文摘
胆碱能语气导致气流阻塞在慢性阻塞性肺疾病。因此,抗胆碱能类是有效的阻断支气管扩张剂的毒蕈碱的M3在气管平滑肌受体。最近的证据表明,乙酰胆碱也会导致气道炎症。然而,毒蕈碱的受体亚型(s)调节这一过程是未知的。
在这项研究中,M的贡献1,米2和M3受体亚型在香烟烟雾诱发气道炎症被公开调查毒蕈碱的受体亚型缺陷小鼠烟4天。
在野生型小鼠,香烟的烟雾诱导巨噬细胞的增加,中性粒细胞和淋巴细胞在支气管肺泡灌洗液。中性粒细胞炎症在米高1- / -和M2- / -小鼠与野生型小鼠相比,但在M低3- / -老鼠。因此,keratinocyte-derived趋化因子的释放(KC)、单核细胞趋化蛋白1和白细胞介素- 6米高1- / -和M2- / -老鼠,在M和减少3- / -老鼠。标记的改造香烟烟雾暴露后并没有增加。然而,米3- / -小鼠蛋白质转换增长factor-β1和矩阵的表达式。香烟烟雾诱发炎症细胞招聘和KC释放也阻止了由M3受体选择性拮抗剂1-dimethyl-4-diphenylacetoxypiperidinium碘(4-DAMP在野生型老鼠)。
总的来说,我们的数据表明M的促炎作用3受体在香烟烟雾诱发嗜中性细胞因子释放,但抗炎作用1和M2受体。
文摘
抑制的毒蕈碱的M3受体阻止炎症小鼠暴露于香烟烟雾的反应http://ow.ly/p7UdG
介绍
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种炎症性疾病的特点是进步不完全可逆的气流限制(1]。慢性阻塞性肺病在西方世界的最常见原因是吸烟。炎症疾病中起着重要的作用,导致气道纤维化,粘液分泌过多和肺气肿COPD患者中观察到的1]。巨噬细胞和中性粒细胞特别增加COPD患者和增加产量的增加有关特定的细胞因子和趋化因子,包括白介素(IL) 8、IL - 6, IL-1β,IL-17,单核细胞趋化蛋白1 (MCP)和肿瘤坏死因子(TNF) -α[2]。此外,慢性阻塞性肺病是增加生长因子的生产,包括转化生长因子(TGF) -β和血管内皮生长因子(VEGF),这被认为有助于改造的航空公司3]。
乙酰胆碱是主要的副交感神经递质诱发支气管狭窄的航空公司。在COPD患者副交感神经活动增加,这似乎是主要的可逆的气道阻塞的组件4]。因此,抗胆碱能类治疗,抑制毒蕈碱的受体激活,是一种有效的支气管扩张剂治疗慢性阻塞性肺病。
基因编码5毒蕈碱的受体亚型存在于人类基因组(M1- m5)。M1,米2和M3受体在肺部和大量表达的上下文中都已经被广泛地研究过了迷走神经的神经传递。他们的主要角色是支气管狭窄和粘液分泌,主要是监管通过米3分别气管平滑肌受体和腺体。此外,M1受体促进副交感神经节的神经传递和由食用易调节水和电解质的分泌细胞。M2在迷走神经的神经受体是一种autoinhibitory pre-junctional受体抑制乙酰胆碱释放,丰富post-junctional受体在气道平滑肌5- - - - - -7]。
现在知道乙酰胆碱可以产生许多额外,non-neuronal影响航空公司。毒蕈碱的受体表达的几乎所有类型的细胞在肺部,包括上皮细胞和炎症细胞(8,9]。引人注目的是,这些细胞表达所有必需的组件合成和释放乙酰胆碱,包括胆碱乙酰基转移酶(聊天),乙酰胆碱的合成的酶。这被称为non-neuronal乙酰胆碱和可能导致气道炎症9- - - - - -11]。的确,在体外研究揭示了各种各样的乙酰胆碱对这些细胞类型的影响11),包括诱导释放强大的嗜中性粒细胞化学引诱物引发和白三烯(LT) B4气道上皮细胞、平滑肌和炎症细胞(12- - - - - -15]。最近的证据在活的有机体内研究也证明了促炎作用的病理生理条件下乙酰胆碱。