文摘
Non-typeable流感嗜血杆菌(NTHi)是最常见的病原体在初级纤毛运动障碍(PCD)的病人。我们提出,纤毛蠕动异常和低气道一氧化氮(NO)水平在气道上皮细胞纤毛运动的病人可能宽容NTHi殖民化和生物膜的发展。
我们使用一个主上皮细胞共培养模型研究NTHi感染。主气道上皮细胞纤毛运动和non-PCD患者分化睫毛使用一个气液界面培养然后NTHi培养。
NTHi依从性上更大的纤毛上皮细胞相比non-PCD细胞(p < 0.05)和NTHi纤毛上皮显示更多的分布在生物膜聚合NTHi (p < 0.001)。除了有缺陷的纤毛蠕动,纤毛细胞没有明显不同于non-PCD上皮细胞在睫毛和上皮完整性的程度或细胞因子,LL-37,没有生产。治疗原发性纤毛上皮细胞使用外源性没有抗生素相比,生物膜显著降低NTHi可行性和抗生素治疗。
纤毛功能受损的主要缺陷在气道纤毛上皮基本易感性NTHi生物膜发展而non-PCD上皮。虽然没有类似的反应,用抗生素使用的目标没有增强杀害NTHi在生物膜中,提出一种新的治疗方法。
文摘
体外研究显示PCD航空风险NTHi生物膜殖民;小说没有药物克服抗生素耐受性http://ow.ly/GrXC30e4Tqv
介绍
运动型在气道纤毛导致黏膜纤毛的清除(MCC),这是基本的保护宿主免受呼吸道感染。原发性纤毛运动障碍(PCD)是一种遗传异质性疾病的特点是通过破坏MCC纤毛功能异常。病人的特点是复发和慢性窦肺感染,慢性中耳炎(OM)和进步化脓性肺病从小[1]。
Non-typeable流感嗜血杆菌(NTHi)是一种革兰阴性球杆菌,肺炎球菌,最常见的细菌性病原体孤立于儿科患者的上、下呼吸道纤毛运动(2)和慢性OM (3]。NTHi生物膜存在在活的有机体内(4,5),体外在腺上皮或中耳上皮切片从OM的孩子6,7]。
细菌生物膜的自组织聚集笼罩在一个exopolymeric矩阵与呼吸道黏膜表面(8−10)和存在于慢性OM(上、下呼吸道感染6),囊性纤维化(CF) [11),慢性鼻窦炎(12和non-CF支气管扩张13]。生物膜的发展有助于慢性化脓性呼吸道疾病的病理生理学通过增加细菌反抗抗生素治疗和宿主先天免疫反应(14,15]。尽管纤毛功能异常的影响呼吸道感染的动物模型研究了bacteria-virus合并感染(16,17),细菌感染没有被广泛研究了PCD。
不理解的原因,患者PCD气道一氧化氮(NO)水平较低与non-PCD患者相比(18,19]。不,由宿主上皮细胞和先天免疫细胞,可以在响应低一些呼吸道细菌感染(20.,21]。我们以前观察到的没有水平没有区别未感染的主要培养PCD和non-PCD上皮细胞,符合基线由其他人没有水平的报道(20.,22]。然而,我们发现纤毛上皮细胞显著增加生产以应对与促炎细胞因子刺激或者NTHi感染,类似于non-PCD细胞(22]。的易感性金刚石与NTHi呼吸道感染儿童,我们从患者提出,上皮细胞纤毛运动可能是宽容增加NTHi依从性和随后的生物膜的发展。为了解决这个假设,我们开发了一个人类主要使用金刚石或non-PCD气道纤毛上皮细胞共培养模型,区分在一个气液界面(ALI)和金刚石临床感染NTHi隔离。在目前的研究中,我们使用了NTHi ALI-epithelial细胞共培养模型(22更广泛调查:1)NTHi气道细胞反应,包括没有生产,2)的能力biofilm-targeted没有NTHi的捐助者增加抗生素治疗。
材料和方法
研究参与者
我们招募了15个患者诊断为纤毛运动,根据2009年欧洲指南(23),10个健康志愿者和9个患者呼吸道症状不是由纤毛运动引起的(表S1)。我们以前诊断方法的细节发表在我们的国家纤毛运动中心(24]。这项研究得到了英国国家卫生服务研究伦理批准(06 / Q1702/109和08年/ H0502/126),我们获得书面知情同意。
文化和生物膜发展临床NTHi隔离从PCD的病人
