质量控制在微阵列基因表达在人类的评估气道上皮细胞

背景

微阵列技术提供了一个强大的工具来定义的气道上皮细胞基因表达谱提供洞察人类呼吸道疾病的发病机理。本研究的重点是建立严格的质量控制参数,以确保微阵列的评估气道上皮细胞实验工件不抱愧蒙羞。样品(n = 223)的气管,大、小气道上皮细胞收集的纤维支气管镜检查144人,Affymetrix微阵列杂交。预处理和post-chip质量控制(QC)标准建立,包括:(1)RNA质量,评估RNA完整性(RIN)≥7.0;(2)cRNA记录完整性评估的信号强度比GAPDH 3 ' 5 '探针集≤3.0;和(3)multi-chip标准化换算系数≤10.0。

结果

的223个样本,所有三个标准是在191年评估;的184例(96.3%)通过这三个标准。剩下的32个样本,RIN并不可用,只有另外两个使用了标准;29(90.6%)通过这两个标准。相关系数的两两比较基因表达水平在100年维护中,至少有一个数组没有质量控制标准(平均皮尔逊r = 0.90±0.04)显著(p < 0.0001)低于相关系数之间的两两比较数组,通过QC标准(平均皮尔逊r = 0.97±0.01)。Inter-array变异性显著下降(p < 0.0001)在样品通过质量控制标准与样品相比没有质量控制标准。

结论

基于基因的异常维修数据生成的样本没有建立质量控制标准,我们认为这项研究中概述的QC标准可以准确区分高质量与低质量数据,并可以用来删除质量差微阵列在继续之前高阶生物样品分析和解释。

评估人类基因表达的转录组使用微阵列技术是一种强大的工具来识别基因和基因表达模式参与机制正常的器官功能和疾病的发病机理1- - - - - -3]。微阵列技术是理想的研究人类的呼吸道上皮细胞在健康和疾病的气道是为数不多的内部器官,可以重复样本足够数量的纯薄壁组织的细胞群健康个体以及个体与肺部疾病(4- - - - - -11]。在这方面,我们和其他几个组使用人类基因表达微阵列来评估基因的表达在人类呼吸道上皮细胞,细胞群经纤维支气管镜容易做到(4,9,12- - - - - -15]。

虽然很容易获取细胞,微阵列的输出数据极度依赖于RNA的质量和cRNA衍生品杂化微阵列(16- - - - - -27]。虽然不同的截止条件RNA完整性和微阵列数据质量提出了,他们不是一直应用。在这种背景下,本研究的重点是建立严格的质量控制(QC)标准,以确保高质量的数据数组,调查人员和实验室之间的可比性和可再生的不同。我们的策略是基于概念表达的质量数据可以有效地评估使用三个离散质量控制指标计算样本和芯片级和应用这些指标可以保证统一高质量的微阵列数据。使用人类基因组U133 Affymetrix + 2.0数组气管的样本共223个样本,和大、小气道上皮细胞从144个人(健康不吸烟,吸烟者健康,有症状的吸烟者,吸烟与正常肺量测定法,孤独的肺气肿和吸烟者慢性阻塞性肺病(黄金I - III)],我们建立了预处理和post-chip QC标准基于经验的观察我们的数据与发表建议,包括:(1)RNA质量,评估RNA数量完整性;(2)cRNA记录完整性评估的信号强度比glyceraldehyde-3-phosphate脱氢酶(GAPDH) 3 ' 5 '探针集;和(3)定义的上限multi-chip正常化比例因子。的223个样本,所有三个标准是在191年评估;的184例(96.3%)通过这三个标准。剩下的32个样本,RIN并不可用,只有另外两个使用了标准; of these 29 (90.6%) passed these two criteria. Expression data for 100 maintenance gene probe sets on the array demonstrates that among the samples failing QC criteria, there is greater variability among reported expression levels for maintenance genes compared to randomly selected samples passing the QC criteria. The QC criteria proposed in this study should provide a useful guideline for future studies using microarrays to assess mRNA levels in human airway epithelial samples, and should be adaptable to assessment of microarray data from other cell populations.

