摘要
2019年12月,SARS-CoV-2出现,导致COVID-19大流行。SARS- cov是导致2003年SARS爆发的病原体,它利用ACE2和TMPRSS2宿主分子进行病毒进入。ACE2和TMPRSS2最近被证实与SARS-CoV-2病毒感染有关。其他的宿主分子包括ADAM17、组织蛋白酶L、CD147和GRP78也可能是SARS-CoV-2的受体。
来确定表达式和原位我们分析了来自515名健康受试者的气道上皮细胞的基因表达数据集,使用包含120种不同样本类型的FANTOM5数据集进行基因启动子活性分析,10名健康受试者的单细胞RNA测序(scRNAseq),蛋白质组学数据集,多种气道上皮细胞类型的免疫印迹,以及98例人肺样本的免疫组化。
我们证明在多种肺上皮细胞样本中ACE2启动子活性的缺失到低ACE2在上皮细胞群的微阵列和scRNAseq数据集中的基因表达。与基因表达一致的是,罕见的ACE2蛋白在人肺的气道上皮和肺泡中均有表达,蛋白组学证实。我们为TMPRSS2、CD147和GRP78蛋白的存在提供了确凿的证据在体外在气道上皮细胞和证实广泛原位CD147和GRP78蛋白在呼吸道黏膜的表达。
总的来说,我们的数据表明,可能在SARS-CoV-2感染期间,存在一种动态调节人类肺中ACE2表达的机制,同时也表明,存在其他的SARS-CoV-2受体,以促进初始宿主细胞感染。
摘要
ACE2基因和蛋白在人肺的气道和肺泡上皮细胞中表达低甚至不表达。我们的数据表明,存在一种动态调节ACE2在人肺或其他SARS-CoV-2受体中的表达的机制。
介绍
2003年,由SARS冠状病毒(CoV)引起的严重急性呼吸系统综合征(SARS)爆发导致8096例疑似病例,774例确诊死亡[1,2在SARS患者中,死亡原因是与弥漫性双侧肺炎和肺泡损伤相关的急性呼吸窘迫[3.].2019年12月,SARS-CoV-2出现,导致COVID-19大流行。SARS-CoV-2的传播速度远远快于SARS-CoV [4- - - - - -6].类似的弥漫性双侧肺炎和肺泡损伤的临床报道也有报道[7- - - - - -9].SARS-CoV-2的严重病例与下呼吸道感染有关,在整个组织和上呼吸道均检测到病毒[7- - - - - -9].可能控制SARS和COVID-19病例数量差异的生物机制仍不明确。SARS-CoV-2可能具有独特的分子机制,通过病毒蛋白质、宿主细胞对感染的更大易感性、宿主细胞对病毒复制的允许性,或这些和其他潜在未知因素的某种组合,影响毒性[10- - - - - -13].在宿主的分子水平上了解SARS和SARS- cov -2病毒的异同可以为传播、发病机制和干预措施提供见解。
确定SARS-CoV受体的重要报告使用HEK293细胞过表达系统,通过与SARS-CoV刺突结构域1共免疫沉淀,确定血管紧张素转换酶2 (ACE2)为受体[14].随后,SARS-CoV的刺突蛋白被确定为ACE2的病毒相互作用伙伴。TMPRSS2的宿主蛋白酶活性促进了SARS-CoV膜与宿主细胞膜ACE2的外域切割和融合[15- - - - - -17].ADAM17也被证明可以分裂ACE2外结构域,但这对SARS冠状病毒感染不是必需的[18- - - - - -20.].SARS冠状病毒进入与ACE2不同的机制也有报道,包括被内体组织蛋白酶L激活和细胞表面CD147或GRP78的表达[21- - - - - -23我们对这些受体进行了机械检测,结果表明SARS冠状病毒可通过多种机制启动宿主细胞进入和感染。最近在体外已有报道表明,类似的宿主蛋白参与了促进SARS-CoV-2进入细胞的过程,如ACE2和TMPRSS2 [5,24生物物理和结构证据强烈支持ACE2与SARS-CoV-2刺突蛋白相互作用,类似于SARS-CoV刺突蛋白[12,13].分子对接研究也表明SARS-CoV-2刺突蛋白可以与细胞表面GRP78相互作用[25].CD147在SARS-CoV-2结合中发挥作用的间接证据已经得到证实在体外使用阻止病毒复制的抗cd147干预剂[26].此外,一项抗cd147干预的临床研究减少了COVID-19患者的症状和住院时间[27].总之,尽管有证据表明,SARS-CoV-2和SARS-CoV都利用ACE2作为受体促进病毒进入,但宿主进入机制的差异可能在两种病毒之间的巨大流行病学差异中发挥了作用,这可能包括额外的未知受体。
通过机制研究,ACE2和TMPRSS2被确定为SARS-CoV的细胞进入决定因素。报告原文原位人肺ACE2表达为肺泡上皮细胞和气道上皮细胞免疫组化染色阳性,A549型肺泡上皮细胞免疫细胞化学染色阳性[28].ACE2蛋白在人肺腺癌细胞系Calu-3中也有表达[29].与ACE2类似,描述TMPRSS2在人类呼吸黏膜中的表达的原始报告描述了在气道上皮细胞和II型肺泡上皮细胞中的表达[30.].ACE2和TMPRSS2抗体用于人类肺组织表达模式分析的特异性仍有待研究。
