抽象
淋巴管平滑肌瘤病(LAM)是一种罕见的女性疾病。肺功能下降是可变的,使适当的靶向治疗困难。我们使用无偏倚血清蛋白质组学来鉴定与LAM预后相关的标志物。
101名女性LAM和22个健康对照来自国家中心被招募为英国LAM。152个与链接肺功能和结果数据DNA和血清样品从病人在国家心脏,肺和血液研究所LAM注册表在美国获得。已于50 LAM和使用SCIEX SWATH质谱工作流20个控制血清样品的发现群进行蛋白质组分析。蛋白质水平通过ELISA和单核苷酸多态性定量GC(组特异性成分)编码维生素D结合蛋白(VTDB)进行基因分型。
蛋白质组学分析显示,LAM的VTDB比对照组低2.6倍。进展期血清VTDB较稳定LAM低(p=0.001),且与肺一氧化碳扩散能力相关(p=0.01)。患者死亡或肺移植的平均时间减少了46个月CCrs7041/4588不含a的单倍型的基因型分别为rs4588和38个月(p=0.014和0.008)。
所述VTDB轴线与疾病严重程度和结果,以及相关联的GC基因型可以预测LAM的无移植存活。
抽象
维生素D结合蛋白和GC基因型与LAM患者的肺功能和生存相关http://ow.ly/UacI30leLzr
介绍
淋巴管肌瘤病(LAM)是一种罕见的多系统疾病,其特征在于肺囊肿和淋巴异常。这种疾病几乎完全限于女性,其中它影响九个百万分之一,并且可以偶尔在那些与结节性硬化症(TSC)都会出现[1,2]。在LAM患者中,囊肿逐渐取代肺实质,导致复发性气胸,并经常在数年内出现呼吸衰竭[3]。淋巴管阻塞导致chyloptysis,乳糜积液及腹水。周围的散发性LAM一半,而且大部分都TSC-LAM也有血管平滑肌脂肪瘤,良性瘤,肾脏一般发生[2]。肺和患者淋巴管是由LAM细胞浸润:与血管周上皮细胞肿瘤的组合平滑肌和黑素细胞的表型特性[克隆,转移性细胞4]。LAM细胞具有双等位基因突变,TSC [五],其导致雷帕霉素(mTOR的),两个多蛋白复合物的成分,控制增殖,迁移,吞噬和代谢[量的机械目标的超活化6]。
大多数患有LAM的女性在1秒内肺功能加速丧失,用力呼气量增加(FEV)1) declining by 70–140 mL per year [7,8]。然而,一些迅速发展,而其他人可以连续多年保持稳定[3,9]。治疗在大多数肺功能的mTOR抑制剂防止损失与渐进性疾病[8-10]。在用温和的肺功能损伤的个体识别进行性疾病是非常重要的,尽管通常需要在长时间内多次测量[7]。因此,疾病活动的标记都需要预测那些肺功能损失风险,使治疗这种情况发生之前。此外,患者分层与活动性疾病可以减少相位的大小,持续时间,成本和可行性的新疗法II期临床研究。
许多临床和血清预后因素已经确定。升高的血清血管内皮生长因子(VEGF)-D与两者相关联的LAM的存在[11以及肺功能的迅速丧失。出现呼吸困难而不是气胸和对支气管扩张剂的反应与更糟的结果有关[12-14],而绝经后的状态与肺较慢功能丧失相关联7,15]。尽管如此,在个体中准确预测预后是不可能的。在这里,我们使用血清蛋白质组学来鉴定与LAM的存在和严重程度相关的蛋白质,并确定了维生素D结合蛋白(VTDB)及其基因的变化,GC(组特异性成分)与疾病严重程度和LAM生存期相关。
材料和方法
患者和样本收集
2011年至2016年,101名患有LAM的女性和22名健康对照女性从英国诺丁汉国家LAM中心(图1)。从东米德兰研究伦理委员会(13 / EM / 0264)获得伦理批准。所有受试者签署知情同意书。152名妇女与LAM第二队列在国家心脏,肺和血液研究所(NHLBI)LAM注册(美国)1998年和2001年间招募用于复制,并研究长期生存[16(图1)。对于所有受试者获得了基线胸腹计算机断层摄影,串行肺功能,血清,DNA和在募集。对于两个队列临床评估,肺功能和样品分析中被描述补充材料。由于后续的持续时间,全因死亡或需要进行肺移植是仅适用于NHLBI LAM注册队列,并通过查询美国国家死亡指数(获得www.cdc.gov nchs / ndi /你)和美国器官共享网络数据库(https://unos.org/data)。由于对使用雷帕霉素的数据在这个年龄组不可用,结果数据截至2010年封笔雷帕霉素广泛用于在美国治疗LAM的。
蛋白质组学
