可交叉反应的抗体尘埃mite-derived烯醇酶诱导中性气道炎症
- 简历林1,2,5,
- 娜娜黄1,5,
- 李经2,5,
- 小雨刘1,5,
- 清熊3,
- Chengshen胡1,
- 夫陈1,
- Lvxin关1,
- 可馨常1,
- 丹•李1,
- Stephen Kwok-Wing徐3,
- 南山钟2,6,
- 中国刘1,6和
- Ping-Chang杨1,4,6
- 1的呼吸疾病国家重点实验室过敏深圳大学,深圳大学医学院,深圳,中国
- 2呼吸疾病国家重点实验室、国家临床呼吸道疾病中心、广州呼吸疾病研究所第一附属医院、广州医科大学,广州,中国
- 3生物医学科学学院,香港中文大学,香港,中国
- 4广东省重点实验室区域免疫和疾病,深圳,中国
- 5这些作者的贡献同样这项工作
- 6南山中,中国和杨Ping-Chang同样本文主要作者和监督工作
- Ping-Chang杨房间a7 - 509, Lihu校园,深圳大学医学院的。1066学苑大街,518055年深圳,中国。电子邮件:pcy2356在}{szu.edu.cn
文摘
背景和目的中性粒细胞炎症是一些特定的哮喘表型的一个标志;其病因学尚未完全了解。屋尘螨(HDM)是最常见的气道炎症的发病机制的因素。本研究旨在阐明cross-antibodies反对HDM-derived因素的作用在中性气道炎症的发生发展。
方法收集血液样本从哮喘慢性中性粒细胞哮喘患者分析HDM-specific可交叉反应的抗体。抗体的作用对HDM-derived烯醇酶(EnoAb)损伤气道上皮屏障功能和诱导的气道炎症细胞培养中评估模型和动物模型。
结果高烯醇酶基因序列的相似性(72%)被发现HDM和人类之间的关系。慢性中性粒细胞哮喘患者血清EnoAb检测。EnoAb绑定到气道上皮细胞和烯醇酶形成复合物,激活补体,气道上皮屏障功能受损和诱导中性气道炎症组织。
结论HDM-derived烯醇酶可以诱导特定cross-antibodies人类,诱导中性气道炎症的发生。
文摘
屋尘螨(HDM)派生的烯醇酶诱发体内cross-antibodies,既承认HDM-derived烯醇酶和烯醇酶在气道上皮细胞,激活补体和诱导中性气道炎症组织https://bit.ly/2XKSCgy
介绍
气道慢性炎症通常特点是深刻的气道粘膜的炎性细胞浸润(1]。结果在狭窄的气道炎症活动校准和病人感到呼吸困难2]。慢性气道炎症的致病因素是不同的。过敏反应是一个主要原因,屋尘螨(HDM)派生的过敏原是规范因素在气道黏膜过敏反应的发病机制(3]。尽管研究气道过敏性炎症迅速在过去的几十年,先进的启动因素气道慢性炎症和底层机制仍有待进一步研究4]。气道炎症的治疗效果不满意地理解5]。因此,有必要进一步研究机制,创造新颖和有效的治疗慢性气道炎症。
气道上皮细胞是一种身体和外部环境之间的接口。某些过敏原,如那些来自HDM,可以被上皮细胞吸收。虽然是上皮细胞的酶系统,可以降低吸收蛋白质抗原成小肽或氨基酸,一些与主管抗原性多肽可能运送到了牙龈地区接触抗原的免疫细胞,启动免疫反应6]。从而产生的免疫细胞抗原免疫球蛋白E或/和抗原免疫球蛋白(Ig)。IgE的高亲和性肥大细胞受体结合,使感光。再次接触特定抗原激活敏感肥大细胞。肥大细胞释放化学介质引起过敏反应(7]。特定的免疫球蛋白可以绑定特定抗原形成复合物。复合物可能被吞噬细胞清除,或激活补体系统chemoattract中性粒细胞和诱发炎症在当地组织(8,9]。然而,这类配合物是否与气道慢性炎症的发病机制尚未定义。