NTHi隔离从四个儿科金刚石病人(HI1-HI4)亚文化从冻结的股票25),验证通过革兰氏染色剂,V和X诊断盘测试和聚合酶链反应(6]。在脑心浸液培养基培养NTHi是补充haemin和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(sBHI) 37°C OD600年0.1 (∼2×108CFU·毫升−1所有压力测试)25]。生物膜的增长决定在体外一式三份的实验结晶紫(CV)染色法和集落形成单位(CFU)指望巧克力血琼脂(CBA) [26,27),通过扫描电子显微镜和共聚焦显微镜使用荧光原位杂交(鱼)7,28]。
上皮细胞和NTHi共培养模型
详细的信息关于上皮细胞复苏和随后的分析可在补充材料和已发表的地方。简单,主要人类鼻腔上皮细胞培养在一个阿里,直到分化和纤毛29日,30.]。我们使用在1月内ALI-cultured细胞。NTHi是培养的上皮细胞顶端表面五PCD和九non-PCD科目并与未受non-PCD控制。我们接种大约1×108CFU·毫升−1500年μL不使用阿里中等(100年感染复数)到ALI-cultured transwell膜上细胞。培养在37°C / 5%孵化有限公司272 h与日常媒介变化和洗汉克斯缓冲盐溶液(hbs)删除之前non-adherent细菌分析(25]。
Transepithelial电阻(te)测量每日和背景减去确认上皮完整性(EVOM 2上皮voltohmmeter世界精密仪器,萨拉索塔,佛罗里达州,美国)(31日]。纤毛拍频(CBF)和面积百分比运动型NTHi之前和期间对ALI-cultured non-motile纤毛细胞培养是衡量整个领域(ImageJ快速傅里叶变换分析https://imagej.net/与内部编写的插件)的高速视频显微镜视频。简而言之,样本成像在37°C用倒置的奥林巴斯显微镜IX71×40物镜(奥林巴斯,Southend-on-Sea,英国)(1场= 90×95µm)和PC2 Photron FASTCAM高速视频记录纤毛运动在250帧每秒29日]。
描述的NTHi气道纤毛细胞
细菌和上皮细胞从transwell刮膜sBHI,连续稀释,镀在CBA和37°C / 5%孵化有限公司2之前CFU枚举(实验一式三份)。我们还发现NTHi阿里文化样本使用共焦显微镜通过鱼Hinf 16 s探测器(6,7),在纤毛co-labelledβ-tubulin免疫荧光(32]。连续领域跨膜直径是成像使用一个SP5共焦激光扫描显微镜(徕卡微系统,米尔顿凯恩斯,英国)和NTHi体积/字段被Volocity计算3 d图像分析软件(版本6.0.1中;英国考文垂PerkinElmer)。选择transwell膜被移除和加工和使用范广达200扫描电子显微镜成像(范,埃因霍温,荷兰)25,28]。
细胞因子和LL-37 NTHi感染的反应
管基底介质来自阿里文化接种前被冻结,然后每天与NTHi共培养后。我们测量纤维母细胞生长factor-β(FGF-β)、粒细胞集落刺激因子(g - csf)、粒细胞−巨噬细胞集落刺激因子(gm - csf)、白细胞介素- 6 (il - 6)、interleukin-1受体拮抗剂(IL-1Ra)、单核细胞趋化蛋白1 (MCP-1)、巨噬细胞炎性protein-1α(MIP-1α),肿瘤坏死factor-α(TNF-α)和血管内皮生长因子(VEGF) fluorokine人类multianalyte分析(MAP)测定Bio-Plex 200分析仪检测(研发系统,阿宾顿,英国)在上层清液(50µL每96井一式两份)(补充材料)33]。Interleukin-8测量分别由人类引发DuoSet酶联免疫试剂盒(DY208、研发系统)和辣根过氧化物酶(合)发现了衬底ThermoMax标仪(美国分子器件、桑尼维尔CA)按照制造商的指示。
