摘要
介绍淋巴管平滑肌瘤病(LAM)与结节性硬化症(TSC)或散发性疾病(S-LAM)有关。S-LAM发展的危险因素尚不清楚。我们假设DNA序列在TSC2/TSC1可能与S-LAM易感性相关,并进行了全基因组关联研究(GWAS)。
方法采用条件logistic回归方法,将426名S-LAM患者的5 426 936个单核苷酸多态性(SNPs)的基因分型和输入数据与来自COPDGene的852名女性的相似数据进行配对病例对照设计。在复制研究中,对196名非西班牙裔白人女性S-LAM受试者的基因型与三组不同的对照组进行了比较。同时进行RNA测序和免疫组化分析。
结果两个非编码基因型SNPs具有全基因组意义:rs4544201和rs2006950 (p=4.2×10)−8和6.1×10−9,respectively), which are in the same 35 kb linkage disequilibrium block on chromosome 15q26.2. This association was replicated in an independent cohort.NR2F2(核受体亚家族2组F部件2),核受体和转录因子,是唯一的附近的蛋白质编码基因。NR2F2表达通过RNA测序高于一个腹部LAM肿瘤和四个肾血管肌脂瘤,一个LAM-相关肿瘤,与来自癌症基因组图谱的所有癌症比较。免疫组化显示两个LAM和血管平滑肌脂肪瘤瘤强大的核表达。
结论染色体15q26.2的SNP与S-LAM相关联,并且染色质和表达数据表明,可以通过对作用发生这种关联NR2F2表达在S-LAM的发展中扮演着重要的角色。
摘要
GWAS鉴定了附近两个snp的等位基因NR2F2即用零星的淋巴管肌瘤病有关。NR2F2是高表达在这两个LAM和LAM-肿瘤相关的转录因子,和NR2F2是一个新的LAM基因。http://ow.ly/87xx30oiVhZ
介绍
淋巴管平滑肌瘤病(LAM)是一种罕见的侵袭性低级别肿瘤,几乎只侵袭育龄及以上的女性,并可导致进行性囊性肺破坏,导致严重疾病患者的致命呼吸衰竭[1- - - - - -6]。LAM的特征是肺内无数微小簇状的平滑肌样和上皮样细胞的异常增殖,并伴有薄壁囊肿和肺实质破坏[7,8]。Progressive cyst enlargement and inflammation contribute to decline in lung function measured as both decreased forced expiratory volume in 1 s and diffusing capacity of the lung for carbon monoxide. The diagnosis of LAM is based on clinical features, chest computed tomography findings of thin-walled cysts and either pathology seen on lung biopsy or elevated serum vascular endothelial growth factor (VEGF)-D levels.
l我occurs at high frequency (>10%) in females with tuberous sclerosis complex (TSC) and at much lower frequency in females (∼1 in 100 000) without that disorder, in which it is called sporadic (S)-LAM. TSC is due to germline and/or mosaic mutations in eitherTSC1(25%)或TSC2(75%)[9]。在TSC肿瘤发展遵循在另一个对应等位基因的体第二命中突变在肿瘤[补足的种系突变的经典模型努森9,10]。有限的数据可用于S-LAM,但现在看来,TSC2突变被认为在绝大多数S-LAM病变。关于S-LAM科目的50%有肾脏血管平滑肌脂肪瘤,这是在与TSC成人的70%-80%出现了肿瘤。错构瘤组织学股份,表达并用LAM遗传特征,虽然病变不病理相同。
全基因组关联研究(GWASs)被用来识别与复杂性状和常见疾病相关的遗传变异和易感性位点。虽然没有基因影响S-LAM发育的先例,但我们推测DNA序列变异在S-LAM外TSC2/TSC1可能与疾病风险相关联,并得不到承认,由于这种疾病的发病率较低。
方法
发现群
