刺激在体外。值得注意的是,所有的孩子都在维护口服类固醇。相比之下,IL-17+ilc类似在箍,DA和控制,抗类固醇在体外。有一个2型淋巴细胞数量的减少气道后高剂量全身性类固醇和改善症状和哮喘发作,但在箍的嗜酸性粒细胞数量没有变化。然而,全身性类固醇并不是一个可行的长期治疗选择和替代steroid-sparing疗法抑制2型淋巴细胞是必要的。
我们承认孩子的数量质量好的样本表型痰淋巴细胞可以获得很小。我们没有选择一个小组来说,数据显示在任何数据。数字的原因在某些变量的数据较低是因为痰细胞数量和有限的痰样本配对之前和之后去炎松,这是一个不可避免的弱点这类研究。我们没有选择具体的孩子包括在结果中。然而,我们所做的临床表型,孩子们非常小心,确保遵循的客观评价是进行定义箍和DA之前,和研究结果显示明显区别组织尽管小数字。
我们之前报道的重要性区分儿童哒,那些可怜的控制,因为潜在的修改的因素,如依从性差,从与箍,那些留在贫穷控制尽管最佳依从性(4,5]。我们演示了临床区分箍和DA,箍的特点是持续肺功能差,频繁袭击和严重和多个异位的敏化作用[6]。然而,DA的分子表型和箍是未知的。我们现在证明真正的严重哮喘患儿(箍)气道嗜酸性粒细胞升高,IL-13+与DA ilc和t细胞相比,孩子,重要的是这些区别只在痰液明显,外周血。我们的数据的重要性凸显了投资的时间和资源来准确临床表型与哮喘控制不佳的孩子尽管最大规定治疗为了区分箍哒。如果不这么做,增加目标生物制剂和小分子疗法可用(26),有可能孩子会给这些小说药物不当。
尽管气道ilc增加箍,他们的角色在促进疾病严重程度,尤其是人类,仍不清楚。由于IL-33增加箍,抗类固醇细胞因子(反应是一个相对10]和诱发ilc [12),我们进行了详细的表型出现气道ilc及其应对类固醇。我们已经表明,尽管细胞外标记CRTH2是用来表示2型淋巴细胞,CD127是用来表示ilc,气道IL-13的多数(∼65%)+林负的CD45+细胞CD127−和大约一半是CRTH2−。然而,大多数的人类研究迄今为止报道的患病率和回应的气道ilc类固醇在过敏性疾病包括细胞外标记定义的一部分(27]。这表明大部分中淋巴细胞的起源和血统是负面的,但有能力2型细胞因子分泌,因此在功能上相当于一个ILC2,被忽视。我们这里显示,证实了我们之前的发现(17),在患有严重哮喘的儿童的航空公司,很大一部分的林−CD45+目前细胞不表达细胞外标记用于定义ILC2s。有必要考虑ilc的可塑性和当地环境的影响函数(28]。限制定义包括细胞外标记CD127和/或因此CRTH2可能不适合描述ILC2功能,特别是在儿童组织。
我们报告,ilc(林负的CD45+CRTH2+和林负的CD45+IL-13+)对类固醇敏感在活的有机体内和在体外。这些结果反映了类固醇Th2细胞的反应。数据与研究协议与慢性鼻窦炎鼻息肉的成年人已经表明ILC2s类固醇敏感(29日]。然而,这是第一个示范在类固醇后气道ilc患者和严重的哮喘。之前就有报道称,ILC2s BAL流体从成人哮喘患者对地塞米松(24]。然而,这是证明了在体外刺激气道ilc使用类固醇,在临床实践中并不经常用于治疗哮喘。我们最大化的信息从我们的常规临床协议包括一个儿童全身性类固醇的剂量以[25,表明痰IL-13+ilc和CRTH2+ilc显著降低,与CD4串联+2型淋巴细胞后曲安奈德。为了证实类固醇的影响2型ilc,消除其他白细胞的影响,我们展示了文化的2型ilc外周血糖皮质激素受体表达与布地奈德也减少刺激体外。它是合理的,尽管ILC2s类固醇敏感,目前交付吸入类固醇药物并不在最佳浓度达到航空,让这些细胞的数量减少,从而解释高架数字箍在稳定的疾病。减少急性加重,加上改善症状评分和相关的2型淋巴细胞减少去炎松后,表明这些细胞可能在驾驶中发挥作用的症状在儿童箍尽管大剂量吸入类固醇治疗。
