函数HAb18G / CD147在入侵宿主细胞的严重急性呼吸系统综合症冠状病毒

文摘

识别的功能HAb18G / CD147在入侵宿主细胞的严重急性呼吸道综合征(SARS)冠状病毒(x),我们分析了蛋白质之间的相互作用HAb18G / CD147、还有(CyPA)和冠状结构蛋白coimmunoprecipitation和表面等离子体共振分析。虽然没有冠蛋白被发现直接绑定到HAb18G / CD147、冠状的核衣壳蛋白(N)是绑定到CyPA,这与HAb18G / CD147互动。进一步的研究表明,HAb18G / CD147、跨膜分子,是293个细胞上高表达,CyPA结合冠状。HAb18G / CD147-antagonistic肽(美联社)9日,美联社HAb18G / CD147、高速率的绑定到293细胞和冠的抑制作用。这些结果表明,HAb18G / CD147、由CyPA绑定到冠N蛋白,发挥功能性作用在促进入侵宿主细胞的冠。我们的研究结果提供了一些证据冠和入侵的细胞学的机制提供分子依据筛选防治非典药物

严重急性呼吸系统综合征(SARS)冠状病毒(x),病原体确定负责非典,造成灾难性的后果世界各地在2002年底(1,2]。冠如何感染细胞仍然不清楚,其他浸的结果研究表明,浸感染宿主细胞通过直接或间接的病毒蛋白之间的相互作用和细胞蛋白表达在单位膜(2 - 5]。还有(CyPA)是一种广泛分布的细胞蛋白质和被认为帮助蛋白质折叠和作为伴侣。它可以集成与某些病毒的病毒粒子,如hiv - 1 (6和牛痘病毒7]。通过与细胞受体交互或通过其他途径,综合CyPA在病毒入侵或复制过程中发挥作用。CD147(称为“EMMPRIN”(8]和“遗传性”[9)是一种跨膜糖蛋白,属于免疫球蛋白超家族。这是一个受体CyPA和导致病毒感染或炎症6,10]。HAb18G / CD147、开发和确认是CD147家族的成员在我们的实验室,参与肿瘤转移、炎症和病毒感染(11-19]。灵感来自已知CD147和hiv - 1之间的关系,我们进行了本研究调查的可能功能HAb18G / CD147在入侵宿主细胞的冠

材料和方法

病毒和细胞冠(BJ04)和293个细胞(写明ATCC crl - 1573)由中国疾病控制中心和预防(中国疾病预防控制中心)。细胞培养在杜尔贝科工程管理硕士(Gibco BRL)含10%胎牛血清(Gibco BRL)

肽HAb18G / CD147-antagonistic肽(美联社)9 (AP HAb18G / CD147在我们的实验室中,获得由12 aa残留物)(至24],CB-2(随机合成肽还含有12个aa残留物,作为消极的控制),和biotin-AP-9被CL Bio-Scientific合成。由高压液相色谱纯度,化验,> 95%,氨基酸序列和分子量,分别如下:AP-9, YKLPGHHHHYRP和1541.09;CB-2 LHRHSHGHSYTS和1389.50;和biotin-AP-9 biotin-YKLPGHHHHYRP和1767.69

Coimmunoprecipitation (Co-IP)分析深刻的哺乳动物Co-IP工具包(皮尔斯)和ECL +免疫印迹检测系统(Amersham法玛西亚)使用按照制造商的指示。分析之间的交互HAb18G / CD147和CyPA, 100μg HAb18G / CD147 (HAb18G / CD147的细胞外片段重组,准备在我们实验室)和等量的孵化CyPA (Alexis生化)在室温下过夜(RT)。被添加到混合凝胶,再加上200年μg鼠标反HAb18G / CD147分子单克隆抗体(MAb) HAb18(我们实验室的准备)的男性],孵化与温柔的立式圆筒形混合4 h。结合蛋白被筛选了之后,整除的洗脱液进行了分析与兔免疫印迹开发反CyPA抗体(稀释1:20 00;Calbiochem-Novabiochem)和辣根过氧化物酶(合)共轭山羊anti-rabbit免疫球蛋白(稀释1:5000;Amersham淀粉微球)。购买CyPA(2.5μg)作为阳性对照

分析CyPA之间的交互和冠状结构蛋白(膜[M], [S],信封(E)和核衣壳[N];由中国疾病预防控制中心),加上200μg CyPA凝胶,用作诱饵蛋白。鼠标4蛋白抗体(稀释1:1000)和HRP-conjugated山羊anti-mouse免疫球蛋白(稀释1:5000)被用于随后的免疫印迹分析。5毫克的蛋白质作为阳性对照。建立了空白控制按照制造商的指示