之前的这些研究的结果被发表在一个抽象的形式(28]。

气道上皮细胞

共223个样本获得的气道上皮的支气管刷从三个不同的位置(气道气管、大、小气道)144例和5个不同肺表型(健康不吸烟,吸烟者健康,有症状的吸烟者,吸烟与正常肺量测定法,孤独的肺气肿和吸烟者慢性阻塞性肺病;表1)。从36 - 52岁,平均年龄不一,男性代表绝大多数在一组。的祖先不同的那些欧洲、拉美裔、亚洲和非洲。每组的肺功能符合标准。一系列的4.4到7.6×10⁶细胞从气管中恢复过来,大气道和肺气道在所有5个小表型组和细胞计数并不依赖于主题或站点的表现型支气管刷由方差分析(p > 0.05)。从所有位置,平均100%到99的所有细胞恢复被non-epithelial上皮不到1%污染细胞。位置如前所述细胞差异取决于(4,29日,30.]。提取RNA的平均产量为25.3±10μg。从3.5到53.9不等μg。

建立和测试的质量控制标准

总体战略是利用223个样本数据建立前瞻性应用QC标准,确保高质量的表达式为生物微阵列数据的解释在我们正在进行的研究。QC标准被选为严格和客观质量控制指标在三个不同阶段的微阵列工作流,并被应用到所有223个样本杂化微阵列在这项研究;RIN评估,n = 191(32个样本没有RIN分析之前,因为样本杂化微阵列生物分析仪RIN软件)的发展。GAPDH 3 / 5的信号强度比和比例因子标准,223个样本都包括在内。

的223个样本,所有三个标准是在191年评估;的184例(96.3%)通过这三个标准。剩下的32个样本,RIN并不可用,只有另外两个使用了标准;29(90.6%)通过这两个标准。只有10(4.5%)没有至少一个QC标准,因此被认为没有质量控制。失败的QC样品的整体崩溃是:2大呼吸道样本(1健康不吸烟和健康的吸烟者)和8小气道样品(1健康的吸烟者,4有症状的吸烟者,3吸烟与慢性阻塞性肺病)。失败的最大原因是比例因子的标准,这导致了70%的失败。所有的10个样本没有QC标准RIN和/或不及格比例因子标准,表明这些指标可能是最敏感的技术差异,因此评估整体数组质量至关重要。而7样品失败的一个标准,1样品失败RIN和GAPDH 3 / 5的比例标准,和2样品失败RIN和比例因子标准,表明质量控制参数对阵列性能起到相关的作用。

RIN

Bioanalyzer-generated RIN的RNA质量检查评分191年的样本数据(见上图)。根据公布的数据(26,31日- - - - - -33RIN≤7.0),样品被指定通过QC(图1)。5个(2.6%)的191个样本中,RIN分数< 7.0。RIN值没有显著依赖于表型或生物起源的RNA样本方差分析(p > 0.1),与n = 4小气道样本(1)健康的吸烟者,2有症状的吸烟者,1吸烟与慢性阻塞性肺病)和1大呼吸道样本(健康不抽烟)失败的基础上RIN < 7.0。

GAPDH 3 / 5的信号强度比

作为转录的效率的度量和放大的反义cRNA cDNA导数的RNA材料开始,信号强度为探针集GAPDH驻留在5 '末端和600个核苷酸中的大多数近端启动站点在3 '端记录的比较。所有样品杂化微阵列,3 ' 5 '探头设置GAPDH基因提取强度计算3 / 5的信号强度比。根据公布的数据(16,23,34- - - - - -36),通过QC GAPDH 3成立的标准比≤3.0(图/ 52)。符合这一标准,只有1个小气道样本症状吸烟者失败的QC。Affymetrix表达芯片也返回3 / 5的比率β-actin等其他基因。但由于强烈的相关性在3 / 5的比率β-actin和GAPDH (r²= 0.92;p < 0.0001),应用截止GAPDH之外的标准被认为是多余的。在气道上皮的背景下,尽管GAPDH不是一个理想的“管家”基因的表达在不同条件下可能有所不同,但这并不妨碍其使用在评估cRNA质量(37]。

Multi-chip正常化比例因子

比例因子是作为整体指数的微阵列杂交,洗涤,扫描过程。所有223个样本比例因子值计算目标强度值500检查。比例因子值的标准≤10.0(图成立2)。7(3.1%)的223个样本比例因子的值超过了可接受的截止。比例因子的值没有显著依赖于表型或生物起源的样本方差分析(p > 0.1),与n = 5小气道样本(1)健康的吸烟者,2有症状的吸烟者,2吸烟与慢性阻塞性肺病)和n = 2大呼吸道样本(1健康不抽烟的人,健康的吸烟者)失败的比例系数> 10.0的基础上。