70个血清样品(50 LAM和20个控制)进行了分析上的SCIEX(沃灵顿,UK)的TripleTOF 6600质谱仪连字符连接到使用SCIEX SWATH质谱工作流[一个Eksigent nanoLC 425系统17]。串联质谱(MS / MS)谱使用ProteinPilot版本5.0(SCIEX)与SWISS-PROT数据库的人共搜索(www.uniprot.org;2015年1月)以1%的错误发现率,识别重点是生物修饰。SWATH数据在PeakView (SCIEX)中与库文件对齐,使用SCIEX OneOmics平台进行上传和处理[18]。全部细节在给定的补充材料。
血清蛋白量化
血清VTDB,α1- 酸糖蛋白1(A1AG1)和VEGF-d是在使用的Quantikine ELISA英国队列确定试剂盒DVDBP0,DAGP00和DVED00,分别为(R&d系统,阿宾登,UK)。VTDB在NHLBI LAM注册表使用测量的Quantikine ELISA试剂盒DVDBP0B(R&d系统)。
基因分型
使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Promega, Southampton, UK)从全血中提取DNA。如GC不同基因型的不同人群之间,遗传分析仅限于那些欧洲血统的。65UK LAM samples and 168 141 unrelated control women of European ancestry from the UK Biobank (www.ukbiobank.ac.uk)使用Axiom UK Biobank array (Affymetrix, High Wycombe, UK)进行基因分型。祖先是由ķ-means从全基因组的单核苷酸多态性的前两个主成分的聚类(SNP)数据[19]。使用KASP PCR基因分型(LGC基因组学)对来自NHLBI LAM注册队列的妇女进行基因分型。Hoddesdon,英国),通过问卷调查获得的祖先。
统计分析
Proteins identified by proteomics were considered differentially expressed if they were ≤ −2 or ≥2 log2根据L描述,以≥0.7的置信度折出组间差异ambert等。[18]。韦尔奇氏t检验或曼 - 惠特尼U检验被用于分类数据;线性回归和Spearman相关被用于连续数据。GC等位基因用卡方检验[比较频率为女性LAM和英国生物银行的控制20.]。生存分析均采用Kaplan-Meier曲线由曼特尔 - 考克斯日志秩检验分析差异进行。使用Prism第7版(的GraphPad,拉霍亚,CA,USA)及SPSS版本24(IBM,纽约Armonk,NY,USA)进行分析。
结果
发现群和血清蛋白质组学
第50名英国妇女LAM录取谁不与mTOR抑制剂治疗,20名例健康对照组妇女形成发现群。队列分为基于FEV回顾展损失更进步和病情稳定1>50 mL /年,平均±asd观察时间11±4年。进展性疾病患者FEV较低1,扩散肺容量为一氧化碳(dLCO)和较高的血清VEGF-D值,但年龄和病程与疾病稳定者相似(表1)。
在70份血清样本中,MS鉴定出126种蛋白质,包括血清蛋白白蛋白、血凝素、酸性糖蛋白、免疫球蛋白、补体成分、凝血因子、蛋白酶和蛋白酶抑制剂(补充表E1)。VTDB水平分别为2.6倍低的LAM比健康对照组妇女(0.65信心)(补充表E2)。为了确定严重程度的标记,我们比较了那些病情稳定和进展的患者的蛋白质组学特征。A1AG1水平在进展期患者中比稳定期患者高3.6倍(置信度0.70)。绝经前和绝经后的LAM妇女的比较没有在预先指定的置信水平上识别差异表达的蛋白。
血清蛋白量化
使用用于VTDB和A1AG1的ELISA MS发现进行了验证。与蛋白质组的研究结果一致,血清VTDB(分别为p = 0.007和p = 0.002)明显降低在50名妇女在英国发现群LAM和27名女性,在英国复制队列LAM比对照。For the 77 women in the UK discovery (n=50) and replication cohorts (n=27) combined, VTDB was 273±96 µg·mL-1in LAM and 347±92 µg·mL-1在控制妇女(P = 0.002)(图2a)。当通过ELISA评估,A1AG1在女性高于在发现和复制队列比对照妇女(P = 0.04和p = 0.0001,分别地)LAM。一个1一个G1was 910±478 µg·mL-1为所有女性LAM和619±270µg·毫升-1对照组女性(p=0.004) (图2b)。
