文摘
肺泡巨噬细胞对肉芽肿的形成很重要,这是结节病的组织学特点。其功能作为抗原递呈细胞结节病也被认为是相关疾病的结果,导致在缓解或长期慢性炎症在肺部。
我们的目的是研究可溶性蛋白质组的表达水平改变的肺泡巨噬细胞在肺结节病与健康对照组相比,识别特定的目标蛋白质和途径重要疾病和/或疾病表型的机制。
使用二维定量蛋白质组学方法差异凝胶电泳结合质谱分析应用。数据是评估使用多元建模和路径分析。69个蛋白质斑点被发现是结节病和健康对照组之间的显著改变。其中,25独特的蛋白质被确定。几个关键肺泡巨噬细胞识别蛋白质的相关功能,包括Fcγ-mediated吞噬作用和clathrin-mediated内吞作用途径。
全球蛋白质组学分析提供识别变化的蛋白质而不是以前在结节病报告的一个子集。这些变化主要影响生物通路相关巨噬细胞吞噬功能。这些发现提供了重要的见解巨噬细胞在结节病发病机制中的作用。
结节病是一个系统性的原因不明,涉及肺肉芽肿疾病∼90%的患者(1]。免疫、肺结节病的特点是增加数量的激活肺泡巨噬细胞和CD4 + t细胞辅助(Th) 1型细胞因子在肺部(2]。肺泡巨噬细胞都参与在先天3)和自适应免疫反应(4]。他们产生一系列促炎细胞因子,是肿瘤坏死的主要来源factor-α生产中扮演着很重要的角色在结节病肉芽肿的形成标志(5- - - - - -7]。此外,肺泡巨噬细胞有一个重要的函数作为抗原呈递细胞(apc)在结节病,与t细胞淋巴细胞相互作用通过人类白细胞抗原(HLA)分子和t细胞受体,分别。大量的研究表明,HLA复杂的遗传多态性的相关性疾病的结果(3,8]。我们组之前呈现强劲结节病洛夫格伦综合征患者之间的关联、HLA-DRB1 * 03等位基因。这组患者通常有一个良好的预后与自发的决议,并展示了良好定义的特征包括急性发作,双侧肺门腺病、踝关节炎和/或结节性红斑。相比之下,组患者有HLA-DRB1 * 14/15等位基因与一个更持久的炎性表型(9]。
结节病是一种复杂的疾病,环境和遗传因素对疾病的结果很重要。简化的研究专注于单一的生物分子或通路可能提供一些限制在多因子疾病发病机制的理解,如结节病。互补系统级方法,包括定量蛋白质组学,给机会研究数百种蛋白质表达谱的变化,同时相应的途径。蛋白质组学研究的数量调查人类巨噬细胞的特点是非常有限的10,11]。J在et al。(12)进行了彻底的调查之间的差异蛋白质组的血液单核细胞和肺泡巨噬细胞,揭示差异蛋白质表达谱特别是蛋白酶(例如,组织蛋白酶)和肌动蛋白参与监管元素,如。吞噬作用和细胞因子释放,以及规章制度适应所需的氧化剂防御系统的氧化环境的肺。虽然这些调查提供了重要依据对巨噬细胞分化和分化发生在肺、全球蛋白质组学研究调查人类主要肺泡巨噬细胞表型改变应对呼吸道疾病稀缺。异常包括肺泡巨噬细胞蛋白质组的调查反应感染猪繁殖和呼吸综合症病毒(13和甲型流感病毒14]。以前的蛋白质组学研究在结节病主要表现在支气管肺泡灌洗(BAL)液和血清15- - - - - -22),从而积极主要反映蛋白质分泌或渗出物进入支气管肺泡腔,如血浆蛋白和抗氧化蛋白。在当前的研究中,我们专注于执行的肺泡巨噬细胞和细胞内蛋白质组差异蛋白质组学研究使用二维微分凝胶电泳(消化),目的是识别特定的蛋白质和途径的重要性肺泡巨噬细胞参与结节病。据我们所知,这是第一个临床定量蛋白质组学研究进行孤立的肺泡巨噬细胞从肺结节病的病人。
材料和方法
研究对象
支气管镜检查执行如前所述七健康对照组和七结节病病人的初始诊断常规调查(9]。结节病的诊断标准患者按照世界结节病和其他肉芽肿疾病协会(WASOG)标准(23),包括胸部影像学改变和肺功能改变。同时,肉芽肿在气道上皮切片,CD4 / CD8比值(≥3.5)BAL t细胞数量增加。患者(四个男性和三名女性,平均年龄30岁(范围21-45)年)要么突然出现发烧、结节性红斑和/或关节炎(洛夫格伦综合征,n = 4),或一个阴险的出现症状明显的疲劳和干咳(non-Lofgren, n = 3)。病人的胸部x线摄影变化分为阶段》。没有包含在任何免疫抑制治疗的患者。三个病人曾经抽过烟自去年香烟(> 1年),和四个不吸烟者。所有健康受试者(一男六个女性,平均年龄25岁(范围19-28)年)是不吸烟者和不受任何症状表明呼吸道疾病和正常胸片和肺功能(表1)。没有一个人有呼吸道感染的迹象,在过去4周之前加入这项研究。这项研究是由斯德哥尔摩当地伦理委员会批准(案例号码02 - 427)。
