摘要
对特发性肺纤维化发病机制的研究受到一系列动物模型的阻碍,这些动物模型不能概括人类疾病的所有特征。更好地使用和理解动物模型所代表的可能提高临床可预测性。我们询问了离体在博莱霉素诱导的肺纤维化(BILF)小鼠模型中,微计算机断层扫描(CT)作为一种新的终点测量方法,并评估用于临床前药物评估的治疗剂量方案。
使用标准终点测量(肺羟脯氨酸和组织学)对BILF的详细特征进行了测量。高分辨率微ct(约13.7 μm体素大小)用于量化肺纤维化的程度和严重程度。
博莱霉素灌注后14 - 28天为纤维化进展期。在此期间,使用转化生长因子-β受体-1激酶抑制剂验证了治疗给药方案,micro-CT提供了高度敏感和定量的纤维化测量。此外,在一次使用博莱霉素后,纤维化病变并没有完全消除,而是持续≥6个月。
离体BILF的micro-CT分析允许在纤维化已经确定后对治疗剂量进行稳健评估,与传统生化终点相比,需要的小鼠更少。
摘要
Micro-CT提高了对博莱霉素纤维化肺疾病模型的认识,用于临床前药物评价http://ow.ly/p73De
介绍
特发性肺纤维化(IPF)是一种慢性、进行性和最终致命的疾病,其特征是细胞外基质过度沉积和肺结构破坏。在美国和欧洲,目前有50万IPF患者[1.],世卫组织给医疗系统带来了巨大的临床和经济负担。疾病进展通常对当前的药物干预难以控制,导致诊断后中位生存期为3-5年[2.]因此,识别新的治疗干预措施对于补充已经显示出临床益处迹象的极其有限的药物储备至关重要。
实验性肺纤维化模型通常用于确定相关的潜在病理机制和评估药物疗效。然而,IPF研究受到动物模型的阻碍,这些动物模型不能再现人类疾病的所有特征,其预测未来临床结果的能力也受到质疑。从这些实验模型中显示出抗纤维化潜力的过多途径/靶点来看,很少有人在临床试验中显示出益处(参见[3.)。有几种不同的模式[4.],其中应用博来霉素诱导的肺纤维化可能是最好的特征和最广泛使用的,尽管该模型没有公认的标准化版本[5.]。多种因素将影响纤维化反应的性质,包括给药途径、博莱霉素制剂、剂量、小鼠菌株、年龄等。预防性给药计划和非条件遗传缺陷小鼠研究通常报告有益效果,但可能不是通过直接抗纤维化反应而是通过抑制博莱霉素的早期炎症反应。很少采用更具治疗针对性的给药方案(例如. 吡非尼酮[6., bibf1000 [7.],伊马替尼[8.]和泼尼松龙[9),但这些方法可以更好地预测临床结果。
鉴于传统纤维化终点的有限信号窗,如高效液相色谱法(HPLC)测定肺羟脯氨酸,我们对小鼠肺进行了微计算机断层扫描(micro-CT)分析离体并建立了口咽博莱霉素给药后纤维化变化的定量终点测量。此外,确定了应用治疗剂量方案阻止纤维化进展的合适窗口,并使用转化生长因子-β受体小分子抑制剂成功地进行了基准测试(TGF-βR)-1/激活素受体样激酶(ALK)5阻断主要促纤维化细胞因子TGF-β下游的信号通路。利用micro-CT,我们还确定纤维化病变并未完全消退,而是在博莱霉素单一损伤后持续数月。
材料和方法
在线补充材料中提供了详细的方法。
博莱霉素肺损伤动物模型
所有动物研究都按照1986年动物(科学程序)法案和葛兰素史克(GSK)动物护理、福利和治疗政策进行伦理审查和实施。博来霉素(50 IU·鼠标−1.如前所述,在50μL无菌0.9%生理盐水(Bleo kyowa;kyowa Hakko Ltd,Slough,UK)或生理盐水中通过口咽滴注给雄性C57Bl/6小鼠(Charles River Laboratories,Margate,UK)[10]。实验组的概述见表1.
对于实时逆转录酶(RT)-PCR和总肺胶原测量,肺在液氮中快速冷冻并称重。对于显微CT、组织学和免疫组织化学分析,如前所述,对肺进行吹气和固定[10],尽管micro-CT成像有其他固定方法,例如. [11].
