数据
文摘
背景
诊断原发性纤毛运动障碍(PCD)需要纤毛功能和超微结构的分析。诊断可以通过二级复杂影响纤毛等损伤取样期间,当地最近的炎症或感染。区分主要和次要异常,分析文化和re-differentiation后纤毛上皮细胞在气液界面(ALI)艾滋病的诊断PCD。然而变化纤毛击败后纤毛上皮细胞培养模式曾被描述,这带来了该方法的鲁棒性问题。这是第一个系统研究评估阿里文化作为一个援助诊断金刚石的这些问题的。
方法
我们回顾性研究了变化与ALI-culture 158年诊断检测的对象称为两个纤毛运动中心。鼻纤毛上皮(PCD n = 54;non-PCD n = 111)是由高速数字视频显微镜和透射电子显微镜分析了之前和之后的文化。
引用:赫斯特拉,杰克逊CL,科尔斯杰,威廉姆斯G, Rutman,郭金点,et al。(2014)原发性纤毛运动障碍的文化在气液界面可以改变纤毛上皮细胞表型,但仍然是一个强大的和有用的辅助诊断手段。《公共科学图书馆•综合》9 (2):e89675。https://doi.org/10.1371/journal.pone.0089675
编辑器:莎玛艾哈迈德,科罗拉多大学丹佛,美利坚合众国
收到:2013年11月27日;接受:2014年1月21日;发表:2014年2月25日,
版权:©2014赫斯特et al。这是一个开放分布式根据文章知识共享归属许可,它允许无限制的使用、分配和复制在任何媒介,被认为提供了原作者和来源。
资助:国家诊断PCD服务在南安普顿和莱斯特是国家专门的调试团队,由NHS英国。投资者没有参与研究设计、数据收集和分析,决定发表,或准备的手稿。
利益冲突:作者宣称没有利益冲突存在。
介绍
原发性纤毛运动障碍(PCD)是一种罕见的遗传性multi-genic疾病的纤毛,损伤黏膜纤毛的清除。患病率约为1∶10000年至40000年在欧洲[1],[2]患病率高达1∶2200在某些种族背景[3]。能动的纤毛功能受损导致纤毛运动的典型症状和体征。异常黏膜纤毛的间隙导致湿咳嗽和鼻炎从出生后不久,反复上下呼吸道感染、支气管扩张、鼻窦炎、中耳炎。大约有50%的受试者位置异常,subfertility是常见的[2]- - - - - -[4]。迄今20缺陷基因已被证明导致纤毛运动通过缺陷编码蛋白质构造纤毛的细胞质蛋白质基因丝或直接负责纤毛基因丝结构的组装[2],[5]。
主题的象征病史应该称为金刚石服务专家调查可能包括鼻一氧化氮(nNO)浓度,评估纤毛功能和超微结构axonemal缺陷[4];鼻刷活组织检查提供了一个示例的生活和完整的评估纤毛上皮纤毛功能和超微结构。纤毛功能评估高速数字视频显微镜(HSV)受控条件下,使纤毛拍频(CBF)和详细的节奏模式(CBP)分析[6]。纤毛超微结构是由计算结构性缺陷的百分比被透射电子显微镜(TEM)横切面的纤毛[7]。PCD的诊断通常是困难的,因为被称为主题有频繁的上呼吸道感染的炎症和损伤上皮细胞导致二级纤毛运动障碍。抽样本身破坏上皮细胞,和辅助运动障碍通常是在完全健康的人。PCD的诊断进一步复杂化一些基因型与正常的纤毛超微结构[8]- - - - - -[12]。额外的方法来帮助解决困难的诊断情况,评估包括基因测试[5]可以检测到大约50%的纤毛运动情况下,radioaerosol黏膜纤毛的清除[13]和免疫荧光显微镜[14]。
使用再生健康的纤毛上皮的能力从一个最初的样本与高度的二次损伤Jorrisen et al[15],[16]首次报道利用细胞培养中使用一个水下的方法。由此产生的淹没球状细胞集群旋转后ciliogenesis纤毛运动是否正常。对悬浮培养CBF的评估显示,一些样品从PCD受试者异常频率之前文化成为ciliogenesis后正常,但以前从未被描述在呼吸道上皮细胞培养一个气液界面(ALI)[16]。培养在阿里睫毛紧随其后[17],[18]细胞)产生的优势超过水下文化技术,产生更大量和纤毛能存活长达11个月(未发表的数据,莱斯特和南安普顿),允许CBF的再分析,CBP和TEM基因丝的超微结构,这在很大程度上有助于诊断原发性纤毛[18]。