VTDB与疾病严重程度相关
VTDB was significantly lower in those with more progressive compared with more stable lung disease at recruitment (progressive 221±89 µg·mL-1与stable 299±90 µg·mL-1;P = 0.001)(图3a)。VTDB水平与占预计相关dLCO(p=0.01)但不强迫肺活量(p=0.09)或FEV1(P = 0.23)(图3b- d)。A1AG1较高的稳定与进步的疾病(稳定1004±525µg·毫升-1与progressive 753±341 µg·mL-1;p = 0.01) (补充图E1),但与肺功能无关。VTDB水平与年龄、诊断年龄、绝经状态、症状性质、是否存在结节性硬化症、血管平滑肌脂肪瘤、淋巴管疾病或血清VEGF-D水平无关(数据未显示)。VTDB的分布类似于77年的治疗妇女和24名妇女接受治疗与雷帕霉素LAM而A1AG1更高rapamycin-treated组(治疗1132±474µg·毫升-1与未经处理的910±478µg·毫升-1;p = 0.031) (补充图E2)。
协会GCLAM基因型和血清VTDB
如GC基因型根据祖先的不同而不同,遗传分析仅限于英国的65个人和欧洲血统的145个人。两个单核苷酸多态性GC在rs7041和rs4588定义专业GC单倍型:1)GC1F其中rs7041(G)和rs4588(A),2)GC1S其中rs7041(T)和rs4588(A),和3)GC2其中rs7041 (G)和rs4588 (C)。这些SNPs在英国和NHLBI LAM注册组的等位基因频率与英国生物样本库的对照组女性或彼此(补充表E3)。在这两种LAM队列,如在一般人群中,血清VTDB依赖于GC基因型(补充图E3)[21]。
VTDB蛋白和基因型与预后的关系
From the UK cohort, 91 women with LAM had lung function measured over >1 year after enrolment (64 untreated and 27 receiving rapamycin for LAM). The mean period of observation was 19 months, corresponding to 144 patient-years of observation. Within the NHLBI LAM Registry cohort, 136 women with untreated LAM had lung function measured over >1 year after enrolment with a mean period of observation of 40 months, corresponding to 500 patient-years of observation. Serum VTDB was not associated with prospective change in lung function in either cohort (表2)。
内NHLBI LAM注册队列,那些低血清VTDB,在rs4588的AA基因型和TT在rs7041有FEV的损失率最高1和dLCO,虽然没有显著左右(表3)。然后,我们在NHLBI LAM注册队列中研究了VTDB轴与死亡或肺移植时间的关系。尽管死亡时间或移植时间与血清VTDB水平无相关性(p=0.76) (图4a)或rs7041基因型,有一个与rs4588基因型的关联。中号edian time to death or transplant for the AA or AC genotype at rs4588 was 150 months compared with 104 months for CC (p=0.014) (图4b)。A等位基因为rs4588的所有单倍型死亡或移植的中位时间(包括GC1F和GC1Shaplotypes) was 150 months compared with 112 months for haplotypes with no A allele present (includingGC2;P = 0.008)(图4c)。
