摘要
我们评估基因型MTBDR的性能sl(海恩Lifescience公司内仁,德国)用于检测抗二线结核病和我们的突变不同的频率相关联结核分枝杆菌基因型。
我们测试根据标准175株和59个临床标本解释结果的诊断准确性的建议报告。所有菌株也通过spoligotyping和串联重复打字的分支杆菌散布重复单位变量数目的影响。
MTBDR的性能sl临床分离株对氟喹诺酮类药物(FQ)、二线注射药物(SLID)和乙胺丁醇(EMB)的耐药检测结果相似(特异性~ 99%,敏感性~ 70%,阳性预测值(PPV) ~ 99%)。
在59个呼吸样本中,三个样品被归类为“不确定”。检测电阻的特异性对于FQS和EMB100%(95%CI 92.7-100%)和100%(95%CI 83.9-100%),PPV分别为100%(95%CI 64.6-100%)分别为100%(95%CI 87.9-100%)。检测滑动表现出89.1%的特异性(95%CI 77.0-95.3%),PPV为58.3%(95%CI 32.0-80.7%)。用于FQ电阻检测的灵敏度为100%(95%CI 64.6-100%),而对于滑动和胚胎为89.1%(95%CI 77.0-95.3%)和86.1%(95%CI 71.3-93.9%),分别。我们检测到突变之间的重要关联rrs基因和北京血统。
的MTBDRsl可用于“统治”在高风险群体中结核病的广泛耐药菌株;当未识别突变时,低灵敏度和负预测值(NPV)通过常规药物易感性测试进行确认。北京菌株的杆状杆的NPV较高,表明分子试验的预测值与遗传背景有关。
耐药结核病(TB)仍然是全球主要的公共卫生问题[1].短程化疗的疗效因多药(MDR)的出现而受到损害结核分枝杆菌菌株,即。至少对利福平和异烟肼有耐药性的菌株,以及广泛耐药(XDR)菌株,即对任何氟喹诺酮(FQ)和卷曲霉素、卡那霉素、阿米卡星(SLIDs)中至少一种二线注射药物有额外耐药性的多药菌株[2那3.].截至2010年,在68个国家报告了至少一例广泛耐药结核病例[1].
耐多药结核病和广泛耐药结核病的快速检测是必要的,以便患者转诊到专科中心,从而确保足够的感染控制条件下,正确的治疗[4.那5.].
目前,与耐药相关的基因突变的直接检测是唯一用于预测抗性的快速方法。线探针测定(LIPA),依赖于多重核酸扩增和逆转录的基于条带的DNA探针试验,可商购获得多种抗生素电阻。
特别是基因型MTBDR和MTBDR+测定(Hain LifeScience,Nehren,德国)表现为预测利福平和低于痰涂层阳性样品的异尼抗抗性的高度敏感和具体的测定[6.].
2008年,世界卫生组织(世卫组织)发布了一项关于快速筛查耐多药结核病风险患者的政策声明,提出了在结核病国家规划中使用分子LiPA的建议[6.那7.].它们的使用大大缩短了在高危人群中发现耐多药结核病病例的时间,从而防止了由于患者管理不善而产生耐药性。
最近推出了第二代LiPA MTBDRsl用于检测导致对广泛耐药结核定义药物FQ和SLID以及乙胺丁醇(EMB)耐药的最常见突变。很少有研究比较MTBDRsl,并通过与黄金标准表型药敏试验(DST)进行比较来评估其性能[8.-12];此外,只有一项此类研究直接对临床标本进行了评估[8.].因此,需要更多的数据,以更好地理解该分析在临床实践中的有用性。
到目前为止,还没有研究报告有关所分析菌株的基因分型信息。基因型与耐药相关基因突变频率之间的关联仅在一线耐药(FLD)中完成,而二线耐药(SLD)相关基因的数据尚不可用[13那14].在这里,我们评估了MTBDR的表现sl通过对175临床分离株和59个临床标本的DST和测序进行比较。此外,我们首次报告了涉及滑动和不同的突变之间的关联玉米菌菌基因型。我们提供了在不同地理环境下如何通过考虑的系统地理分布来改变分子测试的表现的原理证明玉米菌菌.