在英国PCD诊断中心[19]发现后纤毛阿里文化特别有用的再分析确认异常出现在新鲜的鼻刷牙是由于纤毛运动,而不是一个次要的运动障碍。本研究的假设是“CBF的活检前后是相同的文化大量纤毛运动的情况下”,这是由于我们的观察,在某些患者PCD我们观察到纤毛上皮细胞表型以下文化的改变。因此,这种回顾性研究旨在系统地评估样本的纤毛功能和超微结构ALI-culture之前和之后。在这里,我们提出一个新的、阿里文化权威和独立的观察,在某些情况下,导致纤毛金刚石成为静态的表型。
方法
地方和国家研发和伦理批准获得(南安普顿和南西汉普郡研究伦理委员会CHI395, 07年/ Q1702/109;莱斯特大学医院研究伦理委员会UHL10049 06 / Q2501/68)。所有科目给书面同意为他们的数据采样和被使用。
主题和样品
2009年至2012年间,158名受试者被称为中心在莱斯特和南安普顿曾在阿里纤毛之前和之后的分析文化作为金刚石诊断程序的一部分。额外7受试者纤毛不足进行分析之前,文化,但足够后在阿里文化。莱斯特和南安普顿纤毛运动中心的两三个国家诊断中心在英国工作分享协议和标准。中心之间的HSV和TEM数据审计评估报告的准确性,并保持一致性的报告服务。
细胞学刷(奥林巴斯Keymed有限公司2毫米直径,邵森德,英国)是大约5厘米插入病人鼻孔和鼻腔上皮刷。这种方法获得的鼻纤毛上皮,每个刷包含10000个细胞。每个样本分为三个允许,纤毛功能分析,固定TEM和细胞培养。刷牙只是如果患者进行免费从上呼吸道感染至少4周。HSV分析是对所有样品进行预处理和后阿里文化。TEM对所有样本进行CBP的任何异常或CBF pre-culture,但如果函数不一定是完全正常的。TEM是通常只进行文化后如果是将援助诊断决策如如果pre-culture TEM样品进行完整的分析不足,严重的二次损伤或提供了一个模棱两可的结果。
高速视频分析的纤毛功能
整个中心协议类似,但设备不同,(表1)因此基线CBF值被认为是中心的依赖。细胞悬浮在玫瑰(20 mM)缓冲介质含有青霉素(50µg /毫升)199年,链霉素(50µg /毫升)和二性霉素b(1µg /毫升)。条纤毛上皮(37°C)是使用x100目标成像和数字使用高速摄影机记录。纤毛活动被记录在500帧每秒的速度(fps)和回放减少CBP的帧速率和CBF分析。CBF计算使用以下方程[CBF =(500 / 10纤毛的帧数节拍)x 10],意思是CBF最少6测量报告的独立纤毛。意味着CBF的正常范围为11日至20日在南安普顿赫兹,10 - 14赫兹在莱斯特。CBF中心之间的关键差异法测量,在莱斯特玻璃室幻灯片用于活检样本,而在南安普顿一个塑料箱盒使用。CBF的显微镜测定也略有不同,莱斯特使用传统的显微镜而在南安普顿一个倒置显微镜使用。我们相信,这些差异不太可能占这两个中心之间的不同的正常范围内数据。这是一贯的多年来,已经在会议上讨论英国的诊断服务[19],英国中心审计数据,认为差异是真实的,但差异的原因尚未确定。这个变化并不影响诊断结果或CBF总协定。静纤毛被报道的CBF 0 Hz。静态和实例的能动的纤毛被观察到在一起快速傅里叶变换(FFT)算法是用来衡量纤毛的地区意味着CBF跳动(南安普顿)。CBP评估了经验丰富的观察家。运动障碍定义为异常纤毛模式,包括不协调或异步纤毛跳动,降低振幅,振动模式,hyperfrequent、抽搐或静态纤毛。
透射电子显微镜法
纤毛上皮对TEM在3 - 4%戊二醛固定,准备,成像和分析蒙蔽的方式如前所述[20]。超微结构缺陷的比例是由纤毛在横截面分析。横截面分析的数量(通常300纤毛)是由大小和固定样本内的二次伤害。常见的缺陷包括缺失的内部和外部动力蛋白臂单独或一起,截断外动力蛋白臂和微管混乱。
