摘要
淋巴管平滑肌瘤病(LAM)是一种罕见的女性疾病。肺功能的下降是可变的,使适当的靶向治疗变得困难。我们使用无偏血清蛋白质组学鉴定与LAM预后相关的标志物。
从英国国家LAM中心招募了101名患有LAM的妇女和22名健康对照组。从美国国家心肺血液研究所LAM注册中心的患者中获得了152份与肺功能相关的DNA和血清样本及预后数据。使用SCIEX SWATH质谱工作流程对50份LAM和20份对照血清样本的发现队列进行蛋白质组学分析。采用酶联免疫吸附测定蛋白水平和单核苷酸多态性GC对编码维生素D结合蛋白(VTDB)的(组特异性成分)进行基因分型。
蛋白质组分析显示,LAM患者的VTDB比对照组低2.6倍。与稳定型LAM相比,进行性LAM的血清VTDB较低(p=0.001),并与肺一氧化碳扩散能力相关(p=0.01)。患者到死亡或肺移植的中位时间减少了46个月CC在RS4588和38个月内的基因型在RS7041 / 4588处的非含有非A的单倍型(P = 0.014和0.008)中的基因型。
VTDB轴与疾病严重程度和预后有关GC基因型可以帮助预测林中的无移植存活。
摘要
维生素D结合蛋白及其应用GC基因型与LAM女性的肺功能和生存有关http://ow.ly/UacI30leLzr
介绍
淋巴管平滑肌瘤病(LAM)是一种罕见的多系统疾病,以肺囊肿和淋巴异常为特征。这种疾病几乎只局限于女性,每百万人中约有9人患此病,并可偶尔发生,也可发生在结节性硬化复合体(TSC)患者中[1,2].在林,囊肿逐渐取代肺部牙科,导致复发性气胸,通常在变量期间呼吸衰竭[3.].淋巴阻塞导致乳糜溶解、乳糜积液和腹水。大约一半的散发性LAM患者和大多数TSC-LAM患者同时患有血管平滑肌脂肪瘤,这是一种良性肿瘤,通常发生在肾脏[2].患者的肺部和淋巴管被林细胞渗透:克隆,转移细胞,具有组合平滑肌和黑素细胞表型特征的血管外上皮细胞肿瘤瘤[4].LAM细胞有双等位基因TSC突变[5导致雷帕霉素(mTOR)机制靶点的过度激活,mTOR是两种多蛋白复合物的组成部分,控制增殖、迁移、自噬和代谢[6].
大多数LAM患者在1秒内以强迫呼气量(FEV)加速丧失肺功能1)每年下降70-140毫升[7,8];然而,有些进展迅速,而另一些则可以保持稳定多年[3.,9].mTOR抑制剂治疗可防止大多数进行性疾病患者肺功能丧失[8- - - - - -10].虽然通常需要在较长时间内进行多次测量,但识别轻度肺功能损害患者的进展性疾病是很重要的[7].因此,需要疾病活动的标志物来预测那些有肺功能丧失风险的人,以便在其发生之前进行治疗。此外,对活动性疾病患者进行分层可以减少新疗法II期研究的规模、持续时间、成本和可行性。
一些临床和血清预后因素已经确定。血清血管内皮生长因子(VEGF)-D升高与LAM的存在有关[11]肺功能较快丧失。患有呼吸困难而不是气胸的介绍以及对支气管扩张剂的反应与较差的结果有关[12- - - - - -14],而绝经后状态则与较慢的肺功能丧失有关[7,15].尽管如此,但无法准确预测个人内的预后。在此,我们使用血清蛋白质组学来鉴定与林的存在和严重程度相关的蛋白质,并确定维生素D结合蛋白(VTDB)及其基因的变化,GC(组特异性成分),与LAM的疾病严重程度和生存率相关。
材料和方法
病人及样本收集
2011年至2016年间,从英国诺丁汉国家LAM中心招募了101名患有LAM的女性和22名健康对照女性(图1).获得了东米德兰兹研究伦理委员会的伦理批准(13/EM/0264)。所有受试者均提供书面知情同意。第二组研究对象为152名1998年至2001年在美国国家心肺血液研究所(NHLBI) LAM登记处招募的LAM患者,用于复制和研究长期生存率[16](图1).所有受试者的基线胸部和腹部计算机断层扫描、系列肺功能、血清和招募时的DNA。临床评估,肺功能和样本分析的两个队列描述补充材料.由于随访时间长,全因死亡率或需要肺移植仅在NHLBI LAM注册队列中可用,并通过查询美国国家死亡指数(www.cdc.gov/nchs/ndi/index.htm)及器官共享联合网络数据库(https://unos.org/data.).由于对这种队列没有使用雷帕霉素的数据,在雷帕霉素广泛用于美国林的治疗前,2010年被审查了结果数据。
蛋白质组学
70个血清样本(50 LAM和20个对照)在SCIEX(英国沃灵顿)TripleTOF 6600质谱仪上分析,该质谱仪与Eksigent nanoLC 425系统连接,使用SCIEX SWATH质谱工作流程[17].使用ProteinPilot 5.0 (SCIEX)与Swiss-Prot human database (www.uniprot.org; 2015年1月),错误发现率为1%,识别重点为生物修饰。SWATH数据与PeakView(SCIEX)中的库文件对齐,并使用SCIEX OneOmics平台上传和处理[18].详情请参阅补充材料.