承认,一些外在的蛋白质的基因序列,如空气中的过敏原可能一样一些蛋白质在人体内的。进入人体后,免疫系统可能产生外在蛋白抗体(10]。除了识别特定的外在蛋白质,抗体也可以识别蛋白质在人体内与外在蛋白基因序列相似(11]。这些抗体是指定“cross-antibodies”。同源抗体大;例如,针对streptococcal-vimentin诱发心脏微血管内皮炎性表型在风湿性心脏病(12]。cross-antibodies可能与特定的本构同源抗原形成复合物。复合物激活补体系统,chemoattract炎症细胞和炎症诱导在当地组织(13]。先前的研究表明,enolase-specific抗体与粘膜炎症的发病机制有关,如。炎症性肠病(14]。烯醇酶是参与糖酵解和金属酶存在于所有组织和所有生物(15]。我们先前的研究发现,HDM-derived烯醇酶基因对人类烯醇酶[有很高的相似性16]。烯醇酶是否cross-antibodies参与气道慢性炎症的发病机制还有待进一步研究。
中性粒细胞哮喘是哮喘的亚型,其中许多中性粒细胞聚集在肺组织以及出现在气道径(17]。这些中性粒细胞释放炎症介质诱导炎症在当地组织(17]。中性粒细胞哮喘的致病因素在很大程度上仍未知,需要进一步调查。作为免疫球蛋白autoantibody-induced细胞毒性对气道上皮细胞在nonallergic哮喘的发病机制中发挥作用(18),嗜中性往往伴随着IgG-mediated免疫炎症(19)和HDM是最常见的因素参与人类气道慢性炎症的发病机制(3),我们假设HDM-derived因素可能与中性气道炎症的发病机制通过诱导IgG-mediated免疫反应。因此,在这项研究中,血清HDM-specific中性粒细胞哮喘患者免疫球蛋白水平评估,抗体对HDM烯醇酶的角色(EnoAb)生成和EnoAb诱导的气道中性粒细胞炎症了。
材料和方法
人体的血液样本的集合
中性粒细胞哮喘和嗜酸性哮喘患者招募到本研究的Respirology,广州医科大学第一附属医院(广州)。中性粒细胞哮喘的诊断和嗜酸性哮喘称为文献[20.),中性粒细胞哮喘患者嗜酸性粒细胞< 3%,> 75%痰中性粒细胞,嗜酸性哮喘病人痰中嗜酸性粒细胞≥3%。哮喘的诊断和管理是由医生后我们的常规程序。有下列条件的患者被排除在外:癌症,其他自身免疫性疾病、过敏性疾病、严重的器官疾病或免疫抑制治疗以下的任何理由。健康的对照组招募。收集血液样本从每个人类主体通过尺骨静脉穿刺。血清被离心分离血液样本在4°C和存储−80°C到使用。提出了人类受试者的人口数据表1。
反Dermatophagoides farinaeEnoAb承认气道上皮细胞
16 hbe细胞(人工气道上皮细胞株)与1%的多聚甲醛固定1 h,暴露于反Dermatophagoides farinae(Der f) EnoAb或同形像的埃普多夫管1中免疫球蛋白g h在室温下。与PBS三次洗涤后,细胞暴露于第二抗体(与异硫氰酸荧光素标记)30分钟洗和PBS三次。细胞被涂抹上滑下来,带盖安装并使用共焦显微镜观察。
统计数据
数据进行正态分布使用Kolmogorov-Smirnov测试测试。两组之间的差异是由t检验或秩和检验。方差分析Dunnett紧随其后的测试或Bonferroni测试进行多重比较。斯皮尔曼相关进行分析显示两组数据之间的相关性。p < 0.05被设置为一个重要的标准。提出了一些实验过程补充材料。
结果
血清HDM-specific免疫球蛋白与中性粒细胞数量的痰中性粒细胞哮喘患者