在香烟烟雾诱发小鼠模型的慢性阻塞性肺病,tiotropium一定程度上阻止了总细胞和中性粒细胞增加支气管肺泡灌洗液(BALF)。此外,各种细胞因子的释放,包括il - 6, keratinocyte-derived趋化因子(KC,鼠标orthologue引发的),LTB4和MCP-1被tiotropium [16]。我们组最近证明lipopolysaccharide-induced中性粒细胞炎症可以完全阻止tiotropium在慢性阻塞性肺病的豚鼠模型(17]。类似的发现表明促炎作用乙酰胆碱在哮喘动物模型,观察急性肺损伤和纤维化6]。
综合来看,这些研究标明乙酰胆碱的作用炎症,这可能影响抗胆碱能药物治疗在慢性阻塞性肺病患者。治疗与抗胆碱能类目前集中在M3受体,因为这种受体亚型介导支气管收缩。虽然在体外研究表明,M的角色3受体在细胞因子释放12,18),没有可用的信息对毒蕈碱的受体亚型参与炎性乙酰胆碱的影响在活的有机体内。因此,本研究的目的是调查的作用1,米2和M3使用毒蕈碱的受体受体亚型在香烟烟雾诱发气道炎症subtype-deficient老鼠。我们提出,M3受体发挥着主要促炎作用。为了研究这一点,我们评估炎性细胞计数和中介灌洗液中释放。此外,我们分析与改造相关基因的表达。
方法
动物
纯合子,近亲繁殖,specific-pathogen-free繁殖地的M1- / -,米2- / -和M3- / -老鼠和C57Bl / 6 ntac野生型小鼠遗传背景取自泰康利(,丹麦)。M1- / -,米2- / -和M3- / -老鼠用129 Sv / J背景生成和backcrossed≥10代到C57Bl / 6 ntac背景(19- - - - - -21]。淘汰赛动物没有不同于野生型控制整体健康,生育和长寿19- - - - - -21),虽然米的重量3- / -老鼠是低于野生型小鼠(在线补充表E1)。暴露于香烟烟雾中并不影响老鼠的重量(在线补充表E1)。动物通常被安置在12 h明暗周期和收到食物和水随意。所有实验进行按照国家批准的指导方针和格罗宁根大学动物实验委员会(格罗宁根、荷兰)。
动物模型
雄性老鼠(n =每组8 - 9,10 - 12周大)暴露在香烟烟雾从肯塔基州3 r4f研究香烟(肯塔基州列克星敦烟草研究所,大学,肯塔基州,美国)连续四天全身暴露。每个烟熏没有过滤的速度在5分钟5 L·h−1在比60 L·h−1空气使用蠕动泵(45 rpm) (323 E / D;沃森马洛,鹿特丹,荷兰)。香烟烟雾直接分成6 l有机玻璃框。1天,小鼠暴露于主流烟一根烟的早上和下午三个香烟。在2 - 4天,小鼠暴露于五香烟在早上和下午5 (图1)。控制动物被以同样的方式处理,但只接触到新鲜的空气。由于试验装置的容量,并不是所有的动物用于这项研究可以包含在一个实验。因此,实验进行三次(n = 19到24每实验动物)。空气和香烟smoke-exposed野生型老鼠包含在每一个实验,减少可变性。16 h后过去的香烟烟雾暴露,动物实施安乐死腹腔注射戊巴比妥(400 mg·公斤−1;荷兰格罗宁根大学医学中心,格罗宁根),立即肺灌洗后,切除,在液态氮冷冻。
毒蕈碱的拮抗物管理
substudy, M3受体选择性拮抗剂4-DAMP(碘化1-dimethyl-4-diphenylacetoxypiperidinium)(1毫克公斤−1)管理野生型小鼠(n = 7)i.p。注入,每个香烟烟雾暴露前30分钟。使用相同的实验协议如上所述。
分析BALF