失败的相互依赖不同的质量控制标准是评估(表2)。总数的7样品失败RIN身上三个失败的一个其他的其他质量控制标准1失败GAPDH 3 / 5的测试和2失败比例因子测试。没有重复QC失败的模式由单一采样在不止一个场合,也没有相关的失败与微分或% non-epithelial污染。

维护基因表达水平

评估是否基因表达数据来源于样本,通过所有的质量控制标准是比这更健壮源于样品失败的一个或多个条件,对每一个样本,不管QC度量值,提取表达水平为100年维护基因。的10个样本没有质量控制标准和24个随机选择的样本通过QC标准,所有100个基因的表达谱进行了比较。皮尔森相关的计算(即所有成对比较。,24× 24 comparison of samples both passing QC, 24 × 10 among samples passing QC and samples failing QC, and 10 × 10 comparison of samples both failing QC). Correlation coefficient values indicated that samples passing QC criteria were highly correlated with other samples passing QC criteria (average Pearson r = 0.97) while samples failing QC criteria showed lower correlations with all other samples (average Pearson r = 0.90; Figure3)。相关系数的值的范围内获得两两相关性的样本通过质量控制标准是0.92到0.99。相反,当比较失败QC标准样品和其他样品,相关系数值的范围是0.76到0.97。没有区别在样本的相关系数值失败QC RIN标准与其他原因(p > 0.4)。相关系数的分布两两比较的样本通过QC标准明显不同值的分布两两比较,至少有一个样品不及格(p < 0.0001, Mann-Whitney QC标准U测试;图4)。

的24个样品经过QC标准被用于相关矩阵分析,10个样本匹配在气道位置与10个样本没有QC标准选择评估的100个维护基因的变异系数。100年维护基因表达水平显著表明更大的可变性之间的10个样本没有质量控制标准(“失败”数据集)之间的10个样本通过QC标准(“通过”的数据集,图5)。在“通过”的数据集,维护基因的平均变异系数为21.7% (5^th到95年^th百分13.0 - 31.0%)。相比之下,在“失败”的数据集,100个基因的平均变异系数为35.7% (5^th到95年^th百分21.8 - 52.5%;Mann-Whitney p < 0.0001U测试)。

同样,变异系数为微阵列探针集都是更大的失败QC相比,微阵列,通过。两个数据集9微阵列比较给34±0.1%的平均变异系数为数组,通过QC和43±0.1%失败的QC的数组。对发现的影响生理差异(例如吸烟对基因表达谱的影响(12]),被权力的计算评估。如果两组15吸烟者和不吸烟者和15相比,所需的真正差别的方法检测与p < 0.05和0.95从0.46的力量与数组的数组,通过QC 0.58失败QC(即。,小生物效应检测)变得更加困难。

检查维护基因表达水平差异的潜在原因无关QC标准,差异受试者评估。223气道上皮样获得这项研究来自144个人,作为一个人有可能接受支气管刷在一个或多个三个目标站点:气管、大气道,和小气道。由独立的线性回归,没有100年维护相关基因表达水平的基因(r²< 0.05为所有基因)和年龄(平均45±8.8)144人对面的气道上皮衍生的是谁。没有基因上有强烈的相关性(r²< 0.15)与吸烟史(平均pack-yr 30±18)。表达水平与肺功能参数的相关分析显示没有关系(r²与所有参数)< 0.09为所有基因。

对全球肺癌生物学QC失败的影响

为了评估的功能后果QC标准基因表达数据,主成分分析(PCA)是用于通过QC样品相比那些失败了。这种分析,一个独立的微阵列数据集质量控制是可以从失败的一个技师培训项目威尔康奈尔医学院遗传医学部门的。从这个培训项目,11微阵列,QC失败是可以从收集到的小气道上皮细胞样本个体与慢性阻塞性肺病(n = 1失败由于RIN标准;n = 6失败GAPDH标准;n = 3失败比例因子的标准;和n = 1失败GAPDH和比例因子的标准)。11个样品的数据相比,微阵列数据从n = 11个样本(匹配的血统、年龄、性别、久和肺功能测试结果)慢性阻塞性肺病患者小气道上皮的通过所有质量控制标准(见附加文件1人口的2组)。PCA广泛披露,全球全基因组表达水平的差异在慢性阻塞性肺病患者的小气道上皮细胞样本,通过QC和那些失败(图6)。使用P调用的标准样本的20%,“现在”的叠化的大小通过vs失败样本> 1.5,p < 0.01使用t测试Benjamini-Hochberg调整限制的假阳性,888两组之间的差异表达探针集(附加文件2),表明微阵列数据失败QC标准并不一定只有更多的变量或“嘈杂”,但事实上是显著不同的生物数据相比,获得的数据样本,通过质量控制标准。