为了解决与人肺中SARS-CoV-2受体相关的不确定性,我们进行了基因表达和原位人气道上皮细胞和肺组织中候选受体的蛋白谱分析。我们的计算分析使用了来自515个独特受试者的气道上皮细胞的公开的微阵列基因表达数据集,来自10个受试者的单细胞测序数据集,以及74个肺相关细胞和组织类型的启动子活性的FANTOM5数据集。我们的蛋白质组学分析使用了来自人类蛋白质组图的数据[31]和在气液界面培养条件下生长的原代人类气道上皮细胞数据集[32].为我们的原位蛋白分析:我们对98例人肺组织样本进行了免疫组化分析。为了确定抗体特异性,我们对从Calu-3细胞、人原代气道上皮细胞、原代II型肺泡上皮细胞、人支气管上皮细胞(HBEC)-6KT细胞系、A549 II型肺泡上皮细胞系和HEK细胞分离的蛋白进行免疫印迹。总的来说,我们的数据对比了以往的报道,显示了罕见的ACE2蛋白在人肺的气道上皮细胞和肺泡中的表达。我们的蛋白表达数据与低ACE2启动子活性在各种肺上皮细胞样本和低ACE2基因在微阵列和单细胞RNA测序(scRNAseq)数据集中的表达。我们为TMPRSS2、CD147和GRP78蛋白的存在提供了确凿的证据在体外在气道上皮细胞和证实广泛原位CD147和GRP78蛋白在呼吸道黏膜的表达。我们的数据表明,可能在SARS-CoV-2感染期间,存在一种动态调节人类肺中ACE2表达的机制,和/或存在促进肺组织中初始宿主细胞感染的SARS-CoV-2替代受体。
方法
人类的道德
汉密尔顿综合研究伦理委员会(HiREB 5099T, 5305T, 11-3559和13-523-C)批准了用于免疫印迹的原代人气道上皮细胞和用于免疫组化的肺组织的采购。UBC研究伦理办公室批准心脏组织档案和原始人类气道上皮细胞收集。
上、下气道基因表达分析
使用Affymetrix芯片(HuGene-1.0-st-v1和HG-U133 Plus 2)对健康的、不吸烟的鼻腔(GSE19190)或支气管(GSE11906)刷取的气道上皮细胞样本进行公共微阵列实验,实验数据来自NCBI基因表达综合(GEO)数据库[33,34].这导致从两个不同的实验中总共有80个个体样本,其中包括11个上气道样本(鼻腔:11)和69个下气道样本(气管:17,大气道:17,小气道:35)。对于所有数据集样本,原始强度值和注释数据使用GEOqueryR套件(版本2.52.0)[35]来自Bioconductor项目[36].从Bioconductor下载探针定义文件,并使用Bioconductor的文件对探针进行注释注释包中。所有基因表达数据被统一到一个数据集中,然后进行rma归一化处理,仅保留在两个Affymetrix平台(N= 16013)中存在的基因用于后续分析。使用ComBat方法对实验特定批次效应进行了校正[37]使用股东价值分析R套件(版本3.32.1)[38].常规(ACE2,TMPRSS2,ADAM17,CTSL)和非常规(CD147,GRP78)在四个确定的气道水平上比较了SARS-CoV-2受体基因背景表达水平作为阳性对照,已知肺组织表达。检测基因表达水平是否存在显著差异通过对Wilcoxon秩和检验与Benjamini-Hochberg多重检验校正使用统计数据R包(版本3.6.1)。生成基因表达箱图ggplot2R包(版本3.2.1)。
策划支气管上皮细胞涂刷数据集分析
从NCBI GEO数据库中选取了1859个使用Affymetrix芯片(HG-U133 Plus 2和HuGene-1.0-st-v1)对气道上皮细胞样本进行的公共微阵列实验。这些样本通过去除哮喘或慢性阻塞性肺病患者进一步过滤,共得到504个健康个体样本(GSE4302, 28个样本;GSE67472, 43个样品;GSE37147, 159个样品;GSE108134, 274个样品)。在这个数据集中,包含了310个样本的性别和年龄信息,其中86个女性/106个男性。此外,还提供了451个样本的吸烟状况信息,其中包括260名现吸烟者、82名前吸烟者和109名从不吸烟者。
对于所有数据集样本,原始强度值和注释数据按上述描述下载。按照上面的描述检索探测定义文件。所有基因表达数据被统一到一个数据集中,然后进行rma归一化处理,仅保留在两个Affymetrix平台(N=16 105)中存在的基因用于后续分析。如上所述,对实验特定批次效应进行了校正。
FANTOM5数据集启动子活性分析