euthanising老鼠后,轻轻肺灌洗通过气管插管1毫升PBS包含5%牛血清白蛋白和蛋白酶抑制剂(抑制胰凝乳蛋白酶、嗜热菌蛋白酶、木瓜蛋白酶、链霉蛋白酶、胰腺提取胰蛋白酶;f·霍夫曼-罗氏公司、瑞士巴塞尔),另一个1毫升PBS的四倍。细胞颗粒状和第一部分的上层清液储存在-20°C测量细胞因子和生长因子的ELISA。单独为每个动物,支气管肺泡灌洗细胞不同的分数后,500年resuspendedμL PBS和细胞总数测定。细胞学检查,cytospin准备染色May-Grunwald和染色(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)和微分细胞计数是由数≥400个细胞中复制蒙蔽的方式。MCP-1 KC, il - 6、IL-1βIL-17, TNF-α和VEGF释放决心BALF MILLIPLEX上层清液的测定(美国微孔,Billerica的)。TGF-βBALF是由一个酶联免疫试剂盒(研发系统,明尼阿波利斯,美国)根据制造商的指示。
聊天染色
确定聊天表情,5-μm-thick cryosections (n = 4)染色与特定的兔子anti-ChAT抗体由w . Kummer领军(解剖学和细胞生物学研究所、Justus-Liebig-University吉森,德国)。抗体是观想使用辣根peroxidase-linked二级抗体和diaminobenzidine·毫升(1毫克−1)。航空公司在每个部分拍摄数字。
分析基因表达的肺部组织
肺组织的总RNA提取(右优越叶)或bronchalveolar灌洗细胞使用RNeasy迷你包(Venlo试剂盒,荷兰)根据制造商的指示。肺组织匀浆是由摧毁了在液氮中。等量的信使rna被反向转录和cDNA受到实时定量PCR (Westburg Leusden,荷兰)。实时PCR进行变性在94°C 30年代,退火在59°C 30年代和30年代在72°C扩展了40周期后跟10分钟在72°C。实时PCR数据使用比较循环阈值方法进行分析。目标基因的数量正常内生参考18 s核糖体RNA基因。其他几个看家基因,包括β2-microglobulin和3 -磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH),测试实验过程的影响的表达式。所有的管家基因的表达,包括18岁,在测试条件下是稳定的。具体的正向和反向引物表E2在网上补充列出使用。
统计分析
数据意味着±扫描电镜。统计差异意味着使用一个或双向方差分析计算,其次是Newman-Keuls多重比较测试。差异被认为是显著p < 0.05。
结果
non-neuronal的胆碱能系统
它提出了non-neuronal胆碱能系统(NNCS)可能导致气道炎症11]。探讨香烟烟雾暴露的影响,基因表达的不同组件的胆碱能系统分析在野生型小鼠肺组织匀浆,包括胆碱转运蛋白的高亲和性transporter-1胆碱,胆碱transporter-like蛋白1,乙酰胆碱合成的酶聊天,乙酰胆碱的降解酶乙酰胆碱酯酶和不同的毒蕈碱的受体亚型。中所描绘的一样图3一小鼠肺中表达,这些组件和香烟烟雾暴露并不影响他们的表达水平。同样,毒蕈碱的受体表达在支气管肺泡灌洗细胞从野生型老鼠并不改变香烟烟雾暴露后(图3 b)。在肺组织中,M2(M受体表达的最高水平2>米3>米1),而从BALF细胞,M3(M受体表达的最高水平3R > M1R > M2R)(在线补充图E1)。聊天表达,检测到免疫组织化学染色,本地化的上皮和平滑肌层在野生型小鼠气道壁(图3 c)。暴露于香烟烟雾中不改变聊天的表达式或本地化(图3 c)。
香烟烟雾诱发炎症细胞招聘