确定HDM-derived因素之间的关联和中性粒细胞哮喘的发病机理,我们收集外周血样本和中性粒细胞哮喘患者的痰液样本,嗜酸性哮喘患者和健康对照组。HDM-specific血清免疫球蛋白水平(在收藏界,简而言之),包括总在收藏界,sIgG1, sIgG2和sIgG3哮喘组高于健康对照组(图1模拟)。中性粒细胞哮喘组的血清HDM锗硅水平仅略高于健康对照组(图1 e)。此外,更enolase-specific免疫球蛋白可检测的血清中性粒细胞组比健康对照组或嗜酸性粒细胞集团(图1 f)。频率的痰中性粒细胞哮喘组也高于在健康对照组(表1)。之间的正相关关系被痰中性粒细胞频率和血清sIgG水平(包括总sIgG, sIgG1 sIgG2和sIgG3)中性粒细胞哮喘病人,而不是嗜酸性哮喘患者(图1 g-j)。锗硅水平和血清之间没有明显的相关性被发现痰中性粒细胞频率(图1 k)。此外,我们发现痰嗜酸性粒细胞频率之间有或没有显示关联血清免疫球蛋白(补充图S1a-d)。之间的正相关关系被确认血清IgE和痰嗜酸性粒细胞频率(图S1e)。enolase-specific IgE在血清中检测到,但组间无显著性差异(图S1f)。血清HDM-specific IgG4水平高嗜酸性粒细胞组和嗜中性粒细胞组与健康对照组相比(图S1g),它没有相关性与痰嗜酸性粒细胞计数或中性粒细胞计数(图S1h和我)。结果表明,中性粒细胞哮喘患者血清中HDM sIgG3积极与痰中性频率的频率。
对HDM-derived cross-antibody烯醇酶识别蛋白质的气道上皮细胞
我们下了进一步洞察HDM-derived因素的作用在中性粒细胞哮喘的发病机制。通过全基因组筛选,我们确定16 HDM在先前的研究中376个基因(16],2.42 - -8.25% Der f基因相同的基因序列的人类基因从50%变化到100% (补充图S2)。通过比较Der f和人类之间的烯醇酶基因序列,我们发现有72%烯醇酶基因序列的身份(计数蓝军)之间Der f和人类之间或71% Der f和鼠标(补充图S3)。烯醇酶基因序列的相似性之间Der f和人/鼠标促使我们搜索的概率cross-antibodies人类免疫系统产生的最初反对Der f-derived烯醇酶可能攻击同源烯醇酶蛋白在人类气道组织。通过下拉与蛋白质提取方法从16 hbe细胞作为鱼饵,相关蛋白质沉淀和质谱(MS)分析。结果表明,女士89蛋白质(包括烯醇酶)被抓获的血清免疫球蛋白孤立的哮喘病人敏感螨(补充图S4)。先前的报道还表明烯醇酶参与严重哮喘的发病机制21]。16来细胞衍生烯醇酶可以被anti-Der f抗体;这被竞争ELISA, Der f烯醇酶抗体之间的绑定和人类干扰烯醇酶反之亦然(补充图S5)。血清enolase-specific免疫球蛋白在嗜酸性粒细胞嗜中性粒细胞组高于集团(图1 f)。然后,我们评估了烯醇酶在气道上皮细胞的表达。我们发现烯醇酶的表达在人类和小鼠气道上皮细胞(补充图S6)。多克隆抗体Der f-derived烯醇酶生成并被指定为EnoAb。EnoAb可能特别结合重组烯醇酶(补充图S5)。
EnoAb激活补体系统在气道上皮细胞
补充可以由几个细胞,包括上皮细胞(22]。抗原抗体反应可以激活补体系统(13]。我们测试了EnoAb与烯醇酶相互作用的影响在气道上皮细胞激活的补充。天真的BALB / c小鼠治疗鼻滴包含EnoAb每日3天。支气管肺泡灌洗液(BALF)收集;补充水平BALF被ELISA分析。结果表明,C3a的水平,C5a和C5b-9明显高于样本老鼠收到EnoAb比那些收到盐水或同形像免疫球蛋白(图3 a - c)。免疫组织化学结果验证的数据,在C3a的阳性染色,C5a和C5b-9在气道上皮细胞局部肺组织(图3 d)。数据表明,EnoAb可以形成与烯醇酶复合物,然后激活补体在气道上皮细胞。结果验证了与人类样本。我们收集了嗜酸性哮喘患者的血液样本,中性粒细胞哮喘。等离子体是孤立和孵化与反EnoAb或同形像免疫球蛋白。结果表明,接触EnoAb C3a的水平明显增加,C5a和C5b-9在中性粒细胞哮喘的等离子体样品,但不是在嗜酸性哮喘样本(图3 e- g)。自补充能促进炎症激活(23),数据表明,EnoAb可能诱发或加剧气道炎症的发生。