气液界面细胞培养
细胞培养方法如前所述16。总之,鼻刷活检是生长在胶原蛋白(0.3毫克/毫升,Nutacon,荷兰)涂层组织培养托盘(12)在支气管上皮生长培养基(BEGM)(美国Lonza BEBM包括SingleQuots)大约一个星期。汇合的基底细胞被扩展到胶原蛋白涂层烧瓶(25或75厘米2)和BEGM每周更换一次。悬浮液的non-ciliated基底细胞被播种(100000 - 500000细胞/)到collagen-coated transwell插入(1.2厘米2美国康宁公司)(配角)12好培养板下阿里介质(1:1 BEBM: DMEM 4.5 g / L d -葡萄糖包括SingleQuots)直到汇合的。初级人力基底的单层上皮细胞暴露于一个气液界面,喂食管基底只有ALI-medium补充额外的100 nM all-trans视黄酸(英国Sigma-Aldrich)。交换的媒介是每周3次,顶端表面液体或粘液。一旦纤毛观察(3 - 6周后过渡到ALI),纤毛上皮是恢复(通过温和的使用刮刀刮)transwell的纤毛功能和TEM分析axonemal结构的分析,如上所述(莱斯特),或者一个季度的阿里文化是安装在商会幻灯片,CBF的决心(x100物镜)之前通过快速傅里叶变换分析(南安普顿)。
每口井的睫毛的程度不同在5 - 50%之间每个主题和时间ciliogenesis也是变量之间的3 - 8周后阿里文化。没有差别的ciliogenesis PCD和non-PCD文化。
结果
参与者
参与者被患者称为国家纤毛运动中心在南安普顿(n = 92)和莱斯特(n = 73)的诊断测试。我们连续包括受试者有纤毛的配对分析函数之前和之后阿里文化作为PCD诊断评估的一部分。七个科目的样本进行分析,但其不足post-culture样本用于诊断分析不包括在这项研究。四十一参与者从莱斯特和13从南安普顿被诊断为PCD根据病史、纤毛功能和超微结构4(表2)。中心共享协议,然而,设备和人口不同主题和两个中心有稍微不同的正常范围。严格审查后在中心我们发现这些差异CBF(但不是CBP)没有改变样本处理途径或最终诊断。这两个中心数据因此以及结合(单独列示表3和图1)。所有non-PCD科目金刚石测试,因此在本研究中被称为上和/或下呼吸道症状。
受试者被诊断为纤毛运动或认为non-PCD基于投资组合的诊断措施。
样本PCD主题之前和之后阿里文化
受试者样本的纤毛击败模式最终诊断为PCD前统一是不正常的文化。运动障碍的模式包括静态纤毛,静态结合抽搐纤毛,纤毛与刚性中风缺乏完整的扫描和旋转模式。拍频是在正常范围内大部分纤毛运动情况下(表3和图1)。所有样本分析通过TEM分析使用样本之前文化。根据我们的标准诊断标准,96%的这些超微结构与纤毛运动相关的缺陷(表2;图2);18既有内在和外在动力蛋白臂缺陷,6外动力蛋白臂缺陷,17日内在手臂缺陷,5微管瓦解,4换位缺陷和2纤毛超微结构正常。一个主题文化之前有一个模棱两可的结果。
八13南安普顿PCD金刚石样品展示样品和13个41莱斯特的结合静态和能动的纤毛pre-culture异常,然而文化阿里后表现出完全静态或接近静态(< 1 Hz)纤毛(补充数据:视频1 a和b),额外的9个样品慢纤毛拍频有进一步降低的频率后的文化。所有样品继续证明普遍文化后运动障碍。意味着*纤毛拍频下降后文化(pre-ALI;意思是7.28赫兹;4.37 sd, post-ALI:意思是4.13赫兹sd 5.15;p < 0.001) (表3)。(*金刚石主题是排除在数据从一个分组的表型分析,因为它是一个纤毛运动的不同变体。这个主题的纤毛hyperfrequent纤毛出现振动和降低运动之前和之后ALI-culture)。