顶端上层清液(100µL PBS) ALI-cultured细胞共培养前冻结,然后每天NTHi接种。在硝化纤维膜和样本点immunolabelled一夜之间(4°C) 1:1000兔子anti-LL-37抗体(AB64892;Abcam,剑桥,英国)其次是1:10 000合共轭山羊anti-rabbit二级抗体。洗后,Immuno-star鲁米诺化学发光底物使用VersaDoc成像仪检测和量化的数量一个v4.6.9软件(Bio-Rad实验室,沃特福德,英国)。LL-37浓度(重复实验)与标准曲线比较连续稀释LL-37重组肽(AB140725;Abcam)。
没有生产,气道上皮细胞和治疗外源性没有
Transwell膜活ALI-cultured上皮细胞治疗10µM 4-amino-5-methylamino-2′, 7′二乙酸-difluorofluorescein (DAF-FM)评估的存在不34]。免疫荧光标签是用来定位没有合酶(NOS)(神经元(nNOS),诱导(间接宾语)和内皮(以挪士)同功酶固定上皮细胞培养(32使用共焦显微镜)。
ALI-cultured上皮cell-NTHi培养(72 h)与哈佛商学院洗除去non-adherent细菌(25]然后处理4 mg·毫升−1阿奇霉素,50µM cephalosporin-3ʹ-diazeniumdiolate没有供体药物前体PYRRO-C3D,或两者的结合阿奇霉素和PYRRO-C3D 2 h。所有治疗都准备在哈佛商学院有1% DMSO(还用作治疗控制)和NTHi cfu枚举在CBA如上(n = 4) (25]。
统计方法
学习任务和Mann-Whitney u测验进行使用Graphpad棱镜软件(版本6.0,2012年,Graphpad软件,Inc .)。Sidak-Bonferroni方法被用来适应假定值为多个比较t。p < 0.05显示统计学意义。
结果
上皮细胞和NTHi培养
NTHi坚持气道纤毛上皮细胞纤毛运动和non-PCD病人。在72 h,然而,更可行的NTHi 3.8×106cfu (±7.5×105在纤毛上皮细胞相比,2.0×106cfu (±4.8×105)non-PCD上皮细胞(p < 0.05) (图2一个与扫描电镜数据(),在协议图2 c, d)。纤毛细胞怀有离散附着细菌细胞的总量(生物膜)(图2 c)与奇异分布式NTHi细菌细胞non-PCD上皮细胞(图2 d)。
我们通过共焦显微镜成像培养使用NTHi鱼标签和一个anti-β-tubulin抗体标签纤毛。正交剖面图像分析的共焦显微镜Z-stacks表明,均值±扫描电镜NTHi生物质数量(每视野)四倍PCD ALI-cultured上皮细胞(710±150μm3)比non-PCD原电池阿里文化(160±20μm3)(p < 0.001) (图2 b)。金刚石主要聚合NTHi是明显在生物膜细胞功能失调或静纤毛上皮细胞(图2 e)。相比之下有少NTHi标签non-PCD与正常的纤毛上皮细胞(图2 f)。
纤毛细胞显示静态(n = 4)或缓慢运动障碍的(n = 1)纤毛。non-PCD上皮细胞的CBF仍在正常范围内(11日至20日Hz)在72 h (NTHi共培养,表明NTHi并不影响纤毛蠕动(图3一)。睫毛ALI-cultured上皮细胞的金刚石和non-PCD相似,通过光学显微镜和扫描电子显微镜观察(图3 b)。面积百分比能动的纤毛每视野non-PCD ALI-cultured细胞在培养期间并没有改变non-PCD气道细胞(图3 c)。三通是用来测量上皮细胞屏障功能之前和之后的顶端NTHi接种到纤毛ALI-cultured主气道细胞。三通高原之前达到NTHi感染相同的金刚石和non-PCD细胞在培养和维持72 h,证明上皮完整性(假定值的范围从0.35到0.93)(图3 d)。
细胞因子和LL-37 NTHi感染的反应