EnoAb诱发补体依赖气道上皮细胞凋亡
中给出的数据图2和3暗示EnoAb可能损伤气道上皮细胞。测试推理,16 hbe细胞暴露于EnoAb文化在人类血清的存在(含补充;补充图S7),6 h。这些细胞被收获,使用流式细胞仪分析。结果表明,接触EnoAb略诱导16 hbe细胞凋亡;补充的存在显著增强的凋亡细胞的数量,由heat-quenching废除补充血清。接触EnoAb和重组C3a也诱导细胞凋亡(图4 a和b)。自死细胞中没有检测到对照组(图4 a和b),细胞凋亡被认为是致病因素诱导细胞死亡。老鼠接受EnoAb鼻滴每天6天。气道组织被TUNEL加工(末端转移酶的dUTP尼克结束标签)。结果表明,接触EnoAb诱导气道上皮细胞凋亡(图4 c)。结果表明,接触EnoAb可以诱导气道上皮细胞凋亡,可增强的补充。
接触EnoAb损害呼吸道上皮屏障的完整性
测试的影响EnoAb气道上皮屏障的完整性,16 hbe层准备和暴露于EnoAb或/和complement-containing血清文化。transepithelial电阻(te)和渗透率大分子示踪剂进行了评估和作为指标的上皮屏障的完整性。结果表明,接触EnoAb和complement-containing血清明显受损上皮单层完整展现三通(减少图5一个)。结果证实使用钙开关技术(图5 b)。此外,我们发现,接触EnoAb和complement-containing血清显著增加16 hbe上皮单层屏障通透性(图5 c)。值得注意的是加热的存在血清(赞美淬火)明显降低EnoAb削弱上皮屏障功能的影响(图5 a - c)。后鼻滴(包含EnoAb)治疗小鼠每日6天,小鼠气道上皮屏障通透性明显受损,这可能被淬火补充与眼镜蛇毒因子(CVF) (图5 d)。阐明是否接触EnoAb /补充修改的状态在气道上皮细胞紧密连接蛋白,16 hbe层收集后接触EnoAb /血清在一夜之间,用逆转录酶定量聚合酶链反应和免疫印迹分析。结果表明,接触EnoAb /补充水平没有明显改变ZO-1 16 hbe细胞(补充图S8)。结果表明,EnoAb一起补可以诱导气道上皮细胞凋亡妥协上皮屏障的完整性。
接触EnoAb诱发中性气道炎症的发生
阐明如果EnoAb可以诱导气道炎症,天真的老鼠接受滴鼻液包含EnoAb或盐水为6天。除了诱导EnoAb /烯醇酶复合物气道上皮细胞表面,影响上皮屏障完整性和激活补体系统的报道图2- - - - - -5,深刻观察肺组织炎性细胞浸润(图6);观察过敏性小鼠(图6 b);髓过氧化物酶的水平,矩阵metallopeptidase-9和总蛋白BALF EnoAb组明显高于生理盐水组(图6 c- e)和高频率的中性粒细胞,但不是嗜酸性粒细胞,BALF中发现(图6外:我)以及肺组织(补充图S9)。预处理与CVF解渴补充废除了EnoAb-induced肺部炎症(图6;补充图S9)。结果表明,EnoAb可以诱导中性气道炎症的发生。
讨论
目前的数据揭示小说现象cross-antibody, EnoAb, HDM-derived烯醇酶可以发起中性气道炎症的发生。因为HDM是最常见的过敏原参与气道过敏性疾病的发病机制,我们研究了感应的EnoAb气道炎症的作用。大多数以前的研究关于HDM-induced气道炎症关注IgE的角色和HDM过敏原过敏哮喘的发病机制;目前的数据确定HDM的另一个方面:EnoAb, IgG抗体,也参与气道炎症的感应。与之前的研究一致,我们还发现嗜酸性粒细胞浸润EnoAb引起的气道炎症,而本研究的最明显的发现是中性粒细胞哮喘与血清HDM sIgG水平呈正相关(p < 0.01),虽然相关系数很低(0.3∼-0.4)。中性粒细胞炎症气道组织中复制的小鼠暴露小鼠EnoAb,诱导的cross-antibody HDM-derived烯醇酶。