材料和方法
临床标本
根据国际指南,从59个已净化的耐多药病例临床标本中提取DNA,使用N- 乙酰基半胱氨酸/ NaOH调节过程中,被包括在研究中。所有样品均为抗酸杆菌阳性,根据痰涂片镜检。相应的菌株的表型敏感性已被测定。
DST
对FLD和SLD的易感性由Bactec™MGIT™960系统(MGIT)(BD Bioscience,Erebodegem,Belgium)进行[15].
DNA提取
如别处所述从菌株和临床标本中提取基因组DNA [16].
基因型®MTBDRsl分析
从分离株中提取的DNA进行扩增,按制造商的说明进行。痰标本采用改良的扩增方案:用HotStarTaq DNA聚合酶扩增20个周期,2 U,扩增40个周期。
排序
利用针对每个基因组区域的特异性引物,对存在耐药突变的基因组区域进行扩增和测序(表S1)。
Spoligotyping
使用spoligotyping试剂盒(Ocimum Biosolutions,海德拉巴,印度)按照制造商的说明对临床分离株进行直接重复位点扩增调查。Spoligotyping结果以二进制格式输入MIRU-VNTR+鉴定spoligotype国际类型(sit)和菌株主要谱系的网络数据库[17].最佳匹配谱系鉴定通过相似性搜索(距离设置:<0.1)。
微板Alamar蓝测定法
测定根据具有微小修改的标准程序进行[18].EMB浓度从256微克·毫升不等-11μg·毫升-1.玉米菌菌H37Rv作为药敏参考株。最低抑菌浓度(MIC)≥4 μg·mL-1被认为是抗EMB的。
结果
港铁的表现sl临床分离株
MTBDR的表现sl在175个临床分离物中评估测定。由于缺乏杂交,在一种分离物中获得不确定的结果。
FQS.
面板菌株包括57个表型抗性分离物和117个FQ易感菌株(表2.). MTBDR正确鉴定了FQ耐药菌株sl在73.7%的病例中。在6例病例中,同时检测到野生型(WT)和突变DNA序列,这一发现提示混合感染。在两个案例中,基因突变Gyra.通过野生型探针WT3的缺失杂交推测;特异性探针未检测到氨基酸取代D94Y。94和90密码子是最常发生突变的(分别占耐药株的26.3%和19.3%)。7.0%的患者出现S91P突变。所有WT杂交后,表型抗性菌株中有26.3%为易感菌株Gyra.探针(通过测序确认的数据)。
除一个样本外,所有表型敏感菌株均通过试验得到正确识别。诊断性能总结见表3. 基因型®MTBDR之间的比较sl在线补充数据报告和测序数据分析(表S2)。
对已知FQ敏感的临床分离株进行基因型分析(表S3)。其中,76.9%的fq耐药菌株受感染Gyra.突变(表4S4)。在非北京血统中Gyra.突变和未突变的FQ抗性菌株存在严重重叠;北京血统与非北京血统之间无显著差异(p>0.05)。
滑动
在评价的174个菌株中,84株对至少一个滑动液耐药,90个易于所有药物(表1).MTBDR共检出耐药株60株(71.4%)sl化验(表5.),其中五个显示了双重模式。在一个,在次区域中的突变rrs探针WT1(核苷酸1401-1402)缺失杂交推测。一个与探针MUT2杂交的菌株(针对g1484t突变)经测序证明是WT。84株耐药菌株中有57株(67.9%)受a1401g的影响最为频繁(表S5)。c1402t只出现过一次(1.2%)。表型抗滑的24个品系为敏感品系;小波变换序列rrs通过测序确认。
所有表型易感的菌株都被该测试正确识别,诊断性能总结在表3.比较MTBDRsl测序数据分析在补充数据中在线报道(表S2)。
在所有三种SLIDs表型结果已知的菌株中,a1401g替换与卡那霉素、卡霉素、阿米卡星中至少两种药物的表型耐药相关(65例中57例(87.7%))。
北京的Spoligotype是最普遍的(表S3;突变细节在表S6中给出)。滑动抗滑块rrs78.3%的北京血统突变,59.0%的非北京血统突变(表4.). 差异有统计学意义(p<0.01)。
循证
83表型EMB-抗性和91 EMB-敏感菌株进行测试;表6.显示了LiPA和测序的比较。