样品制备和定量完整的蛋白质组学分析
肺泡巨噬细胞被Percoll隔绝其他BAL细胞密度梯度(通用电气医疗集团,乌普萨拉,瑞典)如前所述[24]。的惯量Percoll试剂的诱导激活期间Percoll分离验证的抗原呈递细胞,包括肺泡巨噬细胞(25- - - - - -27]。BAL细胞cytospun沾May-Grunwald-Giemsa污点,其次是微分计算巨噬细胞,淋巴细胞,嗜酸性粒细胞,neutophils和肥大细胞之前和之后Percoll分离。Percoll分离导致肺泡巨噬细胞纯度> 95%。随后,肺泡巨噬细胞是水溶性和总被超速离心法分离成可溶性蛋白质含量和膜分数(在线补充材料)。可溶性蛋白质分数被贴上使用最少的消化(20.)根据制造商的指示(通用电气医疗集团)。总之,汇集内部标准创建整除的样品(Cy2-labelled) co-separated二维电泳凝胶上一个结节病和一个健康的示例(Cy3或Cy5贴上标签)和用于正常化。等电点聚焦是24厘米pH4-7线性渐变的蹩脚pH梯度带,运行在IPGphor II(通用电气医疗集团)为53.7套,紧随其后的是第二个维度在10% sds - page凝胶(20×24厘米)大格式,从而聚焦酸性蛋白质分子量的蛋白质组分析< 100 kDa。图像采集是使用台风- 9410执行荧光扫描仪(通用电气医疗集团)和后续的图像分析进行使用初期发育SameSpots V3.2(非线性动力学,泰恩河畔的纽卡斯尔,英国)(在线补充材料)。
蛋白质识别
改变protein-spots(方差分析;p < 0.05)胰蛋白酶消化,并进一步分析了matrix-assisted激光解吸飞行ionisation-time (MALDI-TOF) (Micromass-R MALDI-TOF,圣地亚哥,美国)或MALDI-TOF / TOF(美国应用生物系统公司、弗雷明汉马)质谱(MS)。数据库搜索肽质量指纹进行使用的(http://prowl.rockefeller.eduMALDI / MS数据),肽质量映射是使用吉祥物MALDI-TOF / TOF执行数据(www.matrixscience.com/search_form_select.html)在NCBI nonredundant蛋白质序列数据库(2009/03/01版)。
统计分析
在消化图像分析,方差分析(p < 0.05)是应用于对数转换蛋白卷正常化Cy2内部标准强度使用GraphPad棱镜版本5.0(美国GraphPad软件,拉霍亚,CA)。多变量分析利用主成分分析(PCA)和正交预测潜在的结构(OPLS)进行了分析使用SIMCA P + 12.0.1 (Umetrics、期刊、瑞典)。
路径分析
创新路径分析(智慧系统公司,雷德伍德城、钙、美国)是用于路径分析鉴定差异表达蛋白质的消化分析。蛋白基因名称和正常化,对数转换选定的蛋白质的表达水平被加载到独创性通路分析,并调整确切概率法被用于统计测试的路径分析。
结果
肺泡巨噬细胞的蛋白质组学分析
半定量的可溶性蛋白质消化分析分数从肺泡巨噬细胞导致648年protein-spots正确匹配所有21凝胶图像和足够的质量对后续定量uni -和多变量分析。一元单向方差分析分析(p > 0.05)显示,69年的分析蛋白质斑点结节病和健康对照组之间的显著改变。使用一个内部标准校正的技术变化与第四代二维电泳分析软件(24]提供了一个高总体统计电力(0.84),尽管包括受试者的低数量,从而使检测显著改变蛋白质的丰度降至1.2倍的变化。共有25个独特的蛋白质,其中17个,表达下调的表达水平上调8与健康对照组相比,结节病。蛋白质的身份介绍和相关的统计数据表2),3),分别。
多变量模型