上皮样气管(n = 223),大型气道和小气道得到健康受试者和主题与肺部疾病,包括吸烟者和非吸烟者,微阵列分析评估质量控制标准。使用人类基因组U133 Affymetrix + 2.0数组组成的三方成立QC截止:(1)RNA质量,评估RNA数量完整性(RIN)≥7.0使用安捷伦2100生物分析仪软件;(2)cRNA记录完整性评估的信号强度比≤3.0 GAPDH 3 ' 5 '探针集;和(3)multi-chip标准化换算系数≤10.0。10的223个样本,失败的一个或多个QC标准,不依靠表型的主题或取样的位置。通过使用QC截止条件,inter-array可变性,变异系数作为评估的100个维护基因表达水平,显著降低。这些质量控制标准应适用于减少实验变异基因表达微阵列实验。

RIN RNA质量评估

我们以前使用28 s / 18 s rRNA峰值比率,由electropherogram计算,来验证质量的RNA样品前微阵列杂交(38]。然而,28 s / 18岁比并不总是提供足够依据区分高质量和低质量RNA微阵列实验(21,26,27,32,39- - - - - -41]。例如,在一个分析技术在基因表达变化的影响不固定的临时冻结vsformalin-fixed石蜡包埋(FFPE)颗粒状人类骨髓基质细胞,尽管RNA样本有等效和可比28 s / 18岁比计算机可视化的凝胶电泳,超过两倍的基因被确定为快速冷冻细胞的表达比formalin-fixed石蜡包埋细胞RNA质量影响的反映可能没有被量化的评估rRNA亚基峰高度(42]。

因为安捷伦生物分析仪RIN的实现软件,我们依靠RIN RNA完整性的主要指标,根据公布的数据显示,RIN占RNA降解过程的众多属性提供一个明确的和全面的起始物料的总体质量指数(21,41,43,44]。RNA质量在这项研究中,我们发现当评估RIN、一般的失败率为2.8%基于RIN≥7.0。低比例的失败可能反映了严格的培训和标准操作程序,确保在试剂盒均质上皮细胞在不到60分钟从支气管刷的时间。使用一个技术员与空间,这个过程设备和试剂不用于其他用途也很重要。研究使用临床标本的兴趣不断增加导致人体组织的广泛建立银行。在许多情况下,微阵列研究RNA从组织中提取样本,可能是保存在室温和/或经历了反复融化和冻结,从而影响质量的RNA (24,32,45- - - - - -47]。例如,微阵列实验涉及胰腺肿瘤组织不得不丢弃的大多数提取RNA样本,由于RNAse-rich器官的内容和RNA的快速降解材料(48,49]。对于那些类型的样本可能的RNA降解,RIN≥7.0截止的一致应用是有用的获取高质量的基因表达微阵列数据。

说明的预测能力RIN pre-chip标准,线性回归建模和普通最小二乘线性回归表明,比例因子和GAPDH 3 / 5的信号强度比与RIN价值负相关(50]。有趣的是,两个样品的串联失败RIN的当前研究和比例因子标准,并通过一个示例RIN标准以及GAPDH 3 / 5的信号强度比标准,一致的概念,RNA质量差不利影响合成完整的cRNA以及probe-target绑定的杂交效率(19,33,34,39,50- - - - - -52]。RIN测试预测的失败以来下游步骤,这个截止之前的应用程序在体外转录反应和杂交有可能节省大量的成本浪费试剂和技术。

扩展

发表建议可接受范围的扩展因素在同一目标强度计算值数值不同褶皱被切断,或交替,建议所有值在2个标准差的意思是在两个方向16,34,35]。然而,由于GeneChip扫描仪3000 7 g在这项研究中,使用和通常受雇于大多数机构微阵列的核心设施,可以解决65535的荧光水平16位的分辨率(允许检测非常低水平的荧光),缩放因子数组可以从理论上讲,和在实践中,范围到数百人。由于可变比例因子范围可以不断受到波动随着新样本添加到正在进行的研究,甚至扭曲的存在一个或两个外围芯片和极高的比例因素,我们选择了一个有限的上限比例因子的10.0标准。97%的比例因子的值样本检验本研究在≤10.0,这是一个实际的和可以实现的截止,可以准确地识别边远质量差样本。