在83株表型耐药菌株中,55.4%被MTBDR正确鉴定sl.在三种情况下,通过遗传测序确认通过缺乏杂交杂交的突变通过分别检测对应于M306i(ATG / ATC)和M306L的取代。最常见的突变分别在42.2%和12.0%的表型抗性菌株中观察到M306V和M306i。37(44.6%)表型对胚胎的菌株被分类为易感(通过测序证实WT探针的杂交)。表S7显示胚胎B差异。
54.9%的菌株正确识别出EMB表型易感性。在41例有差异的病例中,有28.6%的病例同时存在MTBDRsl直接测序鉴定了密码子306的特定突变。MTBDR鉴定的12个额外的菌株sl通过缺乏WT杂交的抗性,临近M306i突变(Codon取代在ATG306ATC(n = 8)和ATG306ATT(n = 4))中。在两种情况下,MTBDRsl表现出双重模式;在第一种情况下测序导致WT,并仅在第二种情况下检测到M306i突变。最后,在最后的差异情况下,微弱的杂交信号导致误解,但在重新检查之后,确认了M306i替代的存在。
33株药物敏感菌株的mic值胚胎B突变(表7.)在31例中证实存在耐药性表型。诊断性能总结在表3.MTBDR的比较sl测序数据分析见表S2。
表S3中报告了调查了EMB耐药性的175株菌株的spoligotype(表型DST结果根据MIC结果进行调整)。北京和非北京血统中突变和非突变EMB抗性菌株的比例(表4.与表S8)相似(p>0.05)。
在MTBDR的整体性能sl表S9中报告了不同菌株谱系。
港铁的表现sl临床标本
与MTBDR测试的59个呼吸道标本中sl53项结果有效。3个样本(5.1%)未提供有效杂交的任何三个基因组区域,被归类为“不确定”。总的诊断性能总结在表3.
FQ.
表2显示了LiPA结果与对应菌株的DST结果的比较。的MTBDRsl确定了七种抗性菌株,全部由表型DST确认;其余49个样本,其特征在于WT模式,是DST的FQ易感性。整体一致性为94.9%。
滑动
表5显示了LiPA结果与对相应应变执行的DST之间的比较。12个样本通过MTBDR进行分类sl;其中4例检测到突变模式(a1401g), 1例WT探针杂交缺失,7例存在双模式。7个与a1401 g探针杂交呈阳性的样品经表型DST鉴定为抗性。相反,未与WT探针杂交或与a1484t探针杂交的标本对所有三种SLIDs均具有表型易感。在42个显示WT杂交的样本中,41个是表型敏感的,1个是阿米卡星抗性的。两个样本对卡那霉素有表型抗性,与rrs被认为是不确定的。MTBDR之间的一致性sl表型DST为81.4%。
循证
的MTBDRsl通过检测WT探针的替换和缺失杂交,在31个样本中鉴定出EMB抗性(表6.). 只有12例经表型DST证实耐药。从显示WT杂交模式的25个样本中,20个被DST确认为敏感,而5个被发现具有抗性。总体一致性为55.9%。
讨论
MTBDR之间的一致性sl和测序为> 95%的所有基因组区域进行分析。差异主要是由于双模式(WT +突变),其有问题的检测通过测序是已知的。在临床分离株,WT +突变模式很少发现(6宗为Gyra.基因,五rrs基因和两个embb.基因),仅在表型抗性分离物中。只在一个案例中只有MTBDRsl报道的突变(a1484t,rrs基因)不能由测序检测。MTBDR之间的一致性高sl测序结果与之前的观察结果一致[8.-12].
虽然在临床分离物上,在三种情况下重复分子测定以获得有效的结果(1.7%),在临床标本上,分子测定重复9例(16.1%)。大多数异常与之相关rrs扩增(例如暗带染色,无扩增)。在某些情况下,样品冷冻和解冻可能会降低PCR性能。临床标本表现的广泛置信区间反映了本研究可用的耐药临床标本数量较少,以及双模式(尤其是SLID耐药)的频率较高。然而,观察到FQ抗性的患病率为11.9%,滑动抗性的患病率为15.3%。尽管缺乏明确的数据,低负担国家结核病病例中FQ耐药性或耐药性的流行率在10%-15%之间。因此,我们的样本量提供了MTBDR诊断性能的评估sl在一个真正的设置。
FQS.