FANTOM5启动子组数据集[39]用于hg38程序集[40]用于检测sars - cov -2相关人类基因的启动子活性,即ACE2,TMPRSS2,ADAM17,CTSL(组织蛋白酶L1)、CD147和GRP78。使用ZENBU基因组浏览器[41],提取上述每个基因上游和同一链上的最近的基因表达帽分析(CAGE)峰值并进行分析。该数据集包括1886个人类原代细胞、细胞系和组织的CAGE启动子活性数据,并以规范化转录本/百万分(TPM)进行量化。FANTOM5 CAGE数据的一个子集(120个样本)只考虑与肺、肠道、心脏和前列腺组织相关的样本(分别由74、19、15和12个样本组成)。每个CAGE峰值的规范化TPM值(启动子活性的近似值)均为log10根据组织和细胞类型进行转换和分离,每个点的半径与这些转换后的归一化TPM值成正比。
蛋白质组学数据集中的蛋白质丰度分析
Kim公开提供的人类蛋白质组学数据et al。[31]和福斯特et al。[32]数据集用于评估SARS-CoV-2受体相关蛋白在不同人体组织和实验条件下的表达。提取金的表情值等.数据集为ACE2、TMPRSS2、ADAM17、CTSL (cathepsin L1)、BSG (CD147)、HSPA5 (GRP78),以CDH1为气道细胞对照。数据是使用R(版本1.0.12)中的pheatmap包创建的,并表示为log10转换,以方便可视化。福斯特的蛋白质组学数据等.数据集包括从健康的,不吸烟的支气管上皮细胞(N=4;男性)和暴露于磷酸盐缓冲盐水对照车。提取ACE2、TMPRSS2、ADAM17、CD147和GRP78的强度值,CDH1作为阳性对照。强度值由原始研究作者确定通过与给定亲本蛋白相关的所有检测到的肽强度归一化[32].使用ggplot2 R包(版本3.2.1)生成箱形图,并将强度值log10转换为可视化目的。
单细胞RNA测序(scRNAseq)数据分析
使用Cell Ranger流水线(10x Genomics)预处理的数据来自GSE135893。下载10例对照组和12例IPF患者的样本并进行后处理修拉R的包[42].使用源论文中提供的标记定义细胞群[43].10个对照组的细胞被用于进一步分析。小提琴情节的可视化是用修拉.
人原代气道上皮细胞
人肺腺癌细胞系Calu-3在供应商(ATCC-HTB-55)定义的培养条件下生长。人原代气道上皮细胞分离通过来自健康个体的支气管刷在PneumaCult ExPlus (Stemcell Technologies, Vancouver Canada)的水下单层培养条件下生长,并在第1代和第4代之间使用。人支气管上皮细胞hbec6kt在添加表皮生长因子(0.4 ng·mL)的无角质细胞血清培养基中单分子淹水培养−1)和牛垂体提取物(50 μg·mL−1) [44- - - - - -47].
免疫印迹
使用RIPA裂解缓冲液(VWR, Ontario, Canada)和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Sigma, Ontario, Canada)分离细胞蛋白,并使用Bradford分析试剂(Bio Rad, Ontario, Canada)进行定量。免疫印迹使用无染色的4-20%预浇筑梯度凝胶进行,并在ChemiDoc XRS+成像系统(Bio Rad, Ontario, Canada)上成像。在每个免疫印迹中,每lane添加20 μg蛋白质。ACE2 (R&D Systems - MAB933 -单克隆-克隆号171 606 - 2 μg·mL−1)、TMPRSS2 (Atlas抗体- HPA035787 -多克隆- 0.4 μg·mL−1)、CD147 (Abcam - ab666 -单克隆-克隆为memm - m6 /1 - 1 μg·mL−1)、GRP78 (BD - 610 979 -单克隆-克隆- 40/BiP - 0.25 μg·mL−1和阿特拉斯抗体- HPA038845 -兔多克隆)一抗稀释在5%脱脂牛奶/Tris缓冲盐水0.1%吐温-20中,在4℃的支架上孵育过夜,第二天使用抗小鼠- hrp (ACE2, CD147, GRP78 - BD)或抗兔- hrp (TMPRSS2, GRP78 - Atlas)偶联二抗体在室温下以1:300检测2小时(细胞信号,丹维斯,MA, USA)。TMPRSS2、CD147和GRP78的可视化使用Clarity™Western增强化学发光(ECL)衬底进行,而ACE2的可视化使用Clarity Max™ECL衬底(Bio Rad,加拿大安大略省)。收集总蛋白质加载图像,作为样品类型之间蛋白质加载的定性可视化[48].ACE2一抗的免疫原为小鼠骨髓瘤细胞系ns0来源的重组人ACE2 Gln18-Ser740(预测)。TMPRSS2一抗的免疫原是重组蛋白表位标记标记抗原序列,GSPPAIGPYYENHGYQPENPYPAQPTVVPTVYEVHPAQYYPSPVPQYAPRVLTQASNPVVCTQPKSPSGTVCTSKT。CD147一抗的免疫原是人CD147对应的重组全长蛋白。GRP78 - BD一抗的免疫原是人BiP/GRP78氨基酸525-628。GRP78 - Atlas一抗的免疫原是重组蛋白表位特征标记抗原序列EKFAEEDKKLKERIDTRNELESYAYSLKNQIGDKEKLGGKLSSEDKETME