讨论
我们首次发现VTDB轴与LAM患者的严重程度和预后相关。VTDB级别与dLCO和疾病活动评估。进展性疾病,以FEV丧失为特征1of >50 mL per year, tended to have lower levels of VTDB than those with more stable disease with a loss of FEV1of <50 mL per year, despite being matched for age and other clinical manifestations. Haplotypes ofGC与死亡时间或肺移植有关。因此,GC基因型是发现影响无移植存活LAM第一个基因宿主因子。
VTDB是通过肝脏,肾脏,脂肪组织和嗜中性粒细胞产生的糖基化的α球蛋白。由编码GC染色体4q的基因,外显子11两个SNP,即rs7041(Glu416Asp)和rs4588(Thr420Lys),定义VTDB的三个主要单倍型:GC1F(416Asp / 420Thr),GC1S(416 glu / 420赖氨酸)GC2(416Asp / 420Lys),与涉及这些SNP [血清VTDB水平21]。VTDB结合25(OH) - 维生素d和1,25(OH)2- 维生素d,虽然维生素d水平远由VTDB的运输能力超出。VTDB和维生素d的血清水平是不相关的许多疾病的研究,包括慢性阻塞性肺疾病(COPD)[22]。的GC变异对维生素D有不同的亲和力;VTDB亚型、维生素D及其对肺部疾病的影响的复杂性尚不清楚[23]。
有关该机制GC基因型和血清VTDB也不清楚。rs7041和rs4588是内含子snp;既不与已知的启动子或增强子SNPs发生连锁不平衡,也不影响蛋白质的稳定性。其他因素比GC基因型,包括表观遗传学,也可能影响血清VTDB水平,尽管LAM患者血清VTDB低于对照组,GC基因型在我们的研究并没有不同。
我们的研究结果反映了VTDB轴和林都的复杂性。我们观察到,降低血清VTDB用在呈现较低的肺功能和更积极的肺部疾病相关联。如VTDB不与LAM表型其它方面,包括错构瘤或淋巴疾病的存在相关联,则很可能的是,VTDB轴线是不相关的LAM本身的,但如在其他肺部疾病可改变组织响应的疾病。重要的,GC基因型与死亡时间或肺移植相关。最强烈的影响是GC1F和GC1S单倍型,与>3年的中位生存增加相关。有趣的是,这些和其他的GC变种改善生存率并没有那些具有最低血清VTDB水平相关。VTDB是一种多功能蛋白,它可以在以多种方式响应于肺损伤的影响。GC1F和GC1S与增加的巨噬细胞活化相关的过GC2[22],和增加的巨噬细胞活化可以是在LAM保护,无论是通过增强保护性嗜中性白细胞反应或增强的补体的C5a衍生[的趋化作用24,25]。VTDB还充当肌动蛋白的清除,因此具有通过不同的机制,包括改变的先天免疫和组织修复至影响疾病的潜力。不同GC单倍型已经与易感性相关肺部疾病,GC1F正在与COPD的在增强的风险GC1S和GC2[26]。
这些观察强调了VTDB的多种潜在功能,以及这些功能可能与基因型的关系以及与肺部疾病的复杂关系。LAM是一种多系统疾病,其复杂性可能也很重要。例如,VTDB蛋白与dLCO但不FEV1,用力肺活量或无事件生存率。虽然FEV1一般用于研究LAM的自然史,dLCOFEV之前通常受损1并且可以更好地反映在LAM初实质损害,与FEV的损失1后因失去弹性反冲和实质损伤导致的气道过早关闭而发生。肺血管疾病、宿主防御、周围肌肉功能和其他可能受VTDB功能影响的过程也可能有助于生存。