BIAcore光谱学表面等离子体共振分析,通过使用BIAcore X生物传感器系统(BIAcore),所述其他地方(34]。HAb18G / CD147或CyPA固定化在research-grade CM5传感器芯片(BIAcore),浓度为100μg /毫升10 L更易与醋酸钠(pH值6.0),利用胺耦合工具包提供的制造商。大约2000共振单元的HAb18G / CD147或CyPA固定化在这些条件下。未反应的根与乙醇胺表面上被封锁,和芯片以HEPES-buffered盐水含有10更易与L玫瑰(pH值7.4)

分析25°C, 5μL /分钟的流量测定对利率和均衡绑定和50μL /分钟把利率的决心。确定哪些蛋白质可以被冠CyPA或HAb18G / CD147, S, M, E, N蛋白冠在HEPES-buffered生理盐水稀释至1μg /毫升的捕获CyPA或HAb18G / CD147表面。表面是通常与100更易与L盐酸再生和0.2 mol / L三羟甲基氨基甲烷缓冲液

评估CyPA N蛋白的亲和力,N蛋白稀释至40,32岁,24岁,16日和8 nmol / L CyPA捕获的表面。生物传感器数据准备动力学分析,通过归零时间和响应之前第一次注射。修正折射率变化和特异性的绑定,绑定反应中生成控制实验减去从CyPA-N反应生成的蛋白质相互作用。绑定数据被全球安装下面的反应机理,CyPA和N蛋白是由A和B,分别为:。一个平衡离解速率常数(K_d)从动力学速率常数计算了非线性拟合的主要sensorgram数据利用BIAevaluation软件(版本3.1;BIAcore)

Flow-cytometric分析293细胞密度10⁶细胞/毫升,孵化与10μL异硫氰酸荧光素(FITC)共轭anti-CD147抗体(Pharmingin)或10μL FITC-conjugated鼠标IgG1(控制;Pharmingin)在黑暗中30分钟在4°C。与PBS洗一次后,细胞与1%多聚甲醛固定,分析了使用FACSCalibur流式细胞分析仪(Becton Dickinson)和CellQuest软件(正)

分析AP-9绑定、细胞被山羊血清30分钟和孵化biotin-AP-9(最终浓度,160μg /毫升)60分钟,清洗和处理5μL avidin-FITC (Pharmingin)在黑暗中在4°C 60分钟。固定和数据分析进行如上所述

共焦显微镜293个细胞感染冠(BJ04)培养消毒盖上滑过一夜,然后在PBS和固定冷丙酮洗了30分钟。分析AP-9绑定,这些细胞被孵化和25μg biotin-AP-9 avidin-Cy3(1:10 0稀释;在黑暗中σ)一夜之间在4°C。AP-9分析阻塞,25μg biotin-AP-9孵化了2.5μg HAb18G / CD147 2 h rt,然后,混合物(biotin-AP-9和HAb18G / CD147)和avidin-Cy3被添加到细胞和孵化在黑暗中一夜之间在4°C。消极的控制,只有avidin-Cy3治疗,同时成立。利用immuofluorescence double-staining方法,这些细胞被孵化25μg HAb18和等量的biotin-AP-9为2 h rt与PBS洗后,这些细胞被孵化与avidin-Cy3(稀释1:10 0)和FITC-labeled山羊anti-mouse免疫球蛋白(1:10 0稀释;武汉博士德Bioengneer)一夜之间在黑暗中在4°C。仔细观察是由使用共焦显微镜(IX-7;奥林巴斯)与一个物镜(UPLAPO;×20×40)和图像采集软件(FLUOVIEW阵线300;奥林匹斯山)

Immunoelectronic显微镜293个细胞感染冠(BJ04)收获和颗粒状。细胞治疗4% glutaral在4°C为30分钟,然后洗了两次磷酸盐缓冲剂和处理1%四氧化锇(Polysciences)后1.5 h rt,脱水和嵌入式,超薄部分细胞的准备

间接黄金colloid-labeling方法用于检测CyPA和HAb18G / CD147的本地化。在蒸馏水洗后3分钟,超薄部分处理1% H₂O₂5分钟和孵化与正常山羊血清(稀释1:75)10分钟在RT和兔子反CyPA抗体(稀释1:25;Calbiochem-Novabiochem)或鼠标反CD147抗体(稀释1:50;Abcam) 16 h在4°C和1 h rt,洗后在PBS 3倍和蒸馏水,部分是处理PBS(包含1%的牛血清白蛋白(BSA) [pH值8.2])5分钟,然后孵化了黄金colloid-labeled蛋白质(稀释1:50;黄金粒子,直径10海里;由军事医学科学院(中国))在1 h RT和连续沾5%醋酸铀和醋酸铅