至于临床样本和分离,在MTBDRsl在检测电阻FQ,显示〜98%一个阳性预测值99%特异性。与此相反,灵敏度降低显著(73.7%),因为突变赋予在基因组区域FQ-电阻的可能不是由MTBDR靶向sl[21.那22.].NPV(88.6%)规定,只要存在易受影响的MTBDR,就必须通过常规DST进行确认sl获得的图案。
滑动
MTBDR的性能sl与FQ相似(特异性99.4%,敏感性71.4%,PPV 100%)。事实上,该试验只针对与耐药性表型发展有关的一个区域[22.那23.].由于NPV值低(79.0%),每个应变呈现易感MTBDR所需的常规DST确认sl模式。
五个虚假滑动阻力显着影响了MTBDRsl表现在临床标本。通过用混合感染(易感和抗性菌株)兼容双图案四个进行了表征,而第五,通过缺乏杂交与WT探针鉴定为抗性,但在其它分子检测呈现异常,这表明抑制剂或DNA降解的存在。然而,值得注意的一点是,病人还在痰涂片阳性的12个月后,尽管根据世界卫生组织的指引[耐多药结核病治疗4.].
据我们所知,这是关系到SLIDs异质性的第一份报告。DST无法证实混合,抗性和敏感,人口。然而,可能的是,通过H作为观测WT细菌的主要比例隐藏在表型测试的电阻illemann等等。[8.].
几组相关rrs阿米卡星、卡那霉素和卷曲霉素交叉耐药突变[23.那24.].我们观察到a1401g替换与至少两种滑鼠的表型抗性相关(87.5%)。一旦被证实,这种突变的检测可以为病人的治疗提供有用的线索。像Hillemann等.[8.]我们确定了耐受C1402T替换的所有三个滑动杆的应变rrs,这与一份仅将该突变与卷曲霉素和卡那霉素表型耐药相关的报告形成了对比[8.那24.].因此,之间的关系rrs突变和SLID交叉阻力仍是未知数。
循证
MTBDRsl提供了抗缺陷的差异。与表型DST,MTBDR相比sl特异性和敏感性较低(55%),主要是由于embb.密码子306在41个表型易感菌株中的突变。临床标本中获得了类似的结果。
MIC值解决了LIPA和DST之间的差异,而是对MGIT的表型EMB DST提出了担忧。我们的结果支持p的研究结果链接等等。[25.的报告,表型易感的菌株EMB和携带306密码子的突变embb.基因,在重新测试后发现有抗药性。这些发现引起了对EMB表型DST标准化的关注。事实上,V一个D.恩等等。[26.]突出显示emb的DST结果缺乏一致性。特别是,据报道,敏感性是~93%,所有第一线药物中所测试的最差的性能(利福平,异烟肼和链霉素)。EMB测试也是DST,显示较高的敏感性<80%,较低的敏感性> 100%。此外,发现重现性也很差[26.].尽管缺乏明确的实验证据,我们可以hypothesise电阻确定为用于测试介质中的作用;由此选择的截止值通过MGIT(5微克执行DST为EMB·毫升-1)可能低估阻力。确实,S.Carparo.等等。[27.结果表明,MGIT系统仅对以5 μg·mL为界限值的EMB产生了非常大的误差(假敏感结果)-1. 因此,当MIC结果用于EMB测试评估时,MTBDRsl特异性和敏感性分别升高至96.2%和69.7%,PPV在临床分离株中从56.2%增加到97.7%。
低NPV值(57.5%)可能是由MTBDR上的存在造成的sl密码子306的embB。
遗传多样性和突变频率
以往的研究表明,种群遗传玉米菌菌在地理上是高度的结构化[13那28.:每一种主要血统都与特定的地理区域相关联。事实上,遗传变异与地理区域之间存在高度相关性,并已在考虑到人类人口统计和移民的情况下进行了估计[28.].因此,对于每个地域设置有可能确定一个普遍玉米菌菌谱系,它已经假设,这种诡计多样性可能影响新诊断,药物和疫苗的发展[13].一些谱系显示了具有抗生素耐药性的“典型”基因的更高频率的突变。因此,分子检测的性能似乎可能受到在特定地理环境中传播的分枝杆菌谱系的影响。