TEM结果保持不变在只有一个案例分析重复发布阿里文化(表2)。南安普顿一个样本并展示文化后纤毛超微结构的变化。这个主题的pre-culture功能分析表明平均CBF 8.3 Hz±0.6与混合静纤毛和纤毛异常运动(运动障碍的100%),成为近静态(< 1 Hz)后纤毛阿里文化。TEM分析这个主题的纤毛文化展示了前60%动力蛋白臂缺陷(损失的内在和外在动力蛋白臂)增加到98%后阿里文化。
超微结构的缺陷出现在主题的纤毛功能改变后文化都是内部和外部动力蛋白臂缺陷(n = 9),外动力蛋白臂缺陷(n = 5),内在动力蛋白臂缺陷(n = 12)和微管瓦解(n = 3)。外部和内部和外部动力蛋白臂缺陷最少的纤毛运动相比于手臂和微管内部之前杂乱无章集团文化。运动在这些新兴市场表型的程度下降后阿里文化,没有个人EM缺陷后更容易成为静态阿里文化。
样本对象没有纤毛运动,之前和之后阿里文化
受试者样本终于PCD的诊断排除在外,展示了一系列的功能分析鼻后立即刷牙时纤毛异常。其中包括缺乏协调、缺乏完整的扫描和粘液阻抗(缺乏协调的例子:补充数据文件:1)视频。大多数的平均纤毛拍频,但并不是所有文化(之前样品是在正常范围内图1)。TEM分析表明数量可变的继发性变化(例如破坏膜、复合纤毛)但没有axonemal异常暗示了PCD。
文化后,所有受试者都认为没有PCD post-ALI文化纤毛功能正常的基础上(补充数据文件:视频2),结合其他诊断标准包括TEM。平均纤毛击败南安普顿后频率会减少文化断代,(pre-ALI意味着14.21赫兹,sd 2.71;post-ALI平均13.51 Hz sd 2.21;p = 0.02),但这个频率下降的大小非常小,也不考虑生理相关(意思是配对差异0.69赫兹;95%可信区间0.10到1.27)(表3)。样本个体没有金刚石CBF显示一些变化,但这些变化在正常范围内。有时,一些人表现出一种增加或减少CBF以外的正常范围,ALI-culture后正常。
超微结构进行了TEM post-culture 41个non-PCD样本。这些继续显示没有暗示纤毛超微结构的缺陷。
鼻纤毛击败模式(CBP)和一氧化氮
CBP CBF决心在所有样品包括新鲜的活组织检查和培养细胞。non-PCD学科运动障碍是细胞培养(补充后显著降低视频S1和S2在莱斯特65±25%)运动障碍的pre-culture 55±25%后的文化。在南安普顿,85%的带分析从non-PCD病人包括运动障碍的纤毛pre-culture但随着ALI-culture在每种情况下超过75%的纤毛细胞显示正常。PCD的主题从中心显示100%显示不正常的纤毛运动障碍的或静态击败之前和之后的文化(补充模式视频S3和S4)。鼻一氧化氮测定是在中心执行,但是只有在一个比例的受试者(由于年龄或能力manovre)。non-PCD的受试者平均nNO 162±78磅(莱斯特),570±350磅而PCD受试者显著降低nNO 23±19磅(莱斯特),34±19磅(南安普顿)。
讨论
这是最大的纤毛功能和超微结构的研究来评估分析气液界面之前和之后的文化。它证实post-culture金刚石样本表型的变化澄清,而不是混淆诊断状态。研究前,南安普顿和莱斯特PCD中心同时独立认可恶化的功能性缺陷出现在一些科目后PCD阿里文化。这导致了技术的有效性的担忧。金刚石主题然而,这个大型研究的54和111例non-PCD打消我们post-culture变化实际上帮助诊断。在所有情况下运动障碍与PCD持平或变得更加突出。二次运动障碍non-PCD组的改善。细胞培养,是一个高度专业化的技术和我们的培养成功率鼻纤毛上皮从受试者使用液体在空中接口从所有活检方法范围从54%到79%活检与低水平的运动障碍的纤毛。这是成功率低于实现使用一个简单的水下文化技术,但也产生更多的优势,再住纤毛,满足文化超微结构分析。
我们的发现之一就是,在某些科目PCD, CBF是在正常范围内。这表明PCD的CBF本身并不能成为一个可靠的决定因素。CBF读数正常的海关与边境保护局在特定表型的纤毛和评估需要与CBF金刚石诊断。