我们的研究的优势之一是使用了一种无偏的蛋白质组学方法,将VTDB确定为LAM感兴趣的蛋白。维生素D轴参与其他与组织重塑有关的疾病,使我们的发现在生物学上是可信的[27]。然而,我们的研究也有其局限性,包括低数量的对照样品,技术的限制,并在研究罕见疾病的内在。首先,VTDB只有两种蛋白质女性LAM和使用没有确定其他LAM标记,如VEGF-d蛋白质组学方法的血清中差异表达的一个。VEGF-d在皮摩尔水平表达[28],而VTDB存在于微摩尔水平,这表明用LAM和健康对照妇女之间鲁棒的差异仅相对丰富的血清蛋白可以使用该蛋白质组策略来检测。因此,很可能是其他潜在有用的生物标记仍未被发现。与此相一致,A1AG1,也称为血清类粘蛋白,挂LAM在我们蛋白质组屏幕中存在的其它蛋白质,另一个是相对丰富的血浆α球蛋白,包括血浆蛋白的1-3%。作为A1AG1是一种急性相蛋白,已被认为在许多种群总体生存的生物标志物,我们没有深入研究它[29]。由于LAM非常罕见,因此对该病的研究依赖于较长时间积累的群体。虽然两组研究对象都使用协议驱动的评估来获取关键数据,包括肺功能,但这些组的可用数据存在一些差异。虽然两组患者在年龄和肺功能方面相似,但肺功能的预期变化不同,这可能是由于在英国队列中使用雷帕霉素减少了FEV的损失1。相反,由于招募时间的关系,在使用雷帕霉素之前的长期生存现在只能在NHLBI LAM注册队列中进行研究。目前的进展性疾病患者,包括在英国队列研究的患者,往往使用雷帕霉素进行治疗[10]和研究VTDB蛋白的作用或基因型在女性LAM雷帕霉素处理的生存需要观察更长的时间。
总之,VTDB的低水平在LAM与肺功能差和相关GC基因型与长期预后相关。我们的研究结果表明,VTDB轴是一种可能保护LAM肺损伤的宿主因子,可能具有预后意义。我们需要进一步的研究来验证我们的发现,并了解VTDB亚型如何调节LAM和其他疾病的肺损伤。
补充材料
确认
我们感谢谁给国家心脏,肺和血液研究所LAM注册表,以谁的研究做出贡献的妇女LAM贡献了调查。本研究采用的驴友高性能计算设施在莱斯特大学(莱斯特,英国)。L.V.北斗星拥有GSK /英国肺脏基金会主席在呼吸研究。M.D.托宾持有Wellcome基金会研究者奖(WT 202849 / Z / 16 / Z)。这项研究已根据应用程序使用648英国生物库资源进行。
脚注
这篇文章有提供补充材料www.qdcxjkg.com
作者贡献:S.R.约翰逊构思和设计了这项研究。s·米勒、s·r·约翰逊、j·约翰逊、n·古普塔和f.x·麦考马克收集了临床信息和样本。S.米勒,S. r .约翰逊,C.柯文尼,A-E。Farmaki, M.D. Tobin, L.V. Wain和D.J. Boocock对数据进行了分析和解释。米勒和约翰逊撰写了手稿。所有作者都对最终手稿进行了严格的审查和批准。
利益冲突:S.米勒没有透露。
利益冲突:C. Coveney有没有透露。
利益冲突:J。约翰逊没有透露。
利益冲突:A-E。Farmaki有没有透露。
利益冲突:N.古普塔没有什么要披露的。
利益冲突:医学博士托宾报告葛兰素史克和辉瑞的资助,在提交的工作之外。
利益冲突:L.V.北斗星报告补助从葛兰素史克和辉瑞提交的工作之外。
利益冲突:F.X.麦科马克非金融支持林疗法(咨询公司)报道,非金融支持(数据和安全监测委员会)武田和Promedior非金融支持赛诺菲-安万特(说)我们,和个人费用来说,咨询公司和接收旅行勃林格殷格翰集团国际的支持,罗氏公司和诺华,从基列科学和酬金的审判委员会,在提交工作;此外,f.x McCormack拥有“使用VEGF-D诊断淋巴瘤”的专利(专利使用费支付给辛辛那提大学),并且f.x McCormack的配偶拥有美国赛诺菲-安万特公司的股票、股票期权和其他所有权权益。
利益冲突:D.J.Boocock有没有透露。
利益冲突:S.R.约翰逊在研究进行期间报告从NIHR和LAM基金会资助。
支持声明:这项研究是由美国国家卫生研究院罕见疾病转化医学研究协作,一个LAM基金会生物标记创新格兰特和一个LAM基金会的项目资助。该资助者在研究设计,分析,解释,稿件写作或决定提交任何作用。笔者尚未支付写这篇文章。S. Miller和S.R.约翰逊参与研究开发和交付的各个阶段,必须全面进入研究中的所有数据,并有该决定提交出版负最终责任。本文介绍部分由英国国家健康研究所(NIHR)资助的独立研究。表达的观点是作者的个人看法,并不一定代表NHS或NIHR的。本文资金的信息已交存Crossref资助者注册表。
- 收到2018年5月21日。
- 公认2018年7月29日。
- 版权©2018人队。
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