均值±SEM阳离子浓度LL-37肽分泌上皮细胞ALI-cultures NTHi接种后24小时达到高峰,8.8±2.9倍增加PCD和3.8±0.6倍增加non-PCD样品观察,但值仍在接种后组在基线变异和(图4 a, b)。FGF-β的水平,g - csf, gm - csf, VEGF或IL-1Ra, il - 6,引发,MCP-1, MIP-1α和TNF-α金刚石或non-PCD细胞在基底介质,采样前或期间每天72 h (NTHi培养(图4 c)没有显著差异,表明气道纤毛细胞产生的细胞因子和趋化因子类似non-PCD细胞。这些数据表明,PCD和non-PCD NTHi上皮细胞产生相似的防御反应。
没有生产,气道上皮细胞和治疗外源性没有
患者的气道没有水平极低的纤毛运动(18,19]。然而,我们发现使用nNOS上皮细胞的免疫荧光标签,进气阀打开,以挪士同功酶存在于纤毛PCD和non-PCD细胞(图5)。此外,我们发现没有使用DAF-FM PCD和non-PCD阿里文化样本,强烈遇不发光反应(图5)。
我们先前已经表明,没有调节NTHi新陈代谢在体外(25]。因此,我们测试了如果外生没有治疗影响NTHi在纤毛纤毛上皮细胞生长。上皮cell-NTHi培养治疗与cephalosporin-3ʹ-diazeniumdiolate没有捐赠的药物前体,PYRRO-C3D,版本没有激活后β-lactamases [25]。我们发现4 mg·毫升−1阿奇霉素治疗,超过浮游的最低抑制浓度(1μg·毫升−1),未能杀死生物膜NTHi纤毛上皮细胞。相反,当PYRRO-C3D一同使用阿奇霉素,NTHi生存能力下降近3日志(图6)。这些结果表明,金刚石纤毛上皮细胞在生物膜NTHi是抗生素治疗的宽容,宽容是废除β-lactamase-mediated交付的NTHi没有从前体药物。
讨论
我们的主要发现是,NTHi形成生物膜附着在ALI-cultured PCD气道纤毛细胞显著超过non-PCD控制72 h的共培养,唯一原因区别是金刚石样品的纤毛功能障碍。宿主-病原体相互作用以来没有被广泛研究了PCD的上下文中,这些结果是小说。NTHi是流行在PCD和其他疾病在儿童与受损的黏膜纤毛的间隙有关,如CF (35)和慢性OM (36]。NTHi生物膜发展特征的慢性或复发性呼吸道感染的病理生理学CF和慢性OM (6,4,13),但对NTHi感染中。我们提出,纤毛蠕动在气道上皮细胞纤毛运动异常患者可能宽容NTHi殖民化和生物膜的发展。据我们所知,我们的两极分化气道上皮阿里文化感染模型是第一个检查NTHi对主气道纤毛细胞纤毛运动的影响病人和non-PCD捐助者。生物膜发展以前演示与年轻的CF患者使用Calu-3 NTHi分离细胞培养(11]。然而,由于Calu-3细胞不会纤毛虫,这个模型没有评估纤毛NTHi依从性和生物膜发展的作用[37]。
我们比较PCD和non-PCD上皮细胞反应,包括炎症和抗菌蛋白和分泌上皮完整性、睫毛和纤毛功能后NTHi培养。细胞因子的生产,包括促炎细胞因子和趋化因子参与白细胞招聘、和人类中抗菌肽的ll - 37越分泌能较量的PCD和non-PCD培养。上皮完整性也可比气道上皮细胞NTHi培养。尽管所有PCD ALI-cultured上皮细胞功能失调的纤毛运动,与正常non-PCD上皮细胞(表S1),总睫毛pre-infection相似,通过扫描电镜和immunofluorescent标签使用共焦显微镜β-tubulin的纤毛。重要的是,NTHi感染没有影响正常的纤毛功能(CBF和百分比的能动的纤毛)non-PCD ALI-cultured气道细胞实验时间。综上所述,我们发现唯一的区别PCD和non-PCD纤毛蠕动,支持的假设不正常的纤毛功能中增加NTHi生物膜发展的风险。
PCD的病人表现出异常低气道(特别是鼻)没有水平,仍在争论的原因(18]。以前发现的主要ALI-cultured纤毛上皮细胞无法提高没有水平后早期感染肺炎链球菌,这表明没有生物合成和伊诺感应异常在纤毛上皮细胞(20.]。相比之下,这里的工作扩展了以前的研究表明,没有生物合成金刚石和non-PCD上皮细胞相似,结构上和后NTHi感染(22]。我们现在还没有使用互补的方法和评估表明,PCD和non-PCD细胞表现出相似的生物合成和NOS同工酶表达与纤毛co-localisesβ-tubulin标志,在共培养。这些研究支持我们的之前的数据显示,纤毛上皮细胞能够合成。原发性上皮细胞可能没有反应,然而,不同类型的细菌,特别是PCD NTHi隔离不诱导细胞毒性影响观察肺炎链球菌(38]。