KAVEEKIEWLESHQDADIEDFKAKKKELEEIVQPIISKL。
对A549、HEK和永生的人支气管上皮细胞进行独立免疫印迹分析(L.O、c.j a.j和G.J)。等量的蛋白(20µg)加载到含有抗ace2 (Abcam - ab108252 -兔单克隆-克隆EPR4435(2) - 1/500稀释备用抗体)的4-12%的Bis-Tris梯度凝胶(ThermoFisher, NP0326BOX)上。用GAPDH的加载控制来演示蛋白加载(Abcam - ab181603 -兔单克隆- EPR16884 - 1/ 10000稀释备用抗体)。在Licor C-DiGit上使用ECL Clarity (Biorad, UK)进行可视化。
免疫组织化学
福尔马林固定石蜡包埋的人类肺组织来自非病变区域,从存档的组织块中获得,这些组织块来自为临床护理而接受肺切除术的患者。人类心脏组织来自UBC心血管组织登记处。切取4微米厚切片,对ACE2 (15 μg·mL)进行染色−1)、TMPRSS2 (10 μg·mL−1)、CD147 (5 μg·mL−1)和GRP78 (HPA038845 - 1/200稀释),使用与免疫印迹分析相同的抗体。所有染色均在使用莱卡邦德试剂的莱卡邦德RX系统上进行,在pH值为6(20分钟)的条件下进行热诱导抗原提取,一抗孵制20分钟。数字切片扫描使用Olympus VS120-L100虚拟切片系统,使用VS-ASW-L100 V2.9软件进行40倍放大,使用VC50彩色相机,然后使用HALO图像分析软件进行图像可视化。
结果
在人类气道上皮细胞和肺组织中,可以不同程度地检测到与SARS-CoV-2感染有关的重要候选基因
我们进行了有针对性的分析Ace2、tmprss2、adam17、ctsl、cd147、而且GRP78基因在人气道上皮细胞中的表达是SARS-CoV-2感染的重要候选基因。在这里以及整个基因表达分析中,背景(E-cadherin)作为肺上皮细胞表型的对照。我们首先检查了这些基因在一个策划的数据集上和下气道上皮细胞的基因表达从鼻窦到12th肺内气道的生成(图1一个).
在上呼吸道,所有候选者的表达与观察到的最高水平GRP78和观察到的最低水平ACE2.沿多代下气道(气管,大(4-6th一代)和小气道(10-12th代)显示相同的相对表达模式ACE2被表达最少的和GRP78最高表达的:表达最高的ACE2基因表达在上气道和下气道表现出最大的变异性,在气管样本中表达量最大,在小气道中表达量最低(图1 b).
在我们观察到SARS-CoV中重要的候选基因沿上下呼吸道的一致表达后,我们使用来自504名健康受试者的支气管刷检数据集(补充表1).健康受试者中候选基因的表达水平与在上呼吸道、气管、大气道和小气道中观察到的模式平行(图2).中位数ACE2基因表达量最低GRP78基因表达量最高(图2一个).没有候选基因表现出表达水平的性别依赖性(图2 b).Ace2, tmprss2, cd147,GRP78与从不吸烟的人相比,现在吸烟的人(图2 c- - - - - -补充表2统计).目前吸烟者的CTSL较不吸烟者降低。在性别或吸烟状况与基因表达之间的关系中,未观察到微阵列芯片依赖效应。对于与年龄和基因表达相关的定量分析,由于年龄分布的差异,我们的数据库被分为使用HG-U133 Plus 2或HuGene-1.0-st-v1微阵列的数据集。在hugene -1.0-st-v1数据集(n=181)中,包括更大比例的老年人(>50),我们观察到减少ACE2基因表达与年龄的关系(图2 d, p < 0.05)。
从FANTOM5数据集中提取并分析了在SARS-CoV-2结合和感染中重要的每个候选基因的启动子活性数据,该数据集包括1886个原代细胞、细胞系和组织样本类型(图3).我们选择了包括“肺”、“鼻”、“气道”、“嗅觉”在内的所有样本格式,以确定肺特异性样本类型。分析肠道、心脏和前列腺组织样本作为对照。与我们观察到的沿上下气道的基因表达分析一致,每个CAGE峰值的归一化TPM值表明CD147启动子活性相对于ACE2气道上皮细胞和肺组织样本的启动子活性。组织蛋白酶L启动子活性是所有候选基因中最低的,这与在基因水平观察到的适度表达(图2一个).微阵列基因表达分析和启动子活性与10名健康受试者scRNAseq数据集中的候选基因表达结果一致(补充图1).