使用SB525334A进行ALK5抑制研究
高选择性小分子ALK5抑制剂SB525334A [12]是葛兰素史提夫纳格公司(英国)赠送的礼物。博莱霉素后14天,SB525334A(30 mg·kg−1.在100μL酸化盐水/0.2%吐温80 pH4.1)或载体(酸化盐水/0.2%吐温80 pH4.1)中,通过口服灌胃每日两次,直至博莱霉素后28天(见表1实验小组)。
肺总胶原的测定
如前所述,通过测量小份粉碎肺中的羟脯氨酸含量来测定肺总胶原[10].羟脯氨酸通过7-氯-4-硝基苯并氧-1,3-二唑衍生酸水解物的反相HPLC进行定量。假设胶原含有12.2%(w/w)羟脯氨酸,并以mg·lung表示,计算总肺胶原−1..
根据制造商的说明,使用Sircol分析法(英国卡里克弗格斯Biocolor有限公司)测量总肺胶原,并表示为mg·lung−1..
显微CT扫描
固定的、吹入的肺分别在70%、80%和90%乙醇中培养2小时,然后在100%乙醇中过夜。随后,在空气干燥之前,将肺转移至100%六甲基二硅氮烷中再持续2小时。然后对肺部进行包裹,进行微CT扫描。体素大小为1–2μm是可行的[11],但与每个样本数小时的长扫描/重建时间相关。我们选择了13.7μm的体素大小和∼10分钟,允许高分辨率可视化和纤维化分析,具有良好的吞吐量。在SkyScan 1072 micro CT扫描仪(比利时Kontich Bruker MicroCT)中以40 kV·100μa扫描肺部−1.,无滤波器,使用两帧平均和0.9°角旋转步长;根据SkyScan 1072中典型测量的10%调制传递函数,空间分辨率为20–30μm。使用SkyScan NRecon软件(Bruker MicroCT)进行重建。
微ct图像分析
使用InForm软件(英国剑桥Perkinlemer)进行组织分割分析。简而言之,该软件经过“培训”,使用两个具有代表性的微型CT切片(8位灰度)识别纤维化或正常肺、大气道、血管和包装材料从研究中的每只动物身上。然后以精细分辨率在中等样本区域进行分割,以测量每个显微CT切片的纤维化和正常肺组织的组织体积和灰度密度。每个肺的数据(∼然后将900个切片汇编成每个全肺纤维化(体积纤维化×灰度密度)的综合测量值。
体素密度分析
每个肺(不包括大气道)生成了复合256色灰度直方图(从0=黑色到255=白色),代表像素密度的频率分布。然后为每组计算每个箱子(1灰度单位宽)的平均像素数,并用t检验分布显示每个灰度箱下每组动物之间比较的p值。由于处理和脱水需要,灰阶密度没有转换为亨斯菲尔德单位离体分析。
组织学分析
对于标准组织学处理(苏木精和伊红染色或胶原的Martius猩红色蓝染色),切割2μm石蜡切片并将其安装在聚赖氨酸涂层的玻片上,并进行相应处理。随后在纳米放大镜上扫描所有切片,并使用NDP.view v.1.2.36拍摄图像(均来自日本滨松县滨松公司)。在同一组肺上进行显微CT和组织学的直接比较;CT后,在正常组织学处理之前,通过乙醇梯度(100、90、80和70%;各2小时)对肺进行再水化。
实时RT-PCR
如前所述进行实时定量(q)PCR[10],但归一化使用了两个管家基因的交叉点(Cp)值的几何平均值:ATP合酶5B和β2-微球蛋白,这两个基因被GeNorm分析鉴定为本研究中最稳定的管家基因。对ΔCp值进行统计。所有引物和GeNorm试剂盒均购自Primer Design (Southampton, UK)。
统计分析
使用SigmaPlot 12.3软件(英国伦敦Systat软件公司)进行统计分析。两组之间的差异通过双尾t检验进行评估。多组比较根据情况使用单因素或双因素方差分析进行评估,使用Holm–Sidak事后Pearson相关性用于确定相关数据的统计显著性。p值<0.05被认为是显著的。
结果
博莱霉素滴注后进行性纤维化阶段的描述
我们的博莱霉素诱导的肺纤维化(BILF)标准模型在炎症期和纤维化期分别有7天和14天的典型终点(与∼我们选择在博莱霉素后3天到28天的延长时间内评估肺参数的变化。在单独的实验中,我们还评估了损伤后3个月和6个月的小鼠。