数据显示一个引人注目的现象,∼50%的16 376螨虫基因类似于人类基因在不同的范围。这个特性表明,某些蛋白质由螨虫和人类共享的部分相似的分子结构。众所周知,蛋白质抗原分子有许多抗原表位;每个表位可能引起特定抗体的生成(24]。因此,可能人类免疫system-producing螨抗体抗原也会攻击人体组织。Mite-derived蛋白广泛分布在人类生活环境(25,很容易通过吸入进入人体。因此,mite-derived蛋白质经常接触人体气道组织,和气道过敏是最常见的过敏原(26]。除了HDM,有许多烯醇酶的来源;例如,白色念珠菌烯醇酶几乎相同的序列HDM身份和人类的烯醇酶,不出所料,守恒的地区非常相似(27];non-acarid来源,疥疮或食物被螨虫污染可能是烯醇酶的重要来源,与人体组织可能交叉作用。烯醇酶也存在于真菌,例如:主产(28]。Fungus-derived分子是重要的过敏原诱导哮喘(29日]。因此,来自不同来源的烯醇酶的作用在哮喘的发病机制值得进一步调查。
的角色HDM-related过敏反应在哮喘的发病机制已被广泛的研究。承认IgE,肥大细胞和嗜酸性粒细胞是中央效应器在哮喘的发病机制30.]。目前的数据显示,另一个重要因素,mite-specific免疫球蛋白,参与螨虫antigen-related呼吸道炎症的发病机制组织。其他人也发现哮喘患者螨抗原血清中免疫球蛋白(31日,32]。尽管一些亚型的免疫球蛋白,IgG1等有利于哮喘病人通过绑定IgG-inhibitory Fcγ-receptor (FcγRIIB)抑制C5a受体介导炎症33),目前的数据表明,螨虫抗原特异的免疫球蛋白,EnoAb,另一个功能方面,攻击的烯醇酶气道组织。EnoAb形式复杂与烯醇酶在气道上皮细胞。复杂的激活补充和提升者中性气道炎症的发生。数据还表明,血清HDM-specific IgG3水平更高的比eosinophil-type neutrophil-type哮喘患者的哮喘患者。免疫球蛋白亚型中,激活补体IgG3具有较强的影响,而IgG1主要作品在IgE生产和IgG4无法激活补体(34]。补体激活中性粒细胞炎症的致病因素之一[13];我们的数据是一致的,表明痰中性粒细胞计数与血清sIgG3呈正相关,而血清sIgG3之间没有相关性检测和痰液嗜酸性粒细胞计数自嗜酸性粒细胞更相关的ige过敏炎症(35]。
目前的数据表明,EnoAb诱导气道上皮屏障功能障碍。在哮喘的气道粘膜上皮屏障功能障碍已被认可。这是一个共识的解体上皮屏障气道炎症的发病机制中起着重要的作用(36]。我们早期的工作表明,功能失调的上皮屏障允许大分子物质,如外国蛋白质抗原,粘膜的渗透深度区域(6),获得的外国抗原的机会接触各种免疫细胞引起免疫反应(37]。已发现多种因素影响上皮屏障功能,如心理压力(38),空气污染39],过敏反应[40),等。目前的数据显示,一个小说因素,对mite-derived cross-antibody烯醇酶,可以诱导气道上皮屏障功能障碍。
通过直接下降EnoAb进入气道,我们诱导小鼠气道炎症,特点是深刻的中性粒细胞在肺组织的渗透。这种炎症是一样的中性粒细胞哮喘的表型17]。嗜中性粒细胞浸润,肺通常与哮喘的严重程度有关,如严重哮喘和corticosteroid-resistant哮喘(1]。这种类型的哮喘是常见的诊所(17),而其发病机理仍然是难以捉摸的。目前的数据提供机械的证据的解释这一现象。mite-derived分子、烯醇酶诱发cross-antibodies可能发起中性气道炎症的重要因素。