总的来说,我们对不同年龄的健康男性和女性上气道和下气道的基因表达分析表明ACE2基因表达相对于在人类气道上皮细胞中分析的所有其他候选SARS-CoV-2受体基因较低。此外,我们在基因水平上没有观察到任何候选人的性别或年龄依赖的表达模式,尽管吸烟状态影响基因表达水平。
在体外而且原位蛋白质图谱揭示了在SARS-CoV-2感染中重要的候选基因的独特表达模式
转录数据分析可能没有指示性原位蛋白质表达水平[49].为了扩展我们的基因表达观察,我们从全肺和原代人气道上皮细胞培养中挖掘公开的蛋白质组学数据并进行了研究在体外人气道上皮细胞裂解物和原位对人肺组织进行蛋白质免疫组化,每种方法使用相同抗体。
人类蛋白质组图是一种公开的资源,包括选定的成人和胎儿组织以及循环免疫细胞群[31].利用该资源,我们检测了ACE2、TMPRSS2、ADAM17、CTSL、CD147和GRP78的蛋白表达。在人类肺组织匀浆中,未检测到ACE2,而在已知阳性对照组织心脏、肠道和睾丸中检测到ACE2 (图4).人肺组织匀浆中剩余分子的排列顺序为:GRP78>CD147>CTSL>ADAM17>TMPRSS2。人类肺组织匀浆是一种异质细胞群,排除了将蛋白质表达与特定细胞类型相关联的能力。因此,我们查询了一个公开的蛋白质组数据集,该数据集来源于在气液界面培养条件下生长的原代人类气道上皮细胞[32,考察同样的候选人。同样,ACE2蛋白表达未检测到(图4 b).CD147、GRP78、CTSL多肽计数表达,TMPRSS2、ADAM17仅少量表达,肽计数低。总的来说,来自不同肺样本格式的两组蛋白质组数据提供了在SARS-CoV-2感染中重要候选分子的互补和一致的表达谱。
本地化原位在蛋白水平表达候选分子时,我们进行免疫组化分析,并结合免疫印迹验证所选抗体识别预测分子量蛋白质的特异性。抗ACE2抗体在Calu-3细胞中仅检测到ACE2蛋白预测分子量(~ 110 kDa)的单个条带。抗ace2抗体需要使用超灵敏的ECL溶液(图5-顶部面板- 1-3车道)。在原代气道上皮细胞或hbecc - 6kt细胞系中未检测到ACE2蛋白,尽管证实了蛋白负载(图54-9通道,底部面板确认蛋白质装载)。使用独特的抗ace2一抗进行独立免疫印迹,在HEK细胞中观察到单一条带,但在永生化人支气管上皮细胞或A549细胞中没有(补充图2).
一种抗tmprss2抗体在所有气道上皮细胞样本中检测到多个条带,其中一个显性条带的分子量约为55 kDa (图5 b-顶部面板)。这些模式在所有被分析的细胞类型中都是保守的。
一种抗cd147抗体在所有气道上皮细胞样本中检测到一个单一的条带,其中一个显性条带的分子量约为55 kDa (图5度-顶部面板)。免疫印迹条带与CD147的重糖基化一致[50].
抗grp78抗体(BD - 610 979)在所有气道上皮细胞样本中检测到单一条带,显性条带预测分子量约为78 kDa (图5 d-顶部面板)。
使用抗ace2、CD147和GRP78的免疫印迹显示了预测分子量的单一条带,这表明观察到的免疫组织化学染色应该是基于目标表位的特异性蛋白,因为这两种方法都检测到变性蛋白[51].免疫组化验证了相同的抗ace2和CD147抗体。抗tmprss2用于免疫组化,尽管免疫印迹观察到的多条带警告了任何观察的特异性原位染色。优化抗grp78抗体应用于免疫组织化学的尝试未成功,需要使用HPA038845 (Atlas抗体)进行额外的抗体询问,该抗体适用于免疫印迹和免疫组织化学(补充图3).
ACE2免疫组化结果显示,98例人体肺样本(包括健康受试者和慢性肺病患者)中,气道和肺泡中的罕见细胞仅选择性染色。图6).一个健康的人体样本包含一个阳性气道上皮细胞,在II型肺泡上皮细胞形态的外周肺细胞中有额外阳性染色(图6-第二行)。患有慢性阻塞性肺疾病的吸烟者样本的代表性图像(图6 b-第二行)显示在气道上皮细胞中没有ACE2蛋白染色,在基底下膜组织中有一个罕见的阳性细胞。ACE2染色的阳性像素计数归一化到组织总像素计数的量化结果显示,健康的非吸烟者和吸烟者之间没有差异(补充图4).肺微血管和人心脏组织染色阳性(补充图5-6)与先前描述的ACE2蛋白染色模式报告一致[52,53].