博莱霉素治疗后,肺总重量迅速增加,在第14天达到峰值(图1a).博莱霉素治疗后3个月,肺重量仍显著高于对照组(平均±扫描电镜博莱霉素的制备对盐水194±3.4毫克对145±3.9 mg,n=8;p<0.05)。羟脯氨酸含量的HPLC测定表明,从第10天起,总肺胶原显著高于基线水平(图1b),第14天时胶原增加65%,第28天时总肺胶原增加91%。相比之下,常用的Sircol分析给出了明显不同的肺胶原变化曲线和幅度(在线补充图S1c),仅占第28天HPLC测定的肺胶原的9%;在HPLC和Sircol肺胶原测量值之间未观察到相关性。在线补充图S2中描述了具有代表性的组织切片。
因此,从第14天到第28天的时间段代表了已建立纤维化的进展,并被选为该模型治疗干预的最佳时机窗口。有趣的是,博莱霉素治疗后3个月,肺总胶原显著升高,程度相同(即∼与基线检查时相比增加92%),如第28天所见,表明单次博莱霉素滴注后12周内未能逆转肺胶原沉积的增加。
博莱霉素时间效应的离体micro-CT分析
我们试图确定micro-CT是否能为整个肺的纤维化变化提供更敏感和可靠的终点测量离体,与羟脯氨酸的HPLC分析或组织学分析进行比较。博莱霉素治疗后第14天至第28天的代表性中肺横向显微CT切片和3D容积图如所示图2X线致密性纤维化病变明显,由于博来霉素的分布途径,其分布在心尖部和背中心部(图2b和在线补充视频1-4)。支气管血管束周围纤维化明显,并向周围扩展;牵引性支气管扩张、致密实变、小叶间隔增厚和胸膜下瘢痕也很容易辨认。
在纤维化进展期的ALK5抑制
作为量化的概念证明纤维化程度明显一个恰当的治疗后ct机,高度有效的和选择性小分子抑制剂TGF -βr 1 (ALK5) SB525334A,是每天两次口服填喂法从14天,一旦纤维化已经完善,直到28天。
博莱霉素损伤导致第28天肺重量增加,但溶媒组和ALK5抑制剂组之间无显著差异(图3)然而,治疗性ALK5抑制显著减弱了第28天的BILF,肺羟脯氨酸的HPLC测定证明了这一点(图3 b).SB525334A显著降低(约55%),但没有完全逆转肺胶原沉积的增加。
Micro-CT检测到广泛的纤维化改变,完全符合等效的组织切片(图3e和f).我们使用InForm软件的模式识别方法将组织分割为正常实质和纤维化病变(不包括外筋膜或包装材料),研究中所有约14000个micro-CT切片(图3 d).我们计算了纤维化病变占据的肺体积及其相关的灰度CT密度,以创建体积×密度的综合测量值,包括纤维化的程度和严重程度(图3 c).与肺羟脯氨酸相比,Micro-CT提供了更大的检测纤维化变化的窗口,但ALK5抑制的治疗效果是等效的(与博莱霉素单独相比纤维化减少约60%)。
我们还对每个肺进行了简单的体素密度分析,而不依赖于对正常和纤维化区域的分割。生成的直方图显示了每个肺的平均体素数量,灰度值从0(密度最小)到255(密度最大)(图4a和b).博莱霉素+赋形剂组与生理盐水+赋形剂组相比,灰度值较高(CT密度较高)的比例增加。与博来霉素+载体组相比,博来霉素+ SB525334A小鼠在密度范围42-137的体素明显减少,表明纤维化程度较轻(图4b和c).在生理盐水+溶媒组和生理盐水+SB525334A组之间未检测到显著差异(未显示)。
博莱霉素治疗后3个月和6个月的显微ct定量分析
我们还使用micro-CT来解决单次滴注博莱霉素后正常肺结构的消失和恢复问题。博莱霉素后3个月和6个月,持续的纤维化改变(使人想起纤维化组织性肺炎)micro-CT检查仍明显可见,小叶间隔增厚,呈花边样纤维化,气隙增大,胸膜下增厚,肺轮廓严重扭曲,提示未能完全消除BILF或完全恢复正常肺结构(图5b和c,图6和在线补充视频(5和6)因此,Micro-CT显示在单次注入博来霉素后持续很长一段时间的大体肺异常。组织学检查显示存在增生上皮和/或细支气管化,以及高度紊乱的肺泡结构。Micro-CT显示的体积×密度读数显著增加博莱霉素治疗后3个月和6个月均高于对照组(图5a).然而,与3个月相比,6个月时该参数显著减少,提示纤维化改变的部分重塑。
讨论
据我们所知,这是迄今为止对博莱霉素肺纤维化模型进行的最彻底的表征和基准测试,使用尖端的微CT扫描和分析方法来定义新的、敏感的临床前药物评估终点。确定治疗IPF等疾病的新疗法在很大程度上取决于实验模型预测最终临床结果的能力。在许多研究中(包括我们自己以前的工作),预防性给药计划和/或使用非条件遗传缺陷小鼠表明了大量药物靶点和关键纤维化途径的抗纤维化潜力[3.]然而,绝大多数临床试验都未能再现希望从小鼠到雄性小鼠的治疗效果。