PCA最初应用提供数据集的总体趋势的概述。结节病的PCA scores-plot表现出明显的集群和健康组,分别为(图1)。PCA还透露一个局外人在健康个体(H7),坐落在霍特林T295%的置信区域。H7样本中包含大量的红细胞因出血在球过程中,和一个额外的低渗的样品处理步骤中使用前需要在消化分析。这可能造成H7的不同属性。H7个人不排斥,但是,改变变量的总体排名贡献在无人监督的PCA分析或后续监督(OPLS)分析,因此个人是包含在所有进一步的分析。为了进一步评估69年显著改变蛋白质的预测能力对病人诊断、监督OPLS分析与定性诊断响应变量。结果是一个健壮的模型具有良好的分离(R2= 0.86,问2= 0.41)(图2)。载荷以及预测情节上的变量重要性表明valosin-containing蛋白质(VCP) rab-11,角蛋白10和拓扑异构酶2 b中最重要的变量驱动组分离。进一步OPLS分析基于结节病表型(Lofgren或non-Lofgren结节病)高度预测模型,预测能力的72%(问2= 0.72)基于7倍交叉验证(图S1)。
通路和网络分析
25确定蛋白质和途径进一步调查分析利用聪明才智通路分析软件。两个macrophage-related通路被发现在结节病显著调节;clathrin-mediated的内吞作用通路(p = 0.0019)和Fcγ受体介导吞噬途径(p = 1.3×10−5)。额外的网络分析显示,11 25蛋白质相关的核转录因子(NF) -κB网络(图3)。这些蛋白质骨髓分化因子88 (MyD88) Rab11 family-interacting蛋白1 (RAB11A)适配器蛋白质复合体2,β1亚基(AP2B1) gelsolin (GSN),磷脂酶D(骑士),Eph-like受体酪氨酸激酶(EPHB1) VCP, IIb拓扑异构酶(top2b)、波形蛋白(VIM), Na+/ K+腺苷三磷酸酶α1亚基(ATP1A1)和RhoA / RAC CDC42交换因素GEFT (RhoA)。
讨论
在这项研究中,我们调查了表达水平的可溶性蛋白质组肺泡巨噬细胞在结节病的患者与健康对照组相比,与识别的目的特定蛋白质和途径参与结节病的发病机制。发现的69种蛋白质组间显著改变,我们能够确定25独特的蛋白质质谱(表2和3)。后续路径分析显示,许多这些蛋白质与两个互补的通道中央macrophage-related immunofunctionality, Fcγ-mediated吞噬作用途径和clathrin-mediated内吞作用途径。这两个通路调节在结节病。吞噬作用的外源性病原体和相关endosome-vesicle网络代表了关键的初始步骤抗原处理和表示级联,一个中央肺泡巨噬细胞的功能。在结节病,后续步骤涉及抗原表达主要组织相容性复合体(MHC)二类分子CD4细胞的质膜+t细胞的诱导适应性免疫反应与一个典型的Th 1型细胞因子(4]。
多个互补模式在巨噬细胞的吞噬作用活跃,和Fcγ受体介导途径代表一个中央在先天反应机制。免疫球蛋白的Fc部分的绑定Fcγ巨噬细胞表面的受体激活一系列抗菌反应包括吞噬,炎性细胞因子分泌和代活性氧化物种8,28]。骑士,发现调节在结节病,已被证明是重要的监管主要人类巨噬细胞的吞噬作用[29日,30.]。另一个途径与实验相关的机制、clathrin-mediated内吞作用通路,还发现在结节病被改变,包括upregulation适配器蛋白质complex-2 (AP-2)和RAB11A。性大分子,如细菌,带入clathrin-coated膜囊泡的细胞来源于通过内吞作用的质膜内陷。内吞作用也是一项重要的一步Fcγ-mediated吞噬作用,以及抗原MHC II级处理,这是不可分割的一部分与装甲运兵车肺泡巨噬细胞的功能。AP-2是clathrin-mediated核心蛋白的内吞作用的途径和已被证明是高度活跃在endosomal贩卖的MHC II级抗原表达。RAB11A可以调节膜流量(31日)在人类巨噬细胞的吞噬作用,(26)和胞内运输囊泡的融合32,33]。最后γ-interferon溶酶体硫醇还原酶(镀金),还发现调节在结节病,是一种可溶性硫醇还原酶持续表达的装甲运兵车,和随后的CD4抗原呈递和重要+在结节病[T淋巴细胞激活34]。这种酶可以降低处理蛋白质的二硫键,从而促进肽加载到HLA-molecule peptide-binding沟,和最近表明,镀金的需要正确的MHC I表示病毒糖蛋白(30.]。总的来说,这些结果显示的upregulation数量的蛋白质相关抗原表达机制在肺泡巨噬细胞在肺结节病的患者与对照组相比。