600多名女性S-LAM患者最初2010 - 2014年期间,来自14个国家识别和收集通过国际招标(补充表S1)。S-LAM患者由治疗医生根据标准诊断标准进行诊断[1- - - - - -5,7]。使用QIAamp DNA Mini试剂盒(Qiagen, Hilden, Germany)从唾液中提取基因组DNA, 479份S-LAM DNA样本使用Infinium OmniExpress-24 version 1.2 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, USA)进行基因分型,该试剂盒检测了整个基因组的716 503个单核苷酸多态性(SNPs)。34名非白种S-LAM受试者被排除在进一步分析之外。在这组受试者中没有自称的西班牙裔。
从相同的基因分型芯片的基因型数据是可用于从COPDGene财团1261名健康女性志愿者和从dbGaP(获得www.ncbi.nlm.nih.gov差距;phs000951.v2.p2.c1)。这些COPDGene参与者吸烟至少10包,年龄45-80岁,没有已知的慢性阻塞性肺病[11]。
全基因组归责
我们进行了全基因组的所有常使两个基因分型和单核苷酸多态性估算协会发现归集。归责是使用桑格归责服务(进行https://imputation.sanger.ac.uk)。我们使用单倍型参考联盟发布1.1版的参考面板,并认为主要是欧洲血统[16]。与Eagle2版本2.0.5 [先进行预相位17],然后是PBWT(定位Burrows-Wheeler变换)包[18根据通过Sanger插补服务建议的插补管道用于插补。插补精度与INFO指标[评估19]。估算的SNP被过滤掉,如果为Hardy-Weinberg平衡测试的相关信息,或的MAF p值分别为<0.3,<0.05或<1×10−5, 分别。
与遗传数据的统计分析
EIGENSTRAT [20]也适用于合并的数据和主成分(PC)分数计算。使用PC评分来检测具有异常遗传背景的受试者,然后将这些异常值(3名受试者)剔除(图1)。
为了确保病例和对照的匹配,我们使用了条件逻辑回归(CLR)。每个案例都与两个使用R包匹配的控件进行匹配[21]。匹配质量受使用的PC分数的数量影响,我们评估了有效匹配需要多少PC分数。两个个人电脑的得分给出了最接近1的基因组膨胀系数(补充图S1)。因此,CLR通过在匹配的病例和对照调理与前两个PC分值进行。我们的CLR可以如下表示。
为了我th地层: 哪里YIJ和XIJ的表型和包括snp在内的协变量j主题在我分别对应地层。对于协变量,包括10个PC分数来调整额外的人口子结构。采用R包生存期进行CLR分析[22]和全基因组显着性为p <5×10评估−8。
我们应用PICS软件将所有估算和单核苷酸多态性基因分型与显示LAM协会来计算是原因SNP [每个个体SNP的概率23]。
我们还使用SKAT-O统计数据对全基因组显著性SNPs附近的基因与LAM的相关性进行了基于基因的分析[24]。我们包括在这个分析没有MAF截止纳入所有基因型的SNP。年龄,年龄平方和10个PC分值作为协变量。
复制数据
复制分析是在一组独立的196名非西班牙裔白人女性S-LAM受试者身上进行的,该研究由美国国立卫生研究院临床中心(贝塞斯达,马里兰州)的一名合著者(J.M.) (补充表S1)。仔细推敲被第三个独立党(“诚实的经纪人”)进行比较的在复制人口主要分析和患者考生用来选择那些没有在主要分析分析对象的名称。基因分型采用TaqMan SNP基因分型测定和C_832391_10为C_27296040_10的SNP rs2006950和rs4544201,分别为(赛默飞世尔科技,沃尔瑟姆,MA,USA)进行。从发现研究九个随机选择的S-LAM受试者也用这种方法来确认基因分型的精度在复制分析基因分型。他们的发现研究基因型完全匹配的荧光定量分析基因型和没有包括在复制分析这九个科目。我们使用了三个独立的数据集作为对照在复制研究比较:1)409非西班牙裔白人从COPDGene财团健康的女性谁不用于发现的分析,2)1121名动脉粥样硬化的多种族研究的西班牙裔白人女性(从dbGaP(phs000209.v13.p3获得MESA)数据集)[25] and 3) 225 731 British White females from the UK Biobank dataset [26]。对于每个对照数据集,我们使用基因型或输入数据作为全基因组显著性snp。
拓扑相关域和染色质相互作用
为了识别染色体15q26.2上感兴趣区域的染色质相互作用,我们使用了两个三维基因组浏览器(www.3dgenome.org和https://yunliweb.its.unc.edu/hugin)来预测拓扑相关联的域(TAD的)27,28]。我们检查了全基因组显著性snp周围的TADs,并调查了每个TAD的蛋白编码基因。我们分析了4个离LAM最近的细胞系/组织的TADs: 1)人胎儿肺成纤维细胞(IMR90), 2)肺相关组织,3)h1来源的间充质干细胞(H1-MSCs)和4)人脐静脉内皮细胞(HUVECs)。