到目前为止,分枝杆菌基因型和耐药基因突变发生率之间的关联研究仅针对利福平和异烟肼,而对滑动耐药基因的相关性研究尚不明确[14].spoligotyping鉴定的主要谱系中的突变频率使我们能够检测出两者之间的统计相关性rrs突变和北京菌株。相比之下,没有找到与胚胎相关或与FQ相关的突变的关联。
为了避免在我们的分析中包含克隆菌株,我们对所有北京分支的分离菌株进行了分枝杆菌重复序列可变数量(mycobacterium Interspersed Repeats - variable Number of Tandem Repeats, MIRU-VNTR)基因分型技术。一旦表型DST、分离年份和国家,以及耐药基因内的单核苷酸多态性(Gyra.那rrs那embb.那rpoB那韩国仁荷那katG那GIDB.那tlyA,EIS.)和MIRU-VNTR基因型(数据未显示)一起分析,北京谱系显示了足够的多样性,排除了克隆起源。因此,我们的数据似乎证实了北京菌株可能以更高的突变频率为特征,其细胞壁特征增加了MDR和高毒性表型[14].
临床后果
测定表型DST到FLD和SLID需要4-9周[29.那30.]. 快速分子分析的使用将诊断耐多药结核和广泛耐药结核的时间缩短到1-2天。我们是否可以推测MTBDR的使用sl在临床常规中允许在检测MDR表型后的1-2天内识别fq耐药和/或slid耐药病例?
在我们小组的28株广泛耐药结核菌株中,有13株(46.4%)被MTBDR识别sl有两个Gyra.和rrs突变。7例(25%)的测定鉴定FQ电阻和在以下四种情况(14.3%),以SLID抗性;4 XDR-TB菌株不窝藏由MTBDR针对性的基因突变sl被误认为易感染。因此,需要进一步研究,以更好地理解分子检测在正确检测广泛耐药结核病例中的临床附加价值。
由于高PPV和特异性,MTBDRsl允许发现表型耐药病例;无论如何,低敏感性和无核型使常规DST强制确认所有被分子测试列为易感的病例。研究结果证实了MTBDR的应用领域sl对选定的耐多药结核病患者进行筛查是否具有更高的广泛耐药结核病风险(例如广泛耐药结核病例的接触者、治疗失败、在特定疫情中筛查指示病例接触者,等).添加更多与FQ和slide抗性表型相关的基因组靶标可以提高MTBDR的性能sl在下一个未来。
MTBDR的重要优势sl测试是识别赋予低级电阻的异质电阻和突变的能力。事实上,异质抵抗实际上是在高电平电阻前开发电阻和低电平抗性的背景31.].
据我们目前所知,这项研究是第一次调查slid相关突变在玉米菌菌谱系。这似乎是mtbdrsl在不同的地理设置中执行不同。这种发现在临床实践中是相关的,因此应考虑局部流行病学特征评估旨在鉴定耐药性的分子试验的贡献。
总之,我们的研究加强了关于MTBDR表演的先前调查结果sl在更大的样本上。此外,我们提供了在滑动菌株中出现的应变谱系和突变频率之间的相关性,支持分子试验的性能可能受到这种神法的影响的假设。
致谢
本研究获得了欧洲共同体第七框架计划(FP7/2007-2013)的资助,资助协议为DMC的FP7-202145 (TM-REST)和FP7-223681 (TB-PANNET)。我们要感谢G. Sotgiu(意大利萨萨里大学生物医学科学系流行病学和医学统计股)和R. Centis(世卫组织结核病和肺病合作中心,意大利贸易国际癌症研究中心S. Maugeri基金会)进行了有益的讨论,并感谢Hain生命科学(Nehren,德国)提供基因型®MTBDRsl化验免费。
脚注
这篇文章的补充材料可从www.www.qdcxjkg.com
利益声明
有关这项研究的兴趣声明可在www.www.qdcxjkg.com/site/misc/statements.xhtml
- 收到了2011年9月20日。
- 公认2011年12月23日。
- ©ERS 2012