研究的贡献毒蕈碱的受体亚型在香烟烟雾诱发气道炎症、细胞计数测定BALF的野生型,M1- / -,米2- / -和M3- / -老鼠。所有小鼠暴露于香烟烟雾的数量增加了两倍的炎症细胞相比air-exposed控制动物(图4)。香烟烟雾暴露后的主要细胞类型是巨噬细胞,在所有菌株(数量几乎翻了一倍图4 b)。淋巴细胞浸润却只有很小的增加观察香烟烟雾暴露后,在所有菌株(类似图4摄氏度)。然而,中性粒细胞浸润显示菌株之间的显著差异(图4 d)。中性粒细胞的数量增加到了原来的4倍在野生型小鼠相比air-exposed动物。然而,在米1- / -和M2- / -老鼠,中性粒细胞数量的增加在香烟烟雾暴露更高,采样的M1- / -老鼠。形成鲜明对比,没有观察中性粒细胞数量的显著增加3- / -香烟烟雾暴露后小鼠相比air-exposed控制动物(图4 d)。
香烟烟雾诱发细胞因子释放
随后,炎性细胞因子释放BALF中确定。水平的KC BALF的野生型小鼠暴露于香烟烟雾相比高出15倍air-exposed动物(图5)。MCP-1和il - 6的版本没有显著差异在香烟smoke-exposed野生型小鼠(图5 b和c)。在米1- / -老鼠,香烟smoke-exposed小鼠更高水平的KC, MCP-1和il - 6 air-exposed老鼠。有趣的是,所有这些细胞因子的浓度明显高于野生型相比,香烟smoke-exposed老鼠。在香烟smoke-exposed米2- / -老鼠,KC释放也显著提高,两相比air-exposed小鼠和野生型烟草smoke-exposed老鼠,而MCP-1和il - 6版本没有显著不同。在米3- / -老鼠,没有增加任何这些细胞因子的释放观察香烟烟雾暴露后,和KC释放显著低于野生型烟草smoke-exposed老鼠(图5)。IL-17水平,IL-1βTNF-α低于检出限在所有菌株(没有显示)。
香烟烟雾诱发生长因子和细胞外基质表达
我们接下来决定释放生长因子TGF-β1和BALF中VEGF。小增加TGF-β1蛋白质释放后被观察到在所有菌株香烟烟雾暴露(1.4 -2.0倍),这是重要的野生型小鼠(图6)。值得注意的是,有更少的BALF TGF-β1 M3- / -小鼠与野生型小鼠相比,无论空气或香烟烟雾暴露(分别低56%和46%)。VEGF释放并没有改变(图6 b)。表达TGF-β1 M的mRNA水平的肺部组织3- / -小鼠减少到一个类似的程度相比,蛋白质含量(图6 b)。在转录水平,TGF-β1表达式在M显著增加1.4倍1- / -老鼠和M的1.7倍2- / -香烟烟雾暴露后的小鼠(图6 c)。
此外,我们分析了矩阵的基因表达蛋白胶原Iα1和纤连蛋白的肺部组织。没有观察香烟烟雾暴露后表达增加(图6 d和e),除了胶原Iα1 M2- / -老鼠,香烟烟雾暴露后增加。此外,胶原蛋白Iα1、纤粘连蛋白的表达水平更高的香烟smoke-exposed M2- / -老鼠比香烟smoke-exposed野生型老鼠。符合TGF-β1发现,矩阵蛋白质都是在一个显著的低水平表达3- / -小鼠与野生型小鼠相比,无论空气或香烟烟雾暴露(分别低68%和65%)。这是证实纤连蛋白的蛋白质含量,在M低38.6±8.9%3- / -老鼠比野生型小鼠(p < 0.05)。最后,香烟烟雾暴露没有显著影响MUC5AC基因表达的分析菌株(图6 f)。
讨论
在这项研究中我们证明了M3受体发挥着深远的促炎作用香烟烟雾诱发炎症,这是主要的毒蕈碱的乙酰胆碱受体亚型参与促炎症的影响。抑制M3受体,受体的总敲除或药理方法,预防中性粒细胞炎症和细胞因子释放的灌洗液香烟smoke-exposed老鼠。形成鲜明对比,淘汰赛的M1和M2受体导致中性粒细胞和BALF中细胞因子释放增加,表明抗炎作用的受体亚型在香烟烟雾诱发炎症。这项研究首次证明了微分调节炎症的毒蕈碱的受体在活的有机体内并为M意味着抗炎作用3选择性抗胆碱能类。