蛋白质的大量变量研究通过一个相对较小的蛋白质组学分析的主题提出了挑战,从传统的单变量统计和结果,可能是由于大量的假阳性不可靠。多元分析提供一个良好的补充在这种情况下,多个测试可以避免的问题,同时,组学分析固有的协方差很大程度上是考虑的统计分析。相比之下更常用的PCA模型,OPLS分析是一个监督方法设计退出兴趣方差的预测方差无关(正交)感兴趣的假设,从而作为噪声滤波器,提高了多变量模型的可解释性,特别是有关观察组分离特定的蛋白质生物标记物(35]。OPLS因此集中预测服务信息到一个单独的组件,从而使更容易识别感兴趣的生物标志物,以及一种改进和更准确的评估选定的生物标志物的预测能力。生成的OPLS模型显示一个强大的分离组(R2Y = 0.86)具有良好的预测能力(Q2= 0.41),特别是在考虑到有限数量的个人包括在研究(图2一个)。相同的蛋白质变量显著改变了单变量统计措施推动OPLS模型,从而验证这些发现的另一种手段。VCP是排名最高的变量之间的歧视结节病病人和健康(图2 b)。也称为p97 VCP,过渡内质网atp酶参与多种机制,包括膜融合(36),监管NF-κB的转录激活通过抑制剂(I)κB退化(37和细胞凋亡6),以及内质的reticulum-associated退化系统[38]。VCP网络是复杂的,调节多个信号通路通过40个不同的特定适配器蛋白质(39]。VCP受到转录后修饰,导致火车斑点检测的二维电泳凝胶。考虑到只有一个蛋白质斑点(图4),而不是整个现场培训(图4 b)改变,VCP不利于传统验证通过免疫印迹。因此,替代生物信息学方法进行了验证,包括上述多元模型的交叉验证,以及通路和网络分析探讨生物观察到变化的可行性。网络分析显示,除了VCP, 10的25蛋白质识别为显著改变在结节病与扩展NF-κB-node网络(图3)。
临床上,肺结节病可分为洛夫格伦综合征患者和那些没有。洛夫格伦综合征患者出现急性发作肺部CD4 / CD8 t细胞比例升高,双侧肺门腺病、踝关节炎和/或结节性红斑。这个病人组提出了自发的决议的2年内没有任何治疗。相反,没有洛夫格伦综合征患者一般表现为少不同的临床表型和经常开发一个持续的炎症和肺纤维化(∼20%)。因此,它极大的兴趣识别分子标记和分子途径可以区分这两种截然不同的疾病。OPLS分析调查差异洛夫格伦和non-Lofgren的患者提供了一个非常强大的模型组(图S1)的明确划分,骑士和RhoA,与吞噬作用有关,都是开车最变量。的紧密的聚类是一个重要的观察洛夫格伦的病人(S1, S2, S6和S7),相比之下更non-Lofgren分散组的患者(S3、S4和S5),反映患者的临床表型Lofgren显示一个独特的和典型的急性发作而non-Lofgren病人更异构临床表型。考虑到有限数量的个体病人各自的子组,解释应该执行一些谨慎。然而,模型的鲁棒性的预测力为72% (Q2= 0.72,基于7倍交叉验证)表示这些发现的一些有效性。
据我们所知,这是第一个定量蛋白质组学研究进行孤立的肺泡巨噬细胞结节病的病人。通过结合全球蛋白质组学分析与路径分析工具,更多的系统水平的理解如何观察可溶性蛋白质组的改变肺泡巨噬细胞与胞内信号通路参与结节病可能会实现。这些结果代表了进步在理解结节病发病机理的复杂性,一些蛋白质与互补实验和抗原表达机制似乎是重要的。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明
这项工作是支持的瑞典心肺基础,瑞典医学研究委员会,美国国立卫生研究院,美国胸科学会,结节病研究基金会,索德伯格的基础,国王奥斯卡二世禧年的基础,斯德哥尔摩郡议会、VINNOVA VINNOVA设计由玛丽·居里行动共同资助的项目,和卡罗林斯卡医学院。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2011年10月13日。
- 接受2012年9月15日。
- ©2013人队