抽象的
肺排出的纵隔淋巴结(MLNS)目前广泛用于诊断结节病。我们以前报道,T-Helper(Th)17.1细胞负责蠕动肺中夸张的干扰素-γ产生。在这项研究中,我们的目标是调查1)Th17.1细胞在结节病患者的MLNS中也增加,2)诊断中TH17.1细胞的频率是否与疾病进展相关。
从治疗幼稚肺酸肺腹菌病(n = 17)和健康对照(n = 22)和周围血液单核细胞(n = 34)和支气管肺泡灌洗液(N = 34)和从结节病患者的肺病(n = 34),CD4.+流式细胞仪测定t细胞亚群比例。
在顺节病变外比对照MLNS中检测到较高比例的Th17.1细胞。与MLNS和外周血相比,在结节病虫病中发现了较高的TH17.1细胞比例。此外,在发育慢性疾病的患者中,BALF Th17.1细胞比例显着高于在临床随访后2年内进行分辨率的患者。
这些数据表明,Th17.1细胞比例在肺结节病中可作为临床诊断和/或预后指标,并可作为新的治疗靶点。
抽象的
在结节病变中增加了Th17-谱系细胞和BALF TH17.1细胞比例与疾病进展相关http:////hebb730hsev7.
介绍
结节病是一种多系统肉芽肿性疾病,未知原因,主要是影响肺部[1].该疾病影响了世界各地的人,但疾病的发病率/流行率和自然过程差异很大[1- - - - - -3.].有趣的是,大多数结节病患者病情消失,但肉芽肿持续存在于~ 30%的患者中,这可能导致慢性,有时需要治疗的进展性疾病[1,4].(non-Löfgren)结节病患者的病程是由哪些环境、遗传和/或免疫因素决定的,这在很大程度上仍不清楚。因此,还没有确定的变量,常规使用在临床实践中,以帮助预测结节病患者的病程。
我们最近报道,结节病肺中夸大的干扰素(IFN)-γ主要来自t辅助(Th) 17.1细胞,而不是来自Th1细胞[5].肺结节病的主要特征之一是纵隔淋巴结病。肺引流纵隔淋巴结(MLNs)已成为一个有吸引力的临床诊断结节病的部位,因为在MLNs中检测肉芽肿比在肺中更准确[6].鉴于MLN受累的程度及其肺结结病中强的诊断价值,我们的目标是调查1)在结节病症患者的MLNS中是否也增加了Th17.1细胞(这可能为诊断的值增加)和2)是否频率在诊断时的Th17.1细胞可能与2年后疾病进展相关。因此,在目前的研究中,我们调查了CD4的分布+t细胞亚群在对照组和结节病mln中,并与结节病外周血和支气管肺泡灌洗液(BALF)进行比较。
材料和方法
研究设计和研究对象
患有肺顺势患者在诊断时包括。根据美国胸部社会/欧洲呼吸学会/世界结节病和其他肉芽肿疾病协会的指导方针进行诊断[188bet官网地址1].
排除标准在研究包容性之前3个月使用免疫调节药物,呼吸道感染4周,并在研究包容前4周,伴随肺病(包括慢性阻塞性肺部病症和哮喘),自身免疫疾病,恶性肿瘤,艾滋病毒血清阳性,妊娠和过敏。
在本研究中,55例结节病患者捐献BALF、mln来源的细针抽吸或外周血。补充图E1显示详细的流程图,描述每个参与的患者为本研究捐赠的材料。
患者的患者患者(可用数据的N = 25的疾病疗程进行了2年后确定了患者。通过胸部射线照相和临床症状的异常没有异常来定义疾病的分辨率。胸部射线照相剩余异常的患者,但不需要治疗被指定为非进口慢性和治疗需要的患者被指定为渐进的慢性。
从22例肺移植供体中收集对照MLNS,没有肺炎症的迹象(通过胸部射线照相和支气管镜检查常规评估)。
Erasmus MC医学伦理委员会(鹿特丹,荷兰)批准了这项研究。在纳入研究之前,每位参与者都获得了书面知情同意。进一步的主题特征见表格1.
学习材料
如前所述进行了与支气管肺泡灌洗的支气管镜检查[7].如前所述处理BALF细胞和外周血[7].