使用治疗剂量策略的有限数量的研究可以提供更多的临床相关数据。例如,吡非尼酮在博莱霉素诱导的仓鼠和小鼠肺纤维化时显示出治疗效果[6.,13],并已在欧洲获得治疗轻度至中度IPF的上市许可。相比之下,博莱霉素给药后给大鼠口服泼尼松龙治疗并不能改善纤维化[9,14].最近的一项酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼的临床试验未能证明对IPF患者的生存或肺功能有任何有益的影响[15];博莱霉素暴露后,伊马替尼对小鼠的治疗剂量也未显示疗效[8.]因此,如果采用适当的给药策略和终点,博莱霉素诱导的肺纤维化实验模型可能具有预测临床结果的潜力。
在这项研究中,我们仔细地定义了一个机会窗口,在单次口咽滴注博莱霉素(50μL盐水中每只小鼠50 IU)后14至28天,即已确定的纤维化病变进展,定义为肺总胶原量进一步增加和沉积的胶原纤维在组织学上的成熟。虽然这表示纤维化迅速和急性恶化,但潜在的病理机制可能与人类疾病有关。
小动物成像,使用micro-CT,体积平板CT [16]或磁共振成像[17,例如,在研究小鼠肺的形态学变化方面越来越受欢迎。由于这些都是微创和非破坏性的方法,也可以用于纵向研究小鼠和大鼠肺纤维化的发展体内;然而,分辨率受到呼吸和心脏运动的限制[18]对于CT而言,是指可以安全使用的辐射剂量离体micro-CT扫描方法从14天起清晰地识别出纤维化病变,具有高度可重复性的中上肺和背中心分布模式,并消除了活体动物成像相关的实际和分析困难,从而开启了其他实验室采用该方法的大门。此外,通过分析整个肺,我们避免了与组织学分析相关的取样误差/偏差[19].
优雅的研究进行了比较和对比体内和离体正常小鼠肺的显微CT扫描[11或强调不同鼠系间肺结构的差异[20]然而,很少有研究涉及使用显微CT评估小鼠肺纤维化模型中的纤维化变化程度。以前的研究[21–23]使用体内micro-CT研究腺病毒TGF-β1过度表达诱导的或博莱霉素肺纤维化大鼠或小鼠模型的纤维化变化,相关体素大小为∼155μm、94μm或35μm。这些研究使用不同的方法将组织分割为两种类型[21或充气肺容量[22],或使用半定量病理评分[23],但这些方法的效用尚未通过药物干预策略得到验证。J在里面等[24]使用micro-CT(带∼(44.25-μm空间分辨率)研究罗格列酮在小鼠BILF期间的治疗作用;他们报告了定性放射学评估中的有益变化,但没有提供纤维化变化的完全定量测量。值得一提的是,这项研究由sk等[21]还研究了肺功能(机械通气时的压力-容积循环),并在micro CT上证明了肺硬度和纤维化程度之间的强相关性,强调肺功能参数也是纤维化模型中高度相关的终点测量。
我们的micro-CT研究已经通过使用TGF-βR-1激酶(ALK5)仔细实施的治疗剂量策略进行了基准测试抑制剂。考虑到TGF-β信号通路作为促纤维化反应的主要驱动因素的无可争议的重要性,选择ALK5抑制作为适当的概念证明;小分子抑制剂SD-208抑制ALK5在AdTGF-β1诱导的肺纤维化模型中显示出治疗益处[25]预防性给药SB525334A可减轻BILF期间纤维化肺的各种组织病理学改变[26].与SD-208数据一致[25]我们的SB525334A治疗剂量策略也显著减轻了纤维化进展。给药开始时,肺部已经有一个∼总肺胶原蛋白增加60%(即博莱霉素治疗后14天);ALK5抑制完全阻断了预期的进展,证实了TGF-β信号通路的主要促纤维化作用。就SB525334A的疗效而言,全肺胶原蛋白的高效液相色谱测定和纤维化的微ct评估非常接近,纤维化反应的衰减大约为55-60%。然而,重要的是,micro-CT为检测治疗效果提供了一个更大的窗口。值得注意的是,与通常用于高效液相色谱测定的8-11只小鼠相比,每组只需3 - 4只小鼠就能测定这种反应,从而减少了所需实验动物的数量;此外,用于micro-CT的相同的肺可以进行组织学检查,进一步细化并减少所需的小鼠数量。该方法必须依赖于高度标准化和同质的肺灌注/固定方案,以避免组织伪影的错误分类;然而,在另一项单独的研究中,在micro-CT分析(而不是组织学)后,对肺羟脯氨酸进行了高效液相色谱分析,并发现全肺胶原蛋白和micro-CT评价之间存在显著相关性(r2.=0.7553,p<0.001).在放射学评估方面,micro-CT清晰地突出了致密实变、牵引性支气管扩张、小叶间隔增厚和胸膜下瘢痕的区域,这些区域与组织学上确定的纤维化区域完全一致。这项工作进一步支持micro-C的有效性和提高的敏感性T作为BILF中纤维化严重程度的真实结果测量。