在基因表达分析的研究样本来自活检,细胞排序,或激光捕获显微解剖,收益率的细胞RNA通常少量(例如,ng)和要求专门的放大方法产生足够的生物素化的cRNA阵列杂交[53,54]。在这些类型的研究和其他研究在活的有机体内组织样本的RNA是限制和替代技术程序利用,比例因子指标可能是有用的评估技术构件的影响,和表达数据的质量。例如,在一个小样本的分析从鼠肝rna,显著增加比例因子的值表明所使用的放大技术导致技术变化的形式大幅减少的百分比记录检测到array [55]。相比之下,在少量的RNA的研究来源于从乳房乳腺癌组织标本,所有放大样品确认的一致的比例因子值表达式的有效性和可比性的数据(56]。

微阵列分析质量控制表达式

尽管大量发表肺癌基因表达数据,通常是没有关注芯片质量控制,与随之而来的扭曲的风险包括质量差的阵列数据的分析(35,57- - - - - -63年]。进一步,不同的RNA质量的影响在特定的本体论类别可以从微阵列复杂的生物信息的提取不同的质量。为例,在分析RNA完整性的影响基因表达在乳腺癌样本,发现特定类别的相关基因如脱氧核糖核酸酶的活动,调节细胞粘附和NADH脱氢酶活动,最受RNA质量(26]。

用于测试数据完整性的方法之一是基于斯皮尔曼的无监督分级示例集群correlations-based距离度量(64年,65年]。由此产生的集群手动检查聚类样本的非生物参数,如样本收集的日期和RNA提取,批在体外转录和扩增试剂使用,阵列杂交。这些因素可能导致一批影响,一批芯片的整体强度比其他人更像批处理数组(集团60,66年]。虽然这些聚类方法提供洞察实验可变性,他们没有提供定量准则消除微阵列分析和有时很难确定集群与生物多样性的关系。

另一个策略通常用于区分高质量从低质量的微阵列数据是基于异常状态的任何给定的样本实验。软件包,如dChip(基因芯片分析仪)和探测器分析器可以识别强度异常值的样本组微阵列,并考虑这些特性数组的杂交如亮度、饱和度、动态范围和背景65年- - - - - -67年]。需要注意的是,所有的芯片都必须从生物学上类似的起源,只有少量的实验异常值必须存在。

质量控制标准提出了研究

目前的研究提供了一个高效、简单的基因表达微阵列数据的质量评价方法。它强调良好的实验执行和丢弃不满意微阵列而不是通过复杂打捞数据数组变量的数据质量的统计分析。我们提供一个标准化的三方标准针对RNA质量开始,cRNA记录的完整性,杂交效率。每个参数指定一个阈值,外的样品很容易识别是低质量的,可以消除或re-hybridized之后再继续分析。所有的措施都可以通过安捷伦生物分析仪软件和Affymetrix GCOS数组洗涤和扫描后自动生成的报告。虽然安捷伦生物分析仪和Affymetrix平台广泛应用,类似的标准可能会申请替代方法。例如,评估的相对信号探针3’,5’末端的信使rna可以作为质量控制对于任何微阵列平台。

通过公共存储库在数据共享的背景下,本研究提出的标准的好处包括两个参数,保证用于任何Affymetrix数据存入地理。玻璃纸的初始处理GCOS文件生成一个质量报告包含3 ' / 5 ' GAPDH信号强度比和multi-chip正常化比例因子的数组。从Affymetrix GCOS软件是免费下载,可以应用在所有调查。通过这种方式,两个三个QC标准探讨提供一致的质量控制方法不仅当前数据,但也与以前公布的,归档数据。即使RIN标准应用在这里需要专门的设备和软件,RIN可以间接预测的3 / 5的比率从玻璃纸中提取文件存入地理(50]。

上下文中,减少不良的技术变化允许更精确的分析意义的基因表达和提高功率测试,我们建议,这里所描述的简单的方法,包括一套普遍可用的三个标准,可以确保微阵列数据反映生理差异而不是实验可变性。