然后,金胶体双标记方法被用来确定HAb18G colocalization / CD147和AP-9。洗后,部分接受1% H₂O₂和正常山羊血清(稀释1:75),如上所述。孵化后与PBS(包含1% BSA [pH值8.2])5分钟,黄金的细胞混合孵育colloid-labeled AP-9(稀释1:400;直径的黄金粒子,20 nm;由军事医学科学院(中国))和鼠标反CD147抗体(稀释1:50),然后与黄金colloid-labeled孵化蛋白质(稀释1:50)1 h RT和连续沾5%醋酸铀和醋酸铅。小心是由使用电子显微镜的观察jem - 100 sx显微镜(JEDL)

细胞病理效应的分析293个细胞(4×10⁵细胞/毫升)被种植到96孔板(配角),在5%的股份有限公司₂为24小时37°C。分析AP-9 293细胞的毒性,二倍稀释系列AP-9(范围3893.4 - -7.6μmol / L), CB-2(消极的控制;范围、4318.1 - -8.4μmol / L)和gancyclovir(一种抗病毒化学药物从湖北团队药店购买)注入(积极的控制;范围内,23508。2 - 45.8μmol / L)被添加到细胞。TD₀和道明₅₀测定。分析冠的毒性(BJ04) 293个细胞,病毒8稀释(10⁻¹-10年⁻⁸)被添加到细胞,确定TCID₅₀冠(BJ04)。的抑制作用分析AP-9,细胞与100 TCID孵化₅₀冠(BJ04) 2 h。上层清液被丢弃后,2倍稀释TD系列₀AP-9(范围973.3 - -1.9μmol / L), CB-2(范围359.8 - -0.7μmol / L),和gancyclovir(范围23508。2 - 45.8μmol / L)注入被添加到适当的井。建立了正常细胞病毒控制和控制。每天观察细胞病变效应对上述细胞利用倒置显微镜(XSZ-D;中国南京光学仪器总厂)与一个物镜(×10)和一个相机(Ricon-5)。观察形态学变化<细胞被标记为“+”总量的25%,在25% - -50%被标记为“+ +”,在51% - -75%被标记为“+ + +”,而在76% - -100%被标记为“+ + + +”。道明₅₀,道明₀,TCID₅₀,集成电路₅₀、麦克风和治疗指数(TI)的计算是通过使用Reed-Muench方法。(抑制作用分析,当“+ + +”或“+ + + +”标志是病毒控制,测试停止。)

结果

N蛋白之间的相互作用、CyPA HAb18G / CD147表面等离子体共振分析表明,没有一个冠,M, E、N蛋白直接绑定到HAb18G / CD147。然而,N蛋白被发现与CyPA交互。在Co-IP分析,当混合物HAb18G / CD147和CyPA补充道,CyPA被发现间接绑定到凝胶,由特定的交互HAb18G / CD147马伯,HAb18,用作捕获抗体。因此,HAb18-HAb18G / CD147-CyPA复杂的形成。后coimmunoprecipitated CyPA被筛选了,可见通过与anti-CyPA抗体进行免疫印迹分析,证实了CyPA之间的交互和HAb18G / CD147 (图1一个)。Co-IP分析进一步证实了N蛋白和CyPA之间的互动。自从CyPA用作诱饵蛋白,可见coimmunoprecipitated N蛋白免疫印迹分析与anti-N蛋白抗体(图1 b)。N蛋白的结合动力学(在不同浓度)CyPA由表面等离子体共振分析,决定的K_d0.04μmol / L (图1 c)

定量分析的表达式HAb18G / CD147 SARS-CoV-permissive AP-9 293细胞和绑定HAb18G / CD147发现293个细胞上高表达,表达率为98.56% (图2一个)。AP-9被显示绑定到检测到细胞,结合率为98.15% (图2 b),它是非常接近的HAb18G / CD147表达率相同的细胞。AP-9也有类似的平均荧光强度HAb18G / CD147

细胞定位HAb18G / CD147和AP-9 SARS-CoV-infected 293细胞后被荧光素追踪,利用激光扫描共焦显微镜,AP-9被发现有高亲和力的检测细胞。与HAb18G / CD147孵化后,绑定的AP-9细胞明显减少(图3一)。利用免疫荧光double-staining方法,HAb18G / CD147和AP-9被认为在相同的结合位点(细胞膜和细胞质)SARS-CoV-infected 293细胞(图3 c)

亚细胞定位CyPA, HAb18G / CD147和AP-9 SARS-CoV-infected 293个细胞被黄金colloid-labeled追踪后抗体,利用电子显微镜,CyPA在场或冠状的表面(图4一),这表明CyPA结合冠状。HAb18G / CD147位于检测细胞表面和单位膜,尤其是在膜的细胞质内质网(ER) (图4 b)。金胶体双标记法,结果表明,AP-9出现在同一网站就像HAb18G / CD147 (图4 c)