TMPRSS2免疫组化显示气道上皮细胞和肺周围免疫细胞弥漫性染色,慢性阻塞性肺疾病(COPD)吸烟者染色更明显(图6b -第三行)。这些观察结果在98个被检测的人类样本中的大多数中是一致的。
CD147免疫组化显示,气道上皮细胞有强烈的膜限制性染色,肺周围免疫细胞有弥漫性染色。图6b -第四行)。CD147在慢性阻塞性肺病吸烟者中表现出更大的染色。这些观察结果在98个被检测的人类样本中的大多数中是一致的。
GRP78免疫组化显示气道、肺泡上皮及肺周围免疫细胞弥漫染色(图6b -第五行)。GRP78染色在健康受试者和慢性阻塞性肺病吸烟者之间无定性差异。
总的来说,我们的在体外而且原位蛋白图谱与我们的基因表达分析一致,CD147和GRP78蛋白的表达优于TMPRSS2和ACE2。肺组织染色的其他例子见补充图7.ACE2蛋白在人类肺组织中表达很罕见,在健康人和慢性肺部疾病患者的特定细胞中都有表达。TMPRSS2和CD147蛋白表达在有吸烟史和COPD诊断的个体中增强。
讨论
2019年底出现的全球COVID-19大流行是由SARS-CoV-2引起的。目前还没有从基因和蛋白质水平对人类肺组织中SARS-CoV-2可能的宿主受体进行全面研究。了解宿主肺组织中SARS-CoV-2候选受体的表达水平和定位,可能为减少疾病传播、病毒复制或疾病病理的治疗干预提供见解。为了解决这一知识缺口,我们在组织和细胞水平上进行了基因表达、蛋白质组学分析和原位人气道上皮细胞和肺组织中候选受体的蛋白谱图7).总的来说,我们的数据证明了罕见的ACE2蛋白在人类气道上皮细胞中的表达在体外而且原位.我们的蛋白表达数据与肺上皮细胞样本中低ACE2启动子活性一致ACE2基因在支气管上皮细胞(微阵列)和肺细胞(scRNAseq)中的表达。我们为TMPRSS2、CD147和GRP78蛋白的存在提供了确凿的证据在体外在气道上皮细胞和证实广泛原位CD147和GRP78蛋白在呼吸道黏膜的表达。我们的数据表明,ACE2作为SARS-CoV-2的一个整体受体,可能存在动态调节人类肺表达的机制,可能在SARS-CoV-2感染期间[54].也有可能,SARS-CoV-2的替代受体在最初的宿主细胞感染中很重要。
考虑到合并来自不同来源的多个数据集的局限性,我们使用从504名健康受试者的支气管刷取的经过规划的微阵列基因表达数据集,观察到性别与任何与SARS-CoV-2感染相关的候选宿主分子的基因表达无关ACE2而且TMPRSS2对表达最低的感兴趣基因进行了检测。在一个数据集中,ACE2随着年龄的增长,基因表达量略有下降,尽管蛋白质水平无法确认。低水平的ACE2而且TMPRSS2大量支气管上皮细胞基因表达样本的基因表达表明,肺组织中表达这两种基因的细胞水平较低。我们证实吸烟与支气管上皮细胞样本中ACE2基因表达水平升高有关[55],尽管我们无法通过对人类肺样本蛋白质的免疫组化分析来证实这一点。
转录组学的进步使scRNAseq成为可能,该基因已识别出人类肺中可能对健康和疾病具有重要意义的独特和罕见细胞类型[56,57].scRNAseq提供了观察细胞群子集转录谱的机会,可以从大量样本中分离出细胞信号。因此,我们利用来自健康人类肺样本的scRNAseq数据作为并行方法。scrannaseq在上皮细胞亚群中的表达显示低表达或不表达ACE2基因,而CD147而且GRP78存在于所有人群中。我们的结果与目前公开的数据一致,讨论了罕见的ACE2/TMPRSS2阳性细胞的存在[54].Ziegler使用8个个体的肺样本(4个HIV和活动性肺结核双+ve, 2个HIV +ve和肺结核双+ve, 2个双+ve对照)等.在人类中,只有0.8%的II型肺泡上皮细胞表达两种ACE2而且TMPRSS2基因(54].对纤毛细胞的进一步分析发现,5.3%的纤毛细胞同时表达两种基因ACE2而且TMPRSS2基因。在体外与这一发现一致,因为纤毛细胞是这种冠状病毒的优先目标[58].最有趣的是ACE2而且TMPRSS2基因表达细胞仅在HIV和结核病双+ve样本中发现。这些观察结果在上呼吸道中重复,只有极少数的分泌性上皮细胞(占总数的0.3%)共同表达ACE2而且TMPRSS2.报道的scRNAseq结果与只关注的分析一致ACE2不同肺细胞的基因表达[59].重要的是,这些出色的转录组学分析证实了我们在大块组织微阵列数据集中的观察结果。