研究人群

签署知情同意后,受试者评估在威尔康奈尔NIH临床与转化科学中心和基因药物临床研究机构主管部门协议威尔康奈尔医学院的机构审查委员会批准。所有人评估标准的历史,物理考试,完整的血细胞计数,凝固研究肝功能测试,hiv - 1测试,尿液的研究中,x射线胸透、心电图、肺功能测试。所有人都吸烟状态评估与尿液中尼古丁和可替宁的水平,和血液中碳氧血红蛋白含量。总共有223气道上皮样在这项研究来自三个网站:气管、大气道(2^nd3^{理查德·道金斯}订单支气管)和小气道(10^th-12年^th五个表型组(表中订单支气管)1):健康不吸烟(气管chea n = 17日大气道n = 21日小气道n = 35),健康吸烟者(气管n = 15,大型气道n = 32,小气道n = 44),症状吸烟者(气管n = 3,大气道n = 4,小气道n = 10),吸烟者与孤独的肺气肿与正常肺量测定法(小气道n = 22)和吸烟者慢性阻塞性肺病黄金阶段》(小气道n = 20)。健康不吸烟没有任何症状的肺正常肺功能和正常的胸部x光片,所有实验室测试在正常范围之内。健康的标准吸烟者与不吸烟者的健康除了尿液中尼古丁和可替宁和血液中碳氧血红蛋白含量确认目前的吸烟状况。症状吸烟者类似于健康的吸烟者除了有咳嗽或痰分3或更高版本,或呼吸困难评分修改医学研究理事会(湄公河委员会)呼吸困难2或更大的规模68年- - - - - -71年]。唯一的肺气肿与正常肺量测定法表型是由正常FEV1 / FVC的定义,减少DLCO,肺气肿定量CT扫描的证据(> 1%的肺< -950 Hounsfield单位(30.])。吸烟与慢性阻塞性肺病包括建立当前吸烟者符合慢性阻塞性肺疾病的全球倡议(黄金)标准对黄金我,II, III (72年]。一个独立数据集从n = 11 COPD患者是可以从一个技术人员培训计划的威尔Cor-nell医学院遗传医学的部门。小气道上皮细胞样本这些主题,失败的QC标准,比较11匹配COPD患者小气道上皮细胞样本,通过QC标准(见附加文件1)。

抽样的气道上皮和RNA提取

进行纤维支气管镜对获得纯的气管,大、小气道上皮细胞通过使用先前描述的方法(4,29日,73年]。短暂,在轻度镇静与哌替啶和咪达唑仑和常规麻醉的声带和支气管气道局部利多卡因,一个支气管镜(宾得,eb - 1530 - t3)是采取近端所需的位置集合。2.0毫米一次性刷用于刷牙立即远的位置bronchscope(用于气管或大型气道)或通过进一步推进7 - 10厘米到10^th到12^th一代分支小气道。上皮细胞收集轻轻滑动来回刷5到10倍在8到10个不同的位置在同一区域。细胞被分离的刷到5毫升浸泡冰冷的支气管上皮基底介质(BEBM, Clonetics Walkersville, MD)和移动五到十倍。0.5毫升的整除用于微分细胞计数和其余部分(4.5毫升)在6000转离心10分钟不到60分钟内支气管刷的时间。颗粒状气道上皮细胞细胞溶解的试剂盒试剂(表达载体,卡尔斯巴德,CA)和氯仿提取RNA纯化后直接从水相用RNeasy MinElute RNA隔离设备(试剂盒,瓦伦西亚,CA)。对于每一个样本,1μl RNA用于量化的收益NanoDrop nd - 1000分光光度计(NanoDrop技术,威明顿、德)和由安捷伦2100生物分析仪软件质量评估。样本存储在RNA安全(Ambion、奥斯汀、TX)在-80°C到biotin-labeled cRNA准备。