抑制作用AP-9冠细胞病理效应的分析结果表明,AP-9浓度的973.3μmol / L, 293细胞TD是无毒的₅₀和道明₀为AP-9 1946.7和973.3μmol / L,分别。的TCID₅₀冠293细胞是10⁻³。当100年TCID₅₀冠状的通常添加到293个细胞培养,细胞被感染和坏死。AP-9添加一个麦克风后,感染细胞逐渐恢复,而AP-9-untreated病毒控制细胞坏死。的集成电路₅₀、麦克风和TI AP-9 60.8μmol / L, 30.4μmol / L,和32岁的分别而积极的控制(gancyclovir注入)91.8μmol / L, 45.8μmol / L和256年,分别;的TI -控制(CB-2)只有4

讨论

据报道,CyPA可以明确纳入hiv - 1病毒粒子,可以显著提高细胞的早期步骤hiv - 1感染。CD147可以通过相互作用促进hiv - 1感染病毒相关CyPA [6]。目前的研究表明,HAb18G / CD147 CD147家族的一员,可以与CyPA交互,这可能与SARS病毒和入侵宿主细胞发挥功能作用的冠。对冠AP-9有抑制作用

冠是已知4结构蛋白:S, M, E, N S, M,冠和E蛋白是膜蛋白,和N蛋白必将在核心病毒RNA。年代其他已知的蛋白质浸被认为负责绑定到宿主细胞受体和膜融合(2]。在目前的研究中,我们发现N蛋白可能发挥作用在冠状入侵宿主细胞。N蛋白注定CyPA,但年代,M,蛋白质和维生素E。然而,CyPA在场只有表面上的成熟的冠状,由电子显微镜观测到的。这一发现似乎矛盾的发现N蛋白位于病毒的核心。这种差异可以部分解释以前的报告发现,CyPA绑定到病毒蛋白质在核心可以从核心搬迁在成熟的病毒(病毒表面35]。本研究的结果也证实CyPA之间的交互和HAb18G / CD147、由Co-IP分析,表明CyPA可能冠之间充当中介N蛋白和HAb18G / CD147在入侵宿主细胞的过程中冠。flow-cytometric分析、共焦显微镜和immunoelectronic显微镜,我们发现HAb18G / CD147 SARS-CoV-permissive 293个细胞中高度表达,它是位于细胞膜和细胞质中的单位膜的膜(特别是ER)作为一个跨膜分子。在目前的研究中,结合位点的AP-9被证实HAb18G / CD147分子在293年受感染的细胞,和AP-9可以有效地阻止结合位点HAb18G / CD147在细胞膜和细胞质的单位膜293个细胞,体外冠的抑制作用。从这一发现,我们可以得出结论,HAb18G / CD147功能分子的冠状病毒感染宿主细胞

HAb18G / CD147作为一个功能的分子机制可以推断如下:(1)CyPA必将N蛋白冠状入侵宿主细胞后,与CyPA迁址至病毒表面的成熟病毒(35];(2)暴露CyPA分子与HAb18G / CD147在细胞膜,导致其他宿主细胞的感染;和(3)AP-9块HAb18G / CD147、防止病毒感染后病毒完成他们的生命周期

也被报道,浸,入侵宿主细胞的生命周期包括N蛋白组装完整复制RNA的RNA蛋白质复杂的形式,这是与M蛋白嵌入式相关的膜ER和病毒粒子,形成的核衣壳复杂的味蕾为ER (2,36]。冠被认为是类似的过程的生命周期(36]。因此,我们推断,冠N CyPA相关蛋白可能与HAb18G / CD147位于膜ER和病毒粒子的相互作用可以促进形成或萌芽到ER。AP-9,小肽,可以防止病毒粒子进入细胞或萌芽到形成,通过阻断HAb18G / CD147位于ER。因此,HAb18G / CD147的过程中扮演着重要的角色由冠入侵宿主细胞

HAb18G的功能/ CD147在入侵宿主细胞的冠和一个清晰的理解机制负责过程需要进一步确认。然而,目前的研究可能提供一些证据冠和可能入侵的细胞学的机制提供了重要的分子基础筛选一些防治非典药物,如抗体、多肽、immunocomplex,小分子化合物

确认

我们感谢李德兴Mifang梁,胜利Bi,英华陈,宏伟,Bingfeng Wang Jian Liu和梅黄,对他们的帮助在我们的实验中,和周Yumei Wenli严,和彭粉丝,仔细阅读手稿

引用