内镜或支气管超声引导下用22G(或19G)针细针抽吸mln。MLN吸出物通过100 μm细胞过滤器(BD Biosciences, Oxford, UK)过滤并离心。细胞保存在−150°C。
对照组的mln来自肺移植供体。对照mln作为淋巴结吸出物处理。
流式细胞仪
使用列入的抗体染色BALF,MLN和外周血单核细胞染色和细胞外标记物补充表E1.CD45RA的亚群-FoxP3低/ int在趋化因子受体表达的基础上鉴定了总内存细胞(补充图E2).用于405 nm(Thermofisher,Paisley,UK)的可固定Aqua Dead Cell染色套件被用作现场/死亡标记。在流式细胞仪LSRII(BD Biosciences)上测量每个样品的至少100 000个细胞,细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)的平均荧光强度标准化为健康对照外周血细胞的平均表达,称为变化平均荧光强度。KI-67染色用于评估细胞亚群的增殖状态。
统计分析
使用Mann-Whitney U-Test或Wilcoxon签名级别测试进行比较。P值是双面,使用SPSS统计版本21(IBM,Armonk,NY,USA)进行分析。P <0.05被认为是统计学意义。
结果
与对照相比,术语中的术语中Th17.1细胞的显着增加
我们之前发现IFN-γ的存在增加+结节病的Th17.1细胞与控制相比[5].我们质疑Th17.1细胞在结节病mln中是否也比对照组增加。由于Th17.1细胞主要被认为是Th17细胞的后代[8- - - - - -15],我们旨在量化TH1,TH2和所有CCR6+BALF型结节病(n=36)、mln型结节病(n=17)和对照mln型结节病(n=22)的亚群(门控策略见补充图E3).CCR6.+认为双阳性细胞反映TH17和TH17.1细胞之间的中间阶段[16- - - - - -18].
在顺节痛BALF中,TH17.1细胞比例高于TH1,TH2,TH17或CCR6+double-positive细胞(图1A)因此代表了Balf中最主要的群体(图1B.).类似结节病BALF [5],结节病,MLNS包含更高的CCR6比例+th细胞比对照mlns(图1C.).重要的是,与对照mln相比,我们发现结节病mln中Th17.1细胞比例显著增加(图1D).此外,结节病变含有增加的Th17.1前体细胞的比例增加,IE。th17 [19]和CCR6.+双阳性细胞,与对照组相比(图1D和e)。在结节病虫松中,与对照相比,TH1细胞比例显着降低,尽管TH1细胞保持(如对照)最突出的内存T细胞群(图1D和e)。
连胜,这些数据显示,与对照相比,结节病变含有增加的Th17.1细胞比例,平行于肺部[5].
Th17.1细胞和CCR6+双阳性细胞在结节病mln中高度增殖
Sarcoizosis MLNS中TH17.1细胞的增加可能是增强的增殖引起的;因此,我们评估了T细胞亚集的增殖状态。
增殖比例(Ki-67+)CD4+与对照组相比,血管缺陷MLNS中记忆T细胞显着增加(图2A).有趣的是,特别是Th17.1细胞和CCR6+双阳性细胞表现出高增殖率的Ki-67+细胞与对照相比(图2B.和c)。这对Th17.1亚潜水费特别引人注目,这在控制中仅包含很少的ki-67+细胞。但是,CCR6.+双阳性细胞含有最高分数的增殖细胞(~15%,显着高于任何其他T细胞亚群)在结节病虫松中(图2B.).有趣的是,CCR6.+与对照组相比,双阳性细胞也显示出在顺序异常中的CTLA4表达降低(图2D.),正如我们之前在Th17细胞中所展示的那样[19].
总之,体外表型鉴定了Th17.1细胞作为同性恋患者MLNS中的高增殖性Th亚特点,与对照相比。此外,CCR6.+与其他Th细胞亚群相比,双阳性细胞在结节病mln中也有较高的增殖率。
较高的Th17.1细胞比例在结节病变和BALF而不是外周血
接下来,我们的目标是量化th17衍生的CCR6+结节病人群外周血、mln和BALF。
值得注意的是,在结节病患者中,记忆Th细胞为CCR6的比例+与外周血(~19%)相比,BALF(〜75%)和MLNS(〜31%)显着高(~19%)(补充图E4).BALF的Th17细胞比例显着低于MLNS和外周血(图3A),而Th17.1细胞显著升高(图3C.).CCR6的比例+双阳性细胞在MLNS和BALF中相似,但BALF比外周血明显高(图3B.).CCR6-结节病BALF中Th1细胞比例较mln低(补充图E4).重要的是,从多个器官捐赠材料的患者的亚组的配对分析(外周血和MLNS(n = 17)或外周血和BALF(n = 15))也显示出TH17细胞的显着降低和显着增加与同一患者的外周血相比,MLNS或BALF中的细胞比例(补充图E5).