血清蛋白质量化
血清VTDB,α1在英国队列中分别使用Quantikine ELISA试剂盒DVDBP0、DAGP00和DVED00测定-酸性糖蛋白1 (A1AG1)和VEGF-D (R&D Systems, Abingdon, UK)。使用Quantikine ELISA kit DVDBP0B (R&D Systems)测量NHLBI LAM注册表中的VTDB。
基因分型
使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(英国南安普敦Promega)从全血中提取DNA。作为GC基因型因人群而异,基因分析仅限于欧洲血统的人群。来自英国生物样本库的65份英国LAM样本及168 141份欧洲血统的非亲属对照女性样本(www.ukbiobank.ac.uk.uk.)采用Axiom UK生物银行阵列(Affymetrix, High Wycombe, UK)进行基因分型。祖先是由k-表示对全基因组单核苷酸多态性(SNP)数据的前两个主要成分进行聚类[19].来自NHLBI LAM注册队的妇女使用KASP PCR基因分型(LGC基因组学)基因分型,与调查表获得的祖先。
统计分析
如果蛋白组学鉴定出的蛋白≤−2或≥2 log,则视为差异表达2如L所描述的,置信值≥0.7ambertet al。[18].Welch的T-Test或Mann-Whitney U-Test用于分类数据;线性回归和Spearman的相关性用于连续数据。GC使用Chi-Squared Tests进行比较有林和英国Biobanc控制的女性的等位基因频率[20.].生存分析采用Kaplan-Meier图进行,差异分析采用Mantel-Cox log-rank检验。使用Prism version 7 (GraphPad, La Jolla, CA, USA)和SPSS version 24 (IBM, Armonk, NY, USA)进行分析。
结果
发现队列和血清蛋白质组学
前50名未接受mTOR抑制剂治疗的英国LAM女性和20名健康对照女性组成了发现队列。根据回顾性FEV损失,队列被分为更进行性和更稳定的疾病1超过50 平均每年毫升±sd观察期11±4年。病情进展的患者FEV较低1,肺对一氧化碳的扩散能力(DLCO)血清VEGF-D值较高,但年龄和病程与病情稳定者相似(表格1).
70血清样品的MS鉴定了126个蛋白质,包括血清蛋白白蛋白,血红蛋白,酸糖蛋白,免疫球蛋白,补体组分,凝血因子,蛋白酶和蛋白酶抑制剂(补充表E1).林中的VTDB水平比健康对照女性更低为2.6倍(自信0.65)(补充表E2).为了鉴定严重程度标记,我们将那些具有稳定和渐进性疾病的蛋白质组学谱进行了比较。与稳定的疾病相比,A1Ag1水平在渐进性的比较方面为3.6倍(自信0.70)。具有LAM的绝经后妇女的比较未在预先指定的置信水平处识别差异表达的蛋白质。
血清蛋白质量化
用elisa检测VTDB和A1AG1,验证MS结果。与蛋白质组学结果一致的是,在英国发现队列中有50名LAM女性和在英国复制队列中有27名LAM女性的血清VTDB低于对照组(p=0.007和p=0.002)。在英国发现组(n=50)和复制组(n=27)的77名女性中,VTDB为273±96µg·mL−1在林和347±92μg·ml−1在对照女性(P = 0.002)(图2一个).经ELISA评估,在发现和复制队列中,LAM女性的A1AG1高于对照组女性(p=0.04和p=0.0001)。A1AG1为910±478µg·mL−1为619±270µg·mL−1对照组女性(p=0.004) (图2 b).