纤毛运动纤毛运动的原因变得慢一些科目是未知的,但我们可以推测。Post-culture功能变化被认为与多种学科超微结构的缺陷,包括外动力蛋白臂缺陷,结合内部和外部的手臂缺陷,内部的手臂缺陷,互换,微管无序的缺陷。这使得遗传协会较少,虽然可以猜测一个环境条件是拥有一个更普遍的对基因表达的影响。
我们认为文化是否优先选择演示静态纤毛或克隆细胞,但在审查的图像,静态和抽搐纤毛通常集中在原始细胞刷活检。我们想知道没有任何光滑的肌肉和神经支配的人工阿里文化可能支付的作用这一现象作为药物已被证明调节CBF的活性成分[21]。我们也可以推测,分泌物在阿里是不同的内源释放纤毛刺激因素可能会减少在PCD阿里的文化。在文化、强化本地的拍频和模式由于材料质量流量沿航空公司相比,可能会减少在活的有机体内,增加运动障碍的的表达模式和可能允许细胞的生存可能会丢失体内。
本研究证实后再分析ALI-culture是有用的原刷活组织检查卫生较差。损害由于感染、炎症或外伤在抽样引起二次运动障碍常使诊断状态不确定。再分析新分化的纤毛上皮细胞培养的non-PCD队列确认正常的纤毛频率和节奏模式,使我们能够自信地排除PCD的诊断。ALI-culture还有额外的好处,为TEM分析提供足够的纤毛上皮纤毛超微结构。TEM是一个重要的诊断测试金刚石的一部分,但是我们的协议要求300名健康纤毛在横截面分析。从南安普顿7受试者纤毛不足进行全面分析原始刷牙,但我们可以完整使用阿里的分析样本。没有使用ALI-culture,我们需要召回相当比例的受试者为重复鼻刷牙活检进一步纤毛功能分析,TEM或两者兼而有之。
除了诊断这种技术的好处,ALI-culture和深层培养初级上皮细胞促进纤毛运动的研究已经证明了优秀的模型[22]和其他[23],[24]呼吸道疾病。本研究的一个限制是它的回顾。它是由两个中心共享协议,但有不同的设备有其优势和局限性。
总之,鼻刷活检显示获得的呼吸道上皮细胞表型变化后文化在气液界面,包括CBF减少,这有助于诊断或排除原发性纤毛。PCD的表型出现增强的主题使用ALI-culture re-growth后样品。
支持信息
视频S1。
从non-PCD纤毛活动之前和之后阿里文化主题显示二级运动障碍。在500 fps和记录在30 fps。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0089675.s001
(MPG)
视频S2。
相同的主题纤毛视频S1改进的二次文化后运动障碍。图像被记录在500 fps和回放30 fps。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0089675.s002
(MPG)
视频S3。
高速视频图像的纤毛功能主题PCD显示不正常的运动。在500 fps和记录在30 fps。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0089675.s003
(MPG)
视频S4。
一样的纤毛运动主题视频S3显示所有的纤毛是静态的文化。在500 fps和记录在30 fps。
https://doi.org/10.1371/journal.pone.0089675.s004
(MPG)
作者的贡献
构思和设计实验:JSL CLJ万岁。进行了实验:CLJ JLC万岁ECA体AR GW。分析了数据:JSL CLJ万岁。造成试剂/材料/分析工具:JSL他PML。该报写道:JSL RH CLJ。负责HSV分析和阿里文化在南安普顿:CLJ JLC EA。负责HSV和阿里文化在莱斯特:好啊GW。进行电磁分析:体AP AR。开发了FFT算法与图像J22软件用在南安普顿:PML。临床诊断服务的领导:他JSL有限公司。
引用
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