虽然我们最近没有增加气道Th17细胞儿科箍(30.),我们先前没有调查过IL-17的潜在作用+ilc。同意我们的发现Th17细胞气道IL-17+ilc并不增加箍相比DA或疾病控制。此外,与2型淋巴细胞,IL-17+ilc和Th17细胞抗类固醇在活的有机体内和在体外。此外,我们已经证明了一个重要IL-17的感应+ilc用布地奈德在体外。Th17 / IL-17轴与严重,steroid-resistant成人哮喘(31日];然而,IL-17的数量+细胞在我们箍患者没有任何相关临床参数。这是我们以前的报告符合IL-17之间缺乏相关性水平,Th17细胞和临床特征在儿科箍30.]。即使疾病控制复发感染患儿气道嗜中性,他们没有IL-17增加+淋巴细胞。这可能是因为大多数儿童淋巴细胞与中性气道疾病气道壁,不内腔32,33]。
我们接受的儿童数量的队列研究去炎松前后小;这是因为并不是所有能够产生足够的痰样本在两个时间点,因为这是一个技术上困难的过程在年幼的儿童。然而,尽管小数字,数据展示清楚type2淋巴细胞的变化,也没有先前的研究已经表明纵向罕见的儿童呼吸道样本中细胞数量的变化。重要的是,所有的孩子都是临床稳定的痰感应的时候,≥2周以来任何先前的恶化。缺乏肺功能的变化和相对高值FEV的基线1可能解释为“稳定”的病人,但是是一个一致的临床发现患有严重哮喘的儿童(34]。这将是有趣的评估任何改变比例的ilc在恶化。小鼠数据表明ILC3s很重要在加重肥胖过敏性气道疾病(35)和ILC2s有助于influenza-induced集(36]。然而,在病毒引起的急性加重他们的角色在人类尚不确定。
显著优势的包容是我们的数据仔细箍患者临床特征和DA和效用的非侵入性呼吸道痰液细胞表明类固醇治疗后免疫细胞的变化在活的有机体内和在体外。我们接受我们的研究有一定的局限性。我们包括复发患儿下呼吸道感染,即。降低慢性气道炎症最好的务实的对照组。理想情况下,应该招募健康对照组;然而,获得健康儿童的呼吸道样本在伦理上是不可能的。值得注意的是,先前的成人研究也包括类似的疾病控制(24,37]。此外,尽管更多的疾病控制在痰中性粒细胞,这并不影响IL-17的数量+淋巴细胞,尽管IL-17与嗜中性(有关38,39]。
总之,我们已经表明气道林的贡献负的CD45+CRTH2+和林负的CD45+IL-13+ilc箍DA相比,儿童和类固醇的影响这些细胞在儿科箍。减少2型ilc和全身性类固醇后t细胞与减少急性加重和改善相关症状。然而,在气道嗜酸性粒细胞的数量没有变化。我们还表明,IL-17+ilc Th17细胞相比,箍不增加DA在基线和细胞持续尽管类固醇。尽管临床改善IL-17升高+细胞问题他们的角色在调停儿科箍的病理生理学。
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确认
作者感谢简斯利瓦斯塔瓦和杰西卡·罗利,帝国理工学院的核心流式细胞术设施(英国伦敦),帮助细胞排序。我们还要感谢罗伯特·奥利弗和海伦Stoelting(英国伦敦帝国理工学院、伦敦)他们的帮助在数据生成定量PCR和露西罗布森(伦敦帝国理工学院)培养的ILC文化。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:本研究支持由英国威康信托基金会(107059 / Z / 15 / Z)和英国哮喘(雀- ig - 2014 - 269)。蔡玫劳埃德Wellcome高级研究员,a .布什NIHR高级调查员和s Saglani是NIHR职业发展的(cdf - 2014 - 07 - 019)。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
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- 收到了2018年9月26日。
- 接受2019年5月26日。
- 版权©2019人队
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