微阵列处理

合成了双链cDNA从1.0到2.0μg使用GeneChip总RNA的一个周期互补脱氧核糖核酸合成装备,其次是双链产品的清理与GeneChip样本清理模块。溶GeneChip标签工具是用于16小时在体外转录反应和Genechip样本清理模块是用于清理biotin-labeled cRNA(所有包从Affymetrix,圣克拉拉,CA)。最终收益率biotin-labeled cRNA NanoDrop光谱分析证实了。对于每一个样本,10μg biotin-labeled cRNA支离破碎,数组和杂化的人类基因组U133 + 2.0(54675探针集)根据Affymetrix协议,处理Affymetrix GeneChip流体站450和扫描Affymetrix GeneChip扫描仪3000 7 ghttp://www.affymetrix.com/support/technical/manual/expression_manual.affx,如前所述4]。捕获的图像进行了分析使用微阵列套件版本5.0 (Affymetrix) 5.0 (MAS)算法。每个数组数据规范化使用GeneSpring 7.3版本软件(安捷伦科技,帕洛阿尔托,CA),原始数据除以50^th百分位数组的所有测量。所有基因表达微阵列数据已经沉积在综合(GEO)网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/;加入GSE11906)。

质量控制参数

选择的三个质量控制标准是针对解决质量控制的三个积分阶段微阵列过程:(1)提取RNA开始材料;(2)合成的互补和反义biotin-labeled cRNA目标;和(3)阵列杂交效率。

RIN

RNA完整性(RIN)数量为每个RNA样本在这个研究是由安捷伦生物分析仪算法生成,使用贝叶斯方法训练,选择预测模型结合特性从一个electropherogram包括pre-region、5 s-region,快速的区域,18 s-fragment开放型,28 s-fraction precursor-region, post-region [41,44]。RIN值的范围从1到10,1表示一个高水平的退化和10显示完整的RNA。RIN评估在180年223年的上皮细胞RNA样本。43 RNA样本不评估RIN之前被处理和杂化微阵列RIN的发展软件和残余RNA是无法进行测试。发表建议的RIN截断值区分质量差和高质量RNA样本不同从3.9到7.819,26,32,40,50,74年]。基于文献表明在误报率大幅增加在数组的起始RNA RIN价值< 7.0,建立了RIN≥7.0的验收标准(33]。RIN值180 RNA准备评估的标准和通过或失败样本分组通过表型,并且每个表型是由生物起源。

GAPDH 3 / 5的信号强度比

每Affymetrix指南,3 ' 5 '的比值可以使用信号强度值作为数组数据质量控制的方法(23,35,36,75年]。GeneChip系统利用聚腺苷酸化互补的寡核苷酸作为逆转录引物的RNA模板开始,第一链cDNA合成和/或效率低下在体外的转录的cRNA可能导致下表示5的一部分记录(34,52]。按照Affymetrix和其他人的建议,接受标准GAPDH 3 / 5的比例≤3.0成立(16,34,35]。为此,对于每个样本杂化微阵列,GeneChip操作软件生成报告文件使用Affymetrix GeneChip操作软件(GCOS),软件系统自动采集的数据通过GeneChip流体站和扫描仪,并提供工作流跟踪实验中,图像和分析数据。质量控制指标的总结报告文件的信号强度值为3和5的探针集GAPDH基因。3到5的信号强度的比值为GAPDH探针集从GCOS的报告文件中提取223样品和那些GAPDH 3 / 5的比> 3.0得分为失败。

Multi-chip正常化比例因子

根据Affymetrix微阵列指南,可比数组在给定实验之间的比例因素最小化总体差异的关键信号强度,从而允许更可靠的检测与生物相关的变化(35,52]。基于223个样本数据的分布,一个标准的比例系数≤10.0成立,上面的样品被认为是展示可怜的杂交和标记效率。所有223个样本比例因子值评估反对这个可接受的水平。为此,杂化微阵列,每个示例的Affymetrix GeneChip扫描仪3000 7 g将目标强度值500和GCOS图像分析软件提取像素值从原始图像文件,生产移动电话文件包含每个探针的荧光强度。CHP文件然后通过GCOS整合从每个玻璃纸文件生成的基因探针对审问到一个信号值和一个没有边际/现在呼吁调查。从玻璃纸CHP文件文件的创建为每个数组生成一个比例因子,应用规范化信号强度从而允许数组之间的比较。比例因子是乘法因子应用于探测器的削减意味着强度平衡这个值到目标强度值。比例因子的值从GCOS报告文件中提取了223个样本。