VTDB与疾病严重程度有关
随访时,进展性肺病患者的VTDB显著低于稳定性肺病患者(进展性221±89µg·mL)−1与稳定299±90μg·ml−1;p = 0.001) (图3一).VTDB水平与预测百分比呈正相关DLCO(p=0.01),但不包括用力肺活量(p=0.09)或FEV1(p = 0.23)(图3 b- d)。病情稳定者A1AG1明显高于病情进展者(病情稳定者1004±525µg·mL)−1与渐进式753±341μg·ml−1;p = 0.01) (补充图E1),但与肺功能无关。VTDB水平与年龄、诊断年龄、绝经状态、症状性质、结节性硬化症、血管平滑肌脂肪瘤、淋巴疾病或血清VEGF-D水平无关(数据未显示)。77例未治疗妇女和24例接受雷帕霉素治疗妇女的VTDB分布相似,而A1AG1在雷帕霉素治疗组较高(治疗1132±474µg·mL)−1与未处理910±478μg·ml−1; p=0.031)(补充图E2).
协会GC林和血清VTDB的基因型
作为GC基因型因血统不同而不同,遗传分析仅限于英国的65名个体和欧洲血统NHLBI LAM注册队列中的145名个体。两个单核苷酸多态性GC在rs7041和rs4588中定义主要GC单倍型:1)GC1F其中RS7041(g)和Rs4588(a),2)GC1S其中rs7041 (T)、rs4588 (A)和3一般条款2其中rs7041 (G)和rs4588 (C)。在英国和NHLBI LAM登记队列中,这些snp的等位基因频率与英国生物库中的对照组女性或彼此没有差异(补充表E3).在两个LAM队列中,与一般人群一样,血清VTDB依赖于GC基因型(补充图E3) [21].
VTDB蛋白和基因型与预后的关系
在英国队列中,91名LAM女性在入组1年后测量了>以上的肺功能(64名未经治疗,27名接受雷帕霉素治疗)。平均观察时间为19个月,相当于144例患者年的观察时间。在NHLBI LAM注册队列中,136名未经治疗的LAM女性在入组1年后在>范围内测量了肺功能,平均观察期为40个月,相当于500例患者年的观察。在两个队列中,血清VTDB与肺功能的前瞻性变化均无相关性(表2.).
在NHLBI LAM注册队列中,血清VTDB低、rs4588的AA基因型和rs7041的TT基因型的FEV丢失率最高1和DLCO,虽然不明显(表3).然后,我们在NHLBI LAM注册队列中检查了VTDB轴与死亡或肺移植时间的关系。尽管死亡时间或移植时间与血清VTDB水平无相关性(p=0.76) (图4一)或rs7041基因型,与rs4588基因型相关。在rs4588时,AA或AC基因型的中位死亡或移植时间为150个月,而CC为104个月(p=0.014) (图4 b).所有等位基因为rs4588的单倍型到死亡或移植的中位时间(包括GC1F和GC1S单倍型为150个月,而无A等位基因的单倍型为112个月(包括一般条款2;p = 0.008)(图4 c).