在一起,数据显示,Th17.1细胞不是结节病患者外周血中的突出人群。相反,患者显示MLNS中的Th17.1细胞增加,在runciving肺中进一步增强。
患者发育慢性疾病的患者比较高的BALF TH17.1细胞比例比经历分辨率的患者
由于Th17.1细胞在结节病肺中具有致病性且高度存在,我们质疑Th17.1细胞在BALF中的比例是否与疾病预后有关。因此,我们确定了研究队列中一个亚组(n=25)的病程,随访时间为~ 2年。
有趣的是,在发展为慢性结节病的患者,特别是需要治疗的进行性慢性结节病患者中,诊断时检测到的BALF Th17.1比例明显高于正在消退的患者(图4A).相比之下,进展性慢性疾病患者的Th1比例低于疾病缓解患者(图4B.),在发育慢性疾病的患者的BALF中产生的比例增加了增加(图4C.).虽然不显着,Th17比例也表明患者发育慢性疾病的患者患者患者比在接受慢性疾病的患者中表现出慢性疾病的患者,但在BALF中发育慢性慢性疾病的患者均为较高的TH17.1 / TH17比率(补充图E6).
总之,数据表明慢性疾病的发展与结节病BALF中Th17.1细胞的数量显著相关,支持这些细胞在(慢性)肺结节病的发展中发挥致病作用。
讨论
我们的研究是第一个表明Th17.1细胞在与对照MLNS相比的结节病虫病中显着增加,反映了我们在顺序病变肺中的先前发现[5].此外,与结节病来源的MLNs和外周血相比,肉芽肿性BALF中Th17.1细胞比例最高。肺部Th17.1细胞比例较高与慢性疾病的发展显著相关。综上所述,这些数据表明Th17.1细胞比例在肺结节病中可以作为临床诊断和/或预后指标,并可作为新的治疗靶点。
自从认识到Th17细胞具有相当大的可塑性并能产生IFN-γ以来,越来越清楚的是,产生IFN-γ的Th17细胞在自身免疫性疾病的发展中发挥着关键作用[17,20.].IFN-γ产生的Th17细胞,或所谓的Th17.1细胞,被描述为在多种自身免疫性疾病和慢性炎症疾病中具有致病性,包括克罗恩病[8,9]及关节炎[10].在之前的研究中,我们明确了CCR6+Th17.1细胞而不是古典CCR6-Th1细胞是结节病BALF中IFN-γ产生的主要来源[5].有趣的是,我们发现在结节病MLNs中不仅Th17.1细胞,而且所有的CCR6细胞+Th小区子集,包括Th17和CCR6+双阳性细胞,与对照mln相比明显增强。如Th17和CCR6+双阳性细胞可能是Th17.1细胞的前体细胞,数据可能提示th17谱系亚群分化发生在结节病mln中[21].
除了支持在结节病虫松中诱导Th17细胞外,我们的数据表明长期发炎的地点[10,15],如结节病肺(但也可能是MLNs的肉芽肿部分),通过诱导Th17向Th17.1细胞转化,从而加速Th17.1细胞分化。例如,比较不同的免疫室发现,与mln和外周血相比,结节病肺中特异性的Th17.1细胞增加。在幼年特发性关节炎患者的关节中,与外周血相比,Th17.1细胞分数也增加,且与Th17细胞共享克隆祖先[10].此外,尽管Th17.1细胞大量存在于受影响的器官的结节病,但我们确定了CCR6+先前建议代表Th17和Th17.1细胞之间的中间阶段的双阳性细胞[16- - - - - -18]作为具有最高级别的增殖细胞的子集。结节病CCR6.+与对照相比,双阳性细胞还显示出降低的共抑制CTLA4表达,可能导致增殖能力增加。以前,我们还观察到顺节病虫病MLNS TH17细胞中的CTLA4表达还原[19].共抑制受体如CTLA4的异常表达[19]对结节病中特定t细胞亚群的研究很可能是疾病发病机制的一部分,因为抗ctla4的临床治疗与肿瘤患者mln中结节样肉芽肿的发生有关[19].最后,在结节病症肺部中发现了高水平的细胞因子,例如可以诱导朝向Th17.1细胞的Th17转变的白细胞介素(IL)-12或IL-23。10,13,15,22].在顺节病病变肺中始终发现IL-12(p70和p40)的蛋白表达增加[23- - - - - -25].虽然IL-23p19在结节状肺中的表达尚不确定,但IL-12p40与IL-12p70的高表达可能很好地表明IL-23水平升高[25],因为IL-12p40也是IL-23的亚基[17].值得注意的是,与对照相比,肌肌损伤中的IL-23转录增强了[26]和血清淀粉样蛋白A,诱导抗原有助于慢性(肺动脉)的发育[27,已被描述为可增加树突状细胞分泌IL-23 [28].引人注目的是,在发育慢性疾病的患者中,Balf IL-12P40蛋白质水平最高[29].我们的数据不能排除额外的选择性Th17.1细胞迁移到肺病变肺部的可能性[15],受IFN-γ诱导的蛋白质10 / CXCL10的高局部共存吸引[30.]及CCL20 [31CXCR3的配体。然而,Th1细胞对结节病肺的吸引力也可以预期,因为这些细胞也表达CXCR3,我们没有发现这种现象的证据。