有趣的是,我们还评估了博莱霉素时间反应期间常用的Sircol分析。Sircol检测到的肺胶原比例仅占HPLC分析测定的总肺胶原的9%。两种测量之间没有相关性。此外,Sircol显示胶原征象增加在博莱霉素后7天,这并没有通过HPLC测定重现阿雷乌等[27],对Sircol分析的详细分析强调了由于非胶原蛋白(如血清蛋白)的干扰而产生的问题,除非对方案进行适当修改;我们推测,第7天Sircol信号的增加可能反映了此时血管渗漏的增加[10,并且会质疑Sircol试验作为独立的纤维化终点测量的有效性,除非进行适当的修改。
对于将BILF作为IPF模型的一个主要批评是,人们普遍认为,纤维化病变通常在博莱霉素给药后5-6周内迅速消退[28,29这显然与人类长期的、渐进的状况不一致。相反,我们的数据显示,虽然纤维化病变没有继续进展,但在一次口咽灌注博莱霉素后持续≥6个月。事实上,在博莱霉素治疗3个月后,总肺胶原蛋白的增加与28天时相同,这意味着在这个时间框架内纤维化反应很少或没有解决。博莱霉素治疗6个月后,微ct继续显示高度改变的肺结构,令人联想到纤维化的组织性肺炎,并伴有支气管血管束周围的纤维化,胸膜下瘢痕和大规模扭曲的肺轮廓。组织学上,纤维化病变的整体细胞数量出现下降(炎症浸润和成纤维细胞),取而代之的是密集的瘢痕组织,并伴有丰富的增生性上皮和/或细支气管化,这是IPF的组织学特征。此前,只在重复博莱霉素给药模型中持续观察到增生上皮[30].我们的数据表明,这些特征与纤维化的重塑有关,但在这个较晚的时间点,肺泡结构似乎没有明显的恢复。因此,在这种情况下,我们没有观察到博莱霉素对纤维化反应的完全缓解,这为评估能够启动肺修复的治疗方法,而不仅仅是停止纤维化提供了可能性。我们的数据也重申了由博莱霉素模型的不同排列引起的纤维化反应的时间异质性[5.].
总之,这项工作表明口咽给药博莱霉素诱导的肺纤维化的实验模型对于建立靶化合物的治疗效果以阻止不能迅速解决的病变的纤维化进展是非常有用的模型。它还强调了彻底的特征性治疗的重要性对每个实验室博来霉素模型的排列进行分类,以确定最合适的给药策略,并了解纤维化反应的自然史和相关的纤维化机制。
致谢
我们要特别感谢Penny Shaw(英国伦敦大学学院医院)对micro CT数据的专家评估和解释,以及Alejandro Ortiz Stern(英国伦敦大学学院)对解决纤维化问题的非常有用的讨论。我们还要感谢Steve E.Bottoms(伦敦大学学院)和Mike Haase(英国史蒂夫纳奇葛兰素史克)分别获得组织学和显微CT方面的专家技术援助。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.www.qdcxjkg.com
支持声明:作者感谢以下资助机构:英国肺脏基金会(C.J. Scotton Research Fellowship F07/6);医学研究理事会(C.J.斯考顿职业发展奖G0800340;2009-2012年度中华人民共和国钱伯斯案例奖);威康信托基金(A. Datta Clinical Research Training Fellowship 084382/Z/07/Z);欧洲委员会(R.C. Chambers框架7方案HEALTH-F2- 2007-2224);和欧洲IPF网络)。SB525334A由葛兰素史克(Stevenage, UK)捐赠。
利益冲突:可以在本文的在线版本旁找到披露www.www.qdcxjkg.com
- 收到了2012年11月12日。
- 认可的2013年2月4日。
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