基于联盟的公开数据集代表了确认我们数据的另一种并行方法。我们使用了包含1866个人类原代细胞、细胞系和组织样本CAGE启动子激活数据的FANTOM5数据集[39]来检测每个候选sars - cov -2受体基因的启动子活性水平。FANTOM5 CAGE数据为量化基因表达提供了一种额外和补充的方法,因为给定基因的共享启动子可以产生不同表达水平的多个转录本,并且部分独立于任何给定转录本在细胞中的半衰期。一般情况下,ACE2在气道相关组织中的启动子活性较低或无;只有来自成人肺的单个样本,其CAGE启动子的正常表达水平高于百万分之一的转录本,而在肠道细胞中观察到的表达与已知的ACE2表达模式一致[60].与微阵列数据一致,CD147启动子活性相对于ACE2在气道相关细胞和组织中升高,尽管相对较低的CTSL(组织蛋白酶L1)启动子活性与适度的基因表达水平不一致。
基因的表达并不总是与蛋白质的表达相关[49].考虑到这一点,我们进行了蛋白质组学分析和免疫印迹分析的结合。在我们的免疫印迹中,我们使用了人类Calu-3腺癌细胞系,因为该细胞对SARS-CoV-2感染易感且允许,并表达ACE2,我们证实了这一观察结果[24,29].我们还使用了原代人气道上皮细胞和支气管上皮细胞系(HBEC-6KT)。我们对ACE2和TMPRSS2进行了免疫印迹检测,因为这些被强调为与SARS-CoV-2相互作用,而我们对CD147进行了检测,因为最近的临床前和临床研究证明了CD147作为SARS-CoV-2候选受体的概念[26,27].最后,GRP78在整个转录组学研究中主要表达,并被选为阳性对照,因为先前的表达已在人类气道上皮细胞中得到证实[61].由于启动子活性低,组织蛋白酶L被排除在本分析之外(图3),而ADAM17被排除在外,因为它在冠状病毒感染中的拟议功能是通过ACE2 [5,24],被纳入分析。免疫印迹分析,所有抗体显示预测分子量的主要条带,抗tmprss2多克隆抗体显示所有细胞样本中额外的小条带。这些其他条带的身份尚不清楚,并提示下游免疫组化分析可能被该抗体的特异性所混淆。相比之下,ACE2、CD147和GRP78抗体具有特异性,可用于免疫组化而不考虑特异性。有趣的是,ACE2蛋白只能在超敏感的ECL溶液中检测到,并且只能在Calu-3细胞中检测到,这表明原代人气道上皮细胞和hbecc - 6kt细胞系中缺乏该蛋白。我们的数据与之前使用相同一抗在淹水单分子膜条件下培养的原代人气道上皮细胞的免疫印迹一致,其中ACE2蛋白缺失,仅在气液界面培养条件下表达[62].观察到CD147和GRP78也在Calu-3细胞中表达,鼓励进一步研究这些宿主蛋白,因为它们可能有助于ACE2和TMPRSS2在这种细胞类型的SARS-CoV-2结合和融合中的功能。总的来说,气道上皮细胞的免疫印迹抗体图谱显示出独特的条带模式,表明抗体对ACE2、CD147和GRP78具有特异性,对TMPRSS2的特异性较低。
对ACE2和TMPRSS2在人肺中的定位进行了免疫组化分析[28,30.].这些蛋白在人肺组织中阳性染色的观察没有伴随免疫印迹或补充方法来确定所使用抗体的特异性[51].在未确定抗体特异性的情况下,应谨慎解释所提出的历史数据。为了解决免疫组化染色的抗体特异性问题,我们使用了通过免疫印迹验证的相同抗体,并使用蛋白质组学作为一种正交的、抗体独立的方法来确认结果。我们再次关注ACE2和TMPRSS2,因为它们是宿主细胞感染SARS-CoV-2的重要候选蛋白。我们的ACE2免疫组化染色模式与转录谱和免疫印迹一致,98个人类样本中只有1个显示罕见的气道和肺泡上皮染色。心脏组织和肺微血管区ACE2染色阳性表明我们的染色方案是成功的。这些结果与报道的缺乏特异性验证的抗体形成了直接对比[28,30.].TMPRSS2在所有经气道上皮变异检查的样本中表达频率更高,与吸烟史和/或慢性阻塞性肺疾病状态相关。相反,CD147在所有样本的气道上皮细胞中均有表达。与TMPRSS2类似,CD147表达升高与吸烟史和/或慢性阻塞性肺疾病状态相关,这与以往的报道一致[50].我们最初选择的用于免疫印迹的GRP78抗体在免疫组化中没有得到验证。因此,我们使用额外的抗体(HPA038845)进行了验证性GRP78免疫印迹和免疫组化,并展示了其在人气道上皮细胞中的表达在体外而且原位.重要的是,GRP78在正常生理条件下存在于内质网(ER)中,作为ER的分子伴侣,促进正确的蛋白质折叠。然而,在内质网应激(包括病毒感染)条件下,部分ER驻留GRP78重新定位到细胞表面,在那里它可能作为病毒共受体[63].我们的研究小组已经报道了在动脉粥样硬化斑块中存在细胞表面GRP78 [64]、前列腺癌[65肾脏[66].然而,目前市场上还没有可特异性结合细胞表面GRP78的抗GRP78抗体,双免疫荧光用于显示细胞表面GRP78与已知表面受体的共定位[64].这一缺陷使我们无法对肺组织进行精确的细胞表面GRP78免疫组化,从而在SARS-CoV-2受体的背景下进一步探究这一概念。利用前列腺癌患者来源的GRP78自身抗体,特异性的细胞表面GRP78 [64]可能适用于肺组织,用于GRP78评估细胞对SARS-CoV-2感染的敏感性。