中性粒细胞被认为是慢性阻塞性肺病的主要细胞类型之一参与(2]。各种研究表明乙酰胆碱在调节中性粒细胞炎症的重要作用。毒蕈碱的受体的激活可以促进中性粒细胞涌入诱导巨噬细胞(中性粒细胞趋化现象的活动22,23)和LTB4从痰液细胞释放的慢性阻塞性肺病患者(15]。此外,引发释放从上皮和气道平滑肌细胞毒蕈碱的受体刺激(12,14]。这些发现支持在活的有机体内研究中,香烟烟雾,lipopolysaccharide-induced嗜中性被毒蕈碱的受体拮抗剂抑制tiotropium [16,17]。
毒蕈碱的受体似乎是特定的监管影响毒蕈碱的受体缺陷小鼠中性粒细胞,巨噬细胞和淋巴细胞则没有改变。我们的结果对中性粒细胞炎症与不同在体外研究证明毒蕈碱的受体激活的促炎作用主要依赖于M3受体亚型。因此,它已被证明,4-DAMP DAU5884, M3选择性拮抗剂受体,抑制乙酰甲胆碱和香烟烟雾诱发引发释放气道平滑肌细胞(12]。此外,肺泡macrophage-mediated迁移抑制慢性阻塞性肺病患者中性粒细胞的4-DAMP [18]。此外,M3受体是主要受体亚型表达的BALF中炎症细胞在我们的研究中所示。它也知道,炎症细胞表达3受体,受体介导促炎效应(8]。因此我们认为的促炎效应3受体,发现在我们的研究中,依赖于细胞因子释放的调节结构细胞,结合M的直接激活3炎症细胞受体。
在M与发现3- / -老鼠,中性粒细胞炎症在M增加2- / -小鼠与野生型小鼠相比。M2受体位于pre-junctionally预处理和post-ganglionic心烦和抑制自受体作为限制释放乙酰胆碱(5]。此外,M2受体表达post-junctionally由平滑肌细胞和成纤维细胞(6,24]。与乙酰胆碱作为促炎症介质诱导趋化因子从结构和炎症细胞释放通过M3M受体增加乙酰胆碱的水平2- / -老鼠,由于损失的autoinhibitory作用,因此可以解释观察到的严重嗜中性。支持这样一个角色,M2受体的表达似乎低BALF中炎症细胞,但在肺组织高,表明M的影响2受体缺陷并非由于直接作用于炎症细胞。文献支持了这一观点,这表明乙酰胆碱的促炎效应在巨噬细胞,上皮细胞和气管平滑肌细胞并不是由M2受体(12,23,25]。
米的作用2受体pre-junctional受体驾驶夸张的乙酰胆碱释放,炎症有显著影响。乙酰胆碱长期以来一直被称为经典神经递质。最近的研究表明,乙酰胆碱还可以释放non-neuronal来源,包括上皮细胞、气道平滑肌和炎症细胞(9,10]。尚不知道non-neuronal乙酰胆碱到何种程度影响气道炎症(11]。non-neuronal乙酰胆碱的释放受到M的影响是未知的2受体autoinhibitory方式。我们的数据因此意味着一个重要的角色对于神经乙酰胆碱在香烟烟雾诱发炎症。此外,我们没有发现任何言论upregulation NNCS组件的肺部的烟smoke-exposed老鼠,与之前报道的增加在人工培养的气道上皮细胞暴露于香烟烟雾提取物(13]。未来的研究调查神经炎症和non-neuronal乙酰胆碱的贡献无疑是必要的。
令人惊讶的是,中性粒细胞炎症也增强1- / -老鼠。众所周知,M1受体促进副交感神经节的神经传递(5]。然而,在此基础上,人们会预计,M1受体缺陷导致降低乙酰胆碱释放导致抑制炎症。Reinheimeret al。(26报道称,M1受体选择性拮抗剂pirenzepine能对抗乙酰胆碱的抑制作用人类肥大细胞组胺释放。缺乏这抑制M1受体可能增加中性粒细胞趋化性解释,肥大细胞数量增加在吸烟和更高的COPD患者(27,28]。此外,M1受体也控制电解液和水由气道上皮细胞(分泌29日),缺乏M1受体表达可能导致降低M的能力1- / -小鼠清除肺部的烟粒子香烟烟雾暴露后,导致加重炎症和损伤反应。损坏的敏锐感应响应细胞因子il - 6和MCP-1 M1- / -老鼠,在野生型老鼠缺席,支持这一假说。