高度临床相关,我们发现与经过决议的患者相比,在发展慢性疾病的患者肺部诊断时发现了显着更高的Th17.1细胞比例。与我们以前发现增加的人口中增加的BALF TH17.1细胞比例,其中包括在第一,第二和/或第三线疗法上的渐进患者[5,这些数据有力地证明Th17.1细胞在肺结节病的发生/进展中具有致病作用。值得注意的是,两个独立的单核苷酸多态性IL23R发现基因位点易受(慢性)结节病[32,33] IL-23受体(IL-23R)表达对于在小鼠的慢性炎症期间对致病性Th17.1细胞转化Th17细胞的必需[13,34].最近的基因组关联研究确定了在推定的推杆区内的单一核苷酸多态性IL23R基因可能影响IL-23R表达[33].确定的候选敏感性基因的功能预测和蛋白质网络分析为结节病的遗传性病学中IL-23 / Th17信号传导途径提供了突出的作用[33].再加上我们的数据,这就意味着IL23RIL-23/Th17信号通路相关的基因或其他基因可能通过支持Th17向Th17.1细胞转化或稳定Th17.1细胞而诱发(慢性)结节病。因此,IL-23R信号的特异性靶向,如。通过tildrakizumab/guselkumab (anti-IL-23p19),它最近被描述在牛皮癣中成功[35],可能是一种很有前途的治疗(慢性)结节病的新方法。
调查CCR6的其他预期研究+Th17 - 谱系细胞功能,如细胞因子生产,在具有明显疾病预后的结节病患者中,以解决TH17谱系细胞的功能复杂性。Löfgren病中最近报道的发现突出了这一点[36],急性结节病的亚型,患者不太可能发展慢性疾病。在这些患者中,肺部Th17.1细胞与有利的疾病结果相关[36].LöfgrenBalf含有较高水平的有利Th17细胞因子,如IL-17A,IL-10和IL-2,可能导致Löfgren患者的有利预测;然而,与Löfgren患者相比,非Löfgren患者的IFN-γ水平较高,可能导致更糟糕的结果[36].此外,波伦仑综合征在活性疾病中与高度炎症性曲线相关,这将确认Th17.1细胞的致病潜力。
综上所述,本研究表明结节病中存在CCR6+肉芽肿的MLNS中,Th17谱系细胞显着增加,并且可能分化为肺部微环境中的Th17.1细胞,其存在与慢性疾病的发展显着相关。本研究提供了一个新的一个新的透视,2)Th17.1细胞的价值作为潜在的诊断/预后标志物,3)新治疗靶标的潜力。
补充材料
确认
作者感谢患者,研究护士和医生参加了来自Erasmus MC,Franciscus Gasthuis&Vlietland,Leiden大学医疗中心和荷兰的Ikazia医院的研究。作者感谢Ingrid Bergen和Jennifer Van Hulst(Erasmus MC,荷兰)的技术援助,埃里克·卢比(Erasmus MC,Rotterdam,荷兰)进行关键讨论。
作者捐款:C.E. Broos,M.Van Nimwegen,S.M.J.Paulissen,J.C.M.M.在't veen,H.C.Hoogsteden,R.W. Hendriks,B.Van Den Blink和M. Kool设计了该研究和实验。C.E. Broos,M.Van Nimwegen,J.C.M.M.在't veen,s.m.j.Paulissen,J.P.Van Hamburg,J.T.Annema,R. Heller-Baan,A.Kleinjan和M.S.Wijsenbeek负责流式细胞术和数据收集。C.E. Broos,L.L.Koth,R.W. Hendriks,B.Van Den Blink,M. Kool分析了数据。 C.E. Broos, L.L. Koth, M.S. Wijsenbeek, R.W. Hendriks, B. van den Blink and M. Kool drafted the manuscript. All authors read, critically revised and approved the final manuscript.
脚注
本文提供了补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:M. Kool由FP7 Marie Curie CIG Grant提供支持。C.E. Broos由ATS Par成员基金会的旅行奖提供支持的Sarcotizos病研究。本文的资金信息已存入Crossref资助者注册表.
兴趣冲突:C.E.Broos,R.W. Hendriks,M.Kool患有P117584N100(Th17.1细胞作为生命周期病疾病预后的生物标志物)等待于C.E.Broos,R.W. Hendriks,M.Kool和J.R.Miedma。
- 收到了2016年11月24日。
- 接受2018年1月2日。
- 版权©2018人队