维护分析基因表达水平

样品,没有任何一个描述的三个标准被认为失败了QC标准,而那些通过了所有三个标准的样品被认为已经通过了质量控制标准。确认这个质量评估策略的有效性,表达水平确定一组100年的持续维护基因和基因表达谱的差异表达这些基因样本之间的比较没有质量控制标准和样品的质量控制标准。控制基因的集合被Affymetrix使用选择先天的知识,他们表现出相对较低的信号变化在不同样品类型和一直被称为出现在大量的不同组织和细胞系(列表可用NetAffx分析中心,http://www.affymetrix.com/support/technical/technotes/hgu133_p2_technote.pdf)。为符号方便,在目前的研究中,我们使用术语“基因”代替“探针”,作为100年的每一个探头组代表一个不同的基因。

统计分析

检查潜在原因QC标准样品之间的值的变化,表型差异的影响或生物起源的样本方差分析进行评估。

关于维护我们使用皮尔逊相关评估相关的基因表达水平为100年维护基因之间的10个样本(2大气道上皮细胞、8小气道上皮细胞)失败的QC标准和24个随机选择的样本,通过QC标准(8气管上皮,8大气道上皮细胞,和8个小气道上皮细胞;看到结果)(76年]。24个样本的身份通过QC标准随机生成使用随机数发生器和样本来源是均匀分布在气管(n = 8),大型气道(n = 8),和小气道(n = 8)。意义两两相关的相关系数的差异,至少一个样品没有质量控制标准及两两相关性,样品通过QC标准评估了非参数分析。变异系数分析是用来确定变化为每个100维护基因的表达水平在10个样本没有质量控制标准和10个样本通过质量控制标准。对于这个分析,10个样本通过QC标准随机选择使用一个随机数发生器,与规定,这些样本匹配与10个样本来源失败(即质量控制标准。、2大气道上皮细胞、8小气道上皮细胞)。变异系数分析的目的,10个样本的数据集通过QC标准被称为“通过”,和10个样本的数据集失败QC标准被称为“失败”。的重要性系数的差异基因表达水平的变化在“通过”和“失败”的数据集是由Mann-Whitney决定U测试。

比较基因表达谱在QC传递给那些失败的QC样品,使用Partek进行主成分分析^®基因组学套件软件(6.8版本版权^©2008)11 COPD受试者没有芯片质量控制和11个COPD受试者通过(性别,年龄,种族,和吸烟史)。Affymetrix HG-U133 + 2.0厘米/秒文件导入到Partek使用健壮Multi-chip平均(RMA)方法。所有54675 log2-transformed小气道基因表达数据映射到主成分保留这些数据的变化,在三维投影,绘制。为了识别特定探针集,两组之间的差异表达,微阵列数据处理使用MAS5算法(Affymetrix微阵列套件版本5软件),也考虑了完美的匹配和不匹配的调查。MAS5-processed数据规范化使用GeneSpring通过设置测量值< 0.01到0.01,规范每个芯片中值表达式值数组,每个基因值表达式值为每个基因在所有数组。两组之间有显著差异表达的基因选择按照下列标准:(1)P的“礼物”样本的20%;褶皱(2)级平均变化表达式值通过QC vs失败QC > 1.5;(3)p < 0.01使用t测试Benjamini-Hochberg调整限制假阳性率(77年]。

我们感谢Angeliki Kazeros, Renat Shaykhiev,拉尔夫大有益的讨论;珍妮的香微阵列芯片核心设施帮助评估;和n·穆罕默德在准备这个手稿。这些研究支持,部分R01 HL074326;和P50 HL084936。

从属关系

1. 遗传医学系,威尔康奈尔医学院,纽约,纽约,美国

   蒂娜拉曼,蒂莫西·P O ' connor,尼尔·R哈克特Ben-Gary哈维,Marc Attiyeh,大卫·T见鬼,马修奶头和罗纳德·G晶体

2. DNA微阵列的核心,生命科学核心实验室中心,伊萨卡康奈尔大学,纽约,美国

   魏王

3. 肺和危重病医学,威尔康奈尔医学院,纽约,纽约,美国

   Ben-Gary哈维和罗纳德·G晶体

相应的作者

对应到罗纳德·G水晶。

作者的贡献

所有作者都阅读和批准了最终版本的手稿。TR进行了微阵列实验,进行了分析和帮助起草手稿。来和NH参与研究设计和统计分析,监督数据收集和帮助起草的手稿。WW辅助数据分析和研究设计使用BGH协调所有的临床样品的收集用于微阵列分析法妈妈,弟弟,和太处理样品和微阵列实验进行RGC研究的构想,并协助在研究设计和起草了手稿。

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