讨论
我们首次表明VTDB轴与LAM妇女的严重程度和预后相关。VTDB水平与心脏病相关DLCO和疾病活动评估。具有渐进性疾病的人,因丧失FEV而定义1每年> 50毫升,往往比患有更稳定的疾病的vtdb水平较低,1在年龄和其他临床表现相匹配的情况下,每年低于50毫升。单的GC与死亡或肺移植的时间相关联。像这样,GC基因型是第一个被发现影响LAM无移植存活的遗传宿主因素。
VTDB是一种糖基化α-球蛋白,由肝脏、肾脏、脂肪组织和中性粒细胞产生。由GC第4q染色体上的基因,第11外显子上的两个snp,即。RS7041(GLU416ASP)和RS4588(THR420LY),定义VTDB的三个主要单倍型:GC1F(416 asp / 420刺),GC1S(416 glu / 420赖氨酸)一般条款2(416ASP / 420ly),血清VTDB水平与这些SNP相关[21].VTDB结合25(OH) - vitamin d和1,25(OH)2- vitamin d,尽管VTDB的运输能力远远超过维生素D水平。在研究的许多疾病中,VTDB和维生素D的血清水平无关,包括慢性阻塞性肺病(COPD)[22].的GC变种对维生素D有不同的亲和力;VTDB亚型、维生素D及其对肺部疾病的影响的复杂性尚不清楚[23].
相关的机制GC基因型和血清VTDB也未知。rs7041和rs4588是内含子SNP;它们都不与已知的启动子或增强子SNPs存在连锁不平衡,也不影响蛋白质的稳定性。以外的因素GC基因型,包括表观遗传学,也可能影响血清VTDB水平,尽管LAM患者的血清VTDB水平低于对照组,GC基因型在我们的研究中没有不同。
我们的研究结果反映了VTDB轴和林的复杂性。我们观察到,下血清VTDB与呈现的低肺功能和更活跃的肺病有关。由于VTDB与脉冲型的其他方面无关,包括血管血瘤或淋巴疾病的存在,因此VTDB轴可能与林无关本身,但就像其他肺部疾病一样,可能会改变组织对疾病的反应。重要的是,GC基因型与死亡或肺移植的时间相关。最强烈的影响是GC1F和GC1S单倍型,其与> 3年的中位数生存增加相关。有趣的是,这些和其他GC与生存改善相关的变异与血清VTDB最低水平无关。VTDB是一种多功能蛋白,可通过多种方式影响对肺损伤的反应。GC1F和GC1S是否与巨噬细胞活化增加有关一般条款2[22[通过增强保护性中性粒细胞应答或增强补体衍生的C5a的趋化作用,增加巨噬细胞活化可以是保护性的,无论是通过增强保护性中性粒细胞反应还是增强24,25].VTDB还充当肌动蛋白清除蛋白,因此有可能通过不同机制影响疾病,包括改变先天免疫和组织修复。不同的GC单倍型已经与肺部疾病的易感性有关GC1F与慢性阻塞性肺病风险增加相关GC1S和一般条款2[26].
这些观察结果强调了VTDB的多种潜在功能,以及这些功能如何与基因型相关以及与肺部疾病的复杂关系。LAM是一种多系统疾病,其复杂性也可能很重要。例如,VTDB蛋白与DLCO但不是FEV1强迫肺活量或无事件生存。虽然FEV1通常用于研究林的自然历史,DLCO通常在fev之前受损1并可能更好地反映LAM早期实质损害,并伴有FEV损失1由于实质损伤导致弹性后坐力丧失和气道过早闭合而发生较晚。肺血管疾病、宿主防御、外周肌肉功能和其他可能受VTDB功能影响的过程也可能有助于生存。
我们研究的一个优势之一是使用无偏的蛋白质组学方法,将VTDB鉴定为LAM的感兴趣蛋白质。维生素D轴在与组织重塑相关的其他疾病中的参与使我们的研究结果生物学似是[27].然而,我们的研究也有局限性,包括对少数对照样本,技术限制和研究稀有疾病所固有的局限性。首先,VTDB是含有LAM血清中差异的两种蛋白质中的两个蛋白质之一,并且所用蛋白质组学方法没有识别其他LAM标记,例如VEGF-D。VEGF-D在皮马摩尔水平表达[28],而VTDB是一个微摩尔水平,这表明使用这种蛋白质组策略,只有相对丰富的血清蛋白,在LAM妇女和健康对照之间存在显著差异,才能检测到。因此,其他可能有用的生物标志物可能还没有被发现。与此一致的是,在我们的蛋白质组学筛选中,与LAM相连接的另一种蛋白A1AG1,也被称为假体,是另一种相对丰富的血浆α-球蛋白,包含1-3%的血浆蛋白。由于A1AG1是一种急性期蛋白,在许多人群中已经被认为是总体生存的生物标志物,我们没有进一步研究它[29]. 