我们的研究有几个上面没有提到的局限性。我们观察到的上气道和下气道之间以及沿气道树的基因表达差异在蛋白质水平上没有得到证实。仍有可能在上呼吸道中存在完全不同的候选分子的蛋白表达谱,为SARS-CoV-2与呼吸道黏膜的相互作用提供了不同的环境。鼻咽拭子可检测SARS-CoV-2病毒[67这个解剖区域可能对下气道的继发感染很重要[8,68].与这种潜在的暂时性影响相关,SARS-CoV-2有可能在感染后诱导宿主细胞上受体的表达[54].我们的研究还局限于在基础条件下,在没有可能调节基因转录和蛋白质翻译的病毒或环境刺激的情况下,检测在SARS-CoV-2感染中重要的候选分子。
SARS-CoV-2感染和传播导致了全球COVID-19大流行。需要了解SARS-CoV-2用于宿主细胞感染的受体及其在人类样本中的平行特征,以便为制定旨在减轻COVID-19的干预策略提供信息。我们的数据证实了罕见的ACE2蛋白在人气道上皮细胞中的表达在体外而且原位,与低ACE2启动子活性一致ACE2支气管上皮细胞的基因表达。我们为TMPRSS2、CD147和GRP78蛋白的存在提供了确凿的证据在体外在气道上皮细胞和证实广泛原位CD147和GRP78蛋白在呼吸道黏膜的表达。由于大量证据表明SARS病毒与ACE2相互作用,在SARS- cov -2感染的背景下,可能有其他机制调节呼吸道黏膜中的ACE2,和/或其他共受体,而不是在基础条件下在蛋白质水平上的表达。
确认
我们要感谢麦克马斯特免疫研究中心核心组织学设施的Mary Jo Smith,感谢她在免疫组织化学抗体染色方面及时和专业的专业知识。我们要感谢博士。Sam Wadsworth和John McDonough对CD147和气道上皮细胞生物学的知识讨论。我们要感谢Charles Plessy博士提出分析FANTOM5数据的建议。我们要感谢作者各自的家庭(CLB、JMH和HLH)和研究机构的所有个人和专业支持,最重要的是,在COVID-19大流行期间,我们要感谢一线医护人员。
脚注
本文的补充资料可从www.qdcxjkg.com
支持声明:这项工作由Hirota JA的启动基金和Mossman k的CIHR拨款支持,Hirota JA由加拿大研究椅项目和安大略早期研究者奖支持。Doxey AC由NSERC和安大略早期研究者奖支持。加拿大研究椅;DOI: http://dx.doi.org/10.13039/501100001804;加拿大卫生研究所;DOI: http://dx.doi.org/10.13039/501100000024。
利益冲突,阿吉亚尔医生没什么可透露的。
利益冲突,特伦布莱博士没什么可透露的。
利益冲突,曼斯菲尔德医生没什么可透露的。
利益冲突,伍迪医生没什么可透露的。
利益冲突,洛布医生没什么可透露的。
利益冲突:班纳吉博士没什么可透露的。
利益冲突:昌迪拉莫汉医生没什么可透露的。
利益冲突,蒂森医生没什么可透露的。
利益冲突:曹医生没有什么可透露的。
利益冲突:Dvorkin-Gheva博士没有什么可透露的。
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利益冲突,Organ医生没什么可透露的。
利益冲突,约瑟夫医生没什么可透露的。
利益冲突:约翰博士没有什么可透露的。
利益冲突,汉森医生没什么可透露的。
利益冲突:奥斯汀博士有一项专利US7524826B2颁发给麦克马斯特大学和汉密尔顿健康科学公司麦克马斯特大学。
利益冲突,麦克马纳斯医生没什么可透露的。
利益冲突:Jenkins博士报告了来自Astra Zeneca的赠款,来自Biogen的赠款,来自Boehringer Ingelheim的个人费用,来自Daewoong的个人费用,来自Galapagos的个人费用,来自Galecto的赠款,来自GlaxoSmithKline的赠款,来自Heptares的个人费用,来自NuMedii的非财务支持,来自Pliant的赠款和个人费用,来自Promedior的个人费用,来自Redx的非财务支持,来自Roche的个人费用,以及来自Action for Pulmonary Fibrosis的其他提交工作之外的个人费用。
利益冲突,莫斯曼博士没什么可透露的。
利益冲突,阿斯克医生没什么可透露的。
利益冲突,多克西医生没什么可透露的。
利益冲突:广田博士没什么可透露的。
- 收到了2020年4月10日。
- 接受2020年7月1日。
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