的数据可以回答Witebsky法则自身免疫性疾病的定义:致病抗体[转移的直接证据41]。把天真的包含EnoAb小鼠滴鼻液,中性粒细胞炎症诱导的肺。换句话说,mite-derived同源抗原,烯醇酶,能诱导自身免疫性疾病在肺部。正如前面所提到的,我们确定了16个376 Der f基因,∼50% Der f基因相同的基因序列的人类基因,从2%到100%不等。因此,除了烯醇酶,其他Der f基因是否与人类相同的序列与人类自身免疫性疾病的发病机理后cross-antibody概念需要进一步调查。所有外国抗原是否有相同的基因序列与自身免疫性疾病相关的人类基因在人类是一个有趣的研究课题,需要调查。
此外,我们发现高血清嗜酸性哮喘亚型患者IgE水平。IgE过敏是一个重要的中介。通过绑定的高亲和性受体,IgE可以使敏感肥大细胞。他们再次暴露在特定抗原由肥大细胞激活敏感触发哮喘发作。政府的ige抗体可以缓解哮喘发作或减弱慢性鼻窦炎鼻息肉和鼻过敏(42,43]。然而,并非所有的哮喘病人应对ige疗法(42]。我们的数据提供机械的证据。中性粒细胞哮喘病人的IgE水平明显下降。这些哮喘患者可能并不适合处理ige抗体。数据显示,治疗哮喘IgE抗体可能只是有效高的IgE滴定度(42]。
总的说来,目前的数据表明,Der f-derived烯醇酶相同的基因序列为人类的烯醇酶基因序列的72%,可诱发人体cross-antibody。过继转移cross-antibody(鼠标)产生可以诱导中性粒细胞炎症小鼠气道粘膜。我们得出这样的结论:Der f-derived烯醇酶可以诱导中性小鼠气道炎症的发生。
补充材料
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脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
作者贡献:j .林:黄,j .李x Liu Xiong, c, d, l .关k . Chang和李d进行实验和分析数据。S.K-W。徐提供生物信息学分析。j·李提供临床资料。pci。杨,刘z和n中组织和指导实验研究。pci。刘,z和j·林设计项目。pci。杨写的手稿。 All authors reviewed the manuscript.
利益冲突:j .林没有披露。
利益冲突:n .黄没有披露。
利益冲突:j .李没有披露。
利益冲突:x刘没有披露。
利益冲突:问:熊没有披露。
利益冲突:c .胡锦涛没有披露。
利益冲突:d·陈没有披露。
利益冲突:l .关没有披露。
利益冲突:k . Chang没有披露。
利益冲突:d·李没有披露。
利益冲突:S.K-W。徐没有披露。
利益冲突:n中没有披露。
利益冲突:z刘没有披露。
利益冲突:pci。杨没有披露。
支持声明:本研究支持由精密医学国家重点研发项目(No.2016YFC0905802 2016 yfc0903700),自然科学基金(31729002、31729002和31729002),广东省科技项目(No.2014B090901041 2016 a020216029),打开呼吸疾病国家重点实验室基金(No.SKLRD2016ZJ001),深圳市科学技术基础研究项目(没有。KQTD20170331145453160、JCYJ20160328144536436 KQJSCX20180328095619081),深圳市南山区先锋集团研究基金(No.LHTD20180007)和广东省重点实验室区域免疫和疾病(2019 b030301009)。
- 收到了2019年12月11日。
- 接受2020年7月30日。
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