由于LAM非常罕见,研究该疾病依赖于长期积累的队列。尽管这两个研究组都使用协议驱动的评估来获取包括肺功能在内的关键数据,但这些组的可用数据存在一些差异。虽然所用的两个队列在年龄和肺功能方面相似,但肺功能的预期变化不同,可能是因为在英国队列中使用雷帕霉素导致FEV损失减少1.相反,由于招生时间,现在只能在NHLBI LAM登记队队列中进行雷帕霉素之前的长期存活。目前具有渐进性疾病的人,包括英国队列的疾病,往往会用雷帕霉素治疗[10],需要更长的观察时间来研究VTDB蛋白或基因型对雷帕霉素治疗的LAM女性患者生存的影响。
总之,低水平的VTDB与LAM患者的肺功能差相关GC基因型与长期预后有关。我们的研究结果表明,VTDB轴是一个宿主因子,可能保护肺损伤LAM,并可能有预后意义。需要进一步的研究来验证我们的发现,并了解VTDB亚型如何调节LAM和其他疾病中的肺损伤。
补充材料
致谢
我们感谢促进全国内心,肺和血液研究所林中登记处的调查人员,并向林林的妇女做出贡献的林。本研究使用了莱斯特大学(英国莱斯特莱斯特)的爱丽丝高性能计算设施。L.V.Wain在呼吸研究中持有GSK /英国肺基金会椅。M.D.托宾持有惠康信托调查员奖(WT 202849 / Z / 16 / Z)。该研究已经在申请648下使用英国Bioband资源进行。
脚注
本文提供了补充材料www.qdcxjkg.com
作者贡献:S.R.约翰逊构思和设计了这项研究。S. Miller,S.R.Johnson,J. Johnson,N.Gupta和F.X.麦考克收集了临床信息和样品。S. Miller,S.R.约翰逊,C. Coveney,A-E。Farmaki,M.D. Tobin,L.v.Wain和D.J.Boocock分析并解释了数据。 S. Miller and S.R. Johnson wrote the manuscript. All authors critically reviewed and approved the final manuscript.
利益冲突:米勒没有什么可透露的。
利益冲突:C.柯文尼没有什么可披露的。
利益冲突:J. Johnson没有什么可披露的。
利益冲突:A-E。法玛基没有什么可透露的。
利益冲突:N.Gupta没有披露。
利益冲突:M.D.Tobin报告了GSK和辉瑞公司在提交工作之外提供的资助。
利益冲突:韦恩报告了葛兰素史克和辉瑞的拨款,在提交的工作之外。
利益冲突:F.X.McCormack报道了劳动力卫生师,非金融支持(数据和安全监测委员会)的非金融支持(咨询),为达菲 - ·阿文尼斯州的Sanofi-Aventis,以及来自Boehringer Ingelheim的讲话,咨询和接受旅行支持的个人费用国际,F. Hoffmann-La Roche和Novartis,以及来自Gilead Sciences的裁决委员会,在提交的工作之外的裁决委员会;此外,F.x.麦考克在发布的专利“VEGF-D中的使用”(淋巴管毒瘤病的诊断)发布(带有辛辛那提大学支付的版税)和F.X.McCormack的配偶在桑菲 - 阿维斯州拥有股票,股票期权和其他所有权兴趣。
利益冲突:D.J. Boocock没什么可透露的。
利益冲突:S.R.约翰逊在研究期间报告了NIHR和LAM基金会的赠款。
支持声明:本研究由美国国立卫生研究院罕见病转化研究合作中心、LAM基金会生物标志物创新基金和LAM基金会项目基金资助。资助方在研究设计、分析、解释、手稿撰写或提交决定中没有作用。作者写这篇文章并没有得到报酬。S. Miller和S. r . Johnson参与了研究开发和交付的所有阶段,完全访问了研究中的所有数据,并对提交论文的决定负有最终责任。本文介绍了部分由英国国家健康研究所(NIHR)资助的独立研究。本文所表达的观点仅是作者本人的观点,并不一定是英国国家医疗服务体系或国家卫生健康研究院的观点。本文的资金信息已存入交叉参考基金登记处.
- 已收到2018年5月21日。
- 接受2018年7月29日。
- 版权©2018人队。
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