我们的结果表明,NTHi是出现在matrix-enclosed骨料附着两极分化纤毛纤毛上皮细胞(8]。生物膜的发展是众所周知的减少抗生素治疗的疗效。我们的数据表明,NTHi生物膜对气道上皮细胞培养宽容的阿奇霉素治疗,很容易杀死浮游NTHi [25),在减少NTHi可行性是无效的。相比之下,与小说前药PYRRO-C3D合并施打阿奇霉素,专门设计的目标没有释放细菌β-lactamase激活后,NTHi生存能力减少了近3登录纤毛上皮细胞。这些结果支持最近的研究肺炎链球菌(28]和NTHi [25)显示,没有在调节过程中发挥作用在这些呼吸道细菌代谢活动,导致抗生素敏感性增加。重要的是,我们的呼吸道上皮细胞共培养模型允许平移调查anti-NTHi生物膜治疗与人类主要细胞生理相关的上下文。这些结果表明,辅助外生不治疗管理结合抗生素治疗感染需要进一步调查。
这项研究有一些局限性。首先,因为PCD病例罕见(≈1:10 000),共培养实验正在挑战在大量复制。其次,我们检查了数量有限的临床NTHi分离培养。第三,我们的研究集中于上皮细胞和没有调查其他先天很重要的细胞反应NTHi宿主防御,或可能导致疾病进展。尽管有这些限制,我们的研究表明,NTHi生物膜中发挥作用的慢性呼吸道感染中,为进一步的工作提供的假说驱动的研究问题评估的发病机制。
总之,这项研究报告的关键观察关于NTHi感染初级纤毛上皮细胞纤毛运动的病人。首先,纤毛功能异常中似乎更宽容NTHi生物膜发展non-PCD气道细胞正常的能动性。其次,ALI-cultured主要气道细胞纤毛病人似乎主管NTHi感染后几个防御反应,表现出类似的细胞因子和LL-37生产non-PCD气道细胞。第三,虽然在大多数情况下鼻不异常低的水平的纤毛运动,ALI-cultured金刚石病人气道细胞后产生类似的水平没有NTHi相比non-PCD细胞共培养。第四,这项研究表明我们的培养模式提供了一个健壮的试验研究抗感染治疗。最后,我们表明,外源目标没有增强抗生素杀死NTHi金刚石上皮细胞在生物膜上生长,表明感染NTHi PCD的新治疗方法。
补充材料
披露的信息
补充材料
S.N.浮士德erj - 00612 - 2017 - _faust
M.J.凯尔索erj - 00612 - 2017 - _kelso
J.S.A.卢卡斯erj - 00612 - 2017 - _lucas
确认
我们要感谢安东页面和帕特里夏·郭金生物医学成像单元,南安普顿大学,与电子显微镜技术的建议和帮助。我们还要感谢詹姆斯·汤普森和珍妮丝高斯为他们的帮助和支持细胞培养和提供的患者鼻刷样品从我们的原发性纤毛运动障碍中心,南安普顿大学医院NHS信托基金会,南安普顿,英国。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:全国UHS委托和纤毛运动中心由英国国民健康保险制度。在南安普顿PCD研究支持NIHR南安普顿呼吸生物医学研究单位和南安普顿NIHR威康信托基金会临床研究机构。柯林斯C.L.杰克逊。沃克,S.A. J.S.A.卢卡斯和l . Hall-Stoodley参与成本行动BEAT-PCD (BM1407)。M.J.凯尔索承认澳大利亚囊性纤维化研究的资助(ACFRT)的信任。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
利益冲突:披露可以找到与这篇文章www.qdcxjkg.com
- 收到了2017年3月23日。
- 接受2017年6月4日。
- 版权©2017人队