这项研究的结果在转基因小鼠建议M的一个主要角色3受体在调节香烟烟雾诱发炎症,这意味着M3亚型选择性抗胆碱能类将是有益的。事实上,我们表明,药物抑制M3受体BALF中使用4-DAMP部分预防炎症细胞的积累,伴随着强烈的抑制香烟烟雾诱发释放KC。4-DAMP M是有选择性的3受体/ M2(∼16倍)7),在较小程度上,M1受体(大约3倍)30.]。有趣的是,药物抑制M的抗炎作用3受体更明显的影响这个受体的淘汰赛。类似的有差异的数据报道毒蕈碱的受体介导的收缩体外米,可完全抑制3受体选择性拮抗剂在野生型小鼠,而只有部分抑制收缩中观察到3- / -老鼠(31日,32]。尽管这种差异背后的机制尚不明确,补偿机制在淘汰赛的老鼠限制的影响3受体缺陷。
尽管tiotropium是活动的选择性3受体(离解半衰期27 h),它的半衰期离解的M1受体10.5 h (33]。稳态亲和力的tiotropium M1,米2和M3受体是不不同的34]。半衰期ipratropium aclidinium和胃长宁,比两个抗胆碱能类处于开发阶段,M3与M1受体与tiotropium [33]。我们的研究表明,一个更有选择性的化合物完全抑制M3受体是可取的和可能导致改进对香烟烟雾诱发炎症的影响。
有趣的是,在我们的研究基础的表达TGF-β1,胶原Iα1和纤连蛋白显著低于M3- / -小鼠与野生型小鼠相比。在米2- / -老鼠,表达这些组件是香烟烟雾暴露后增加。这表明,除了炎症,乙酰胆碱调节肺结构的重要方面通过M3受体。事实上,米3航空结构表达的受体细胞,包括上皮细胞、气道平滑肌细胞(24]。此外,在体外研究已经证明了M的角色3受体在调节气道平滑肌增生(35),在活的有机体内研究显示有保护作用的抗胆碱能类基质蛋白沉积(17,36]。个人的确切角色毒蕈碱的受体亚型在这个过程不清楚,还有待阐明6]。
乙酰胆碱的促炎作用的证据在体外和在活的有机体内研究增加(6]。然而,这些观察的平移效用尚不清楚,因为在COPD患者,对炎症的影响或抗胆碱能治疗后肺功能下降的速度并没有被证实。众所周知的隆起与Tiotropium(理解潜在的长期影响函数)的研究,使用Tiotropium与减少急性加重的数量,一般视为煽动性的事件(37]。病人有更多的急性加重演示增加炎症标记物的水平在稳定状态38,39]。然而,在最近的两项研究中,没有直接证据表明抗炎效应被发现,il - 6和COPD患者的痰是引发水平不降低抗胆碱能治疗后40,41]。然而,研究作者所讨论的重大限制。在这项研究中,Pernget al。(41),治疗组小,患者只有tiotropium治疗,疗程12周。在这项研究中,Powrieet al。(40),痰量减少后tiotropium治疗,这可能导致细胞因子浓度增加。未来的研究使用不同的方法来评估炎症可以解决的问题是否抗胆碱能类确实在COPD患者有抗炎作用。目前,没有证据表明这样一个角色。
总之,我们的研究结果表明,M的抑制3受体阻止炎症小鼠暴露于香烟烟雾的反应。这证实了先前建立的促炎症气道疾病的病理生理学中乙酰胆碱的作用,表明这是完全介导的通过米3M受体,因为淘汰赛1和M2受体加重炎症与野生型小鼠相比。因此本研究打开了新的视角3受体选择性抗胆碱能类专门针对气道炎症。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明:我们要感谢荷兰哮喘基金会对金融支持(格兰特3.2.08.014)。
利益冲突:披露可以找到与本文的在线版本www.www.qdcxjkg.com
- 收到了2012年7月19日。
- 接受2013年1月21日。
- ©2013人队