与RNA测序数据的统计分析
在一个腹部LAM肿瘤,并在哈佛大学和麻省理工学院(波士顿,MA,USA)的Broad研究所4个肾血管平滑肌脂肪瘤进行全转录RNA测序分析。(A)的cDNA捕获随后cDNA文库合成(Truseq RNA文库制备试剂盒; Illumina公司)简言之,使用聚进行mRNA的测序和测序上Illumina公司的机器,以下相同的方法和在相同的设施,其中所述基因和组织表达(发生GTEx)RNA测序项目[29]。读出的数据被处理成与标准质量控制方法FASTQ文件和对准到基因组(基因组参考联盟GRCH37(hg19)),使用顶帽版本2.0.10 [三十]。FASTQ文件也被转换成RSEM (RNA测序的期望最大化)格式[31]。RSEM值与来自27个不同的组织学类型的肿瘤2463从癌症基因组图谱(TCGA)[RNA测序数据进行比较32]。RPKM(每百万映射每千个碱基读取读取)的值NR2F2(nuclear receptor subfamily 2 group F member 2) were compared with the GTEx dataset of normal human tissues with the limma statistic (11 688 RNA sequencing samples from 53 normal tissue types, version 7 release) [29]。
我们也在寻找独联体-expression数量性状基因座(eQTL),用于使用所述GTEx发布版本7数据库与关联到LAM连锁不平衡块所有SNP [29]。该资源提供了转录起始位点上游和下游1mb范围内所有snp的每个snp基因对的eQTL分析结果。FastQTL由这个资源(www.gtexportal.org/home)为顺式eQTL映射(33]与三甲PC分值的协变量调整,基因分型平台,性别以及使用该方法PEER [确定了一组相关的变量的34]。
免疫组化分析
免疫组化按其他方法进行[35使用针对原代小鼠单克隆抗体]NR2F2(ab41859; Abcam, Cambridge, MA, USA; concentration 1:100 (10 μg·mL−1))。简单地说,福尔马林固定的、石蜡包埋的肿瘤切片在二甲苯中脱蜡,再水合,在EDTA (pH 8.0)中进行抗原检索(美国加州普莱森顿诊断生物系统公司)。3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶活性;用5%羊血清阻断,4℃抗体孵育过夜,TBS/ t吐温20洗涤,抗羊二抗孵育(Vector, Burlingame, CA, USA;稀释施用)。过氧化物酶反应是使用3 3ʹ-diaminobenzidine衬底(DakoCytomation、斯特鲁普、丹麦)。肺血管平滑肌脂肪瘤和肾血管平滑肌脂肪瘤的染色方法相似。
结果
S-LAM的GWAS分析识别15号染色体上基因间2组的SNP
经过多次过滤,去除snp和样品,如所述方法和所示图1,GWAS was performed on 426 S-LAM subjects and 852 control subjects from the COPDGene project, for 5 426 936 SNPs (549 591 genotyped and 4 877 345 imputed) using CLR. 20 noncoding SNPs on chromosome 15 met genome-wide significance, of which two had been directly genotyped (rs4544201: p=4.19×10−8;rs2006950:P = 6.12×10−9)(表1)。
对的CLR和曼哈顿地块位数 - 分位数图表明,观察到的p值的分布符合期望分布,与20个SNP的异常(图2),表明分析是自由系统的p值通货膨胀(基因组通货膨胀系数1.025)的。PC分值的散点图在发现分析表明病例和对照之间的相似性(补充图S2)。来自COPDGene队列的所有受试者都是吸烟者,这可能导致了与尼古丁成瘾相关的snp之间的联系。我们从GWAS目录中查找与尼古丁成瘾相关的snp值[36],并与相关的SNP其他(R2> 0.8)(补充表S2)。这些单核苷酸多态性均未发现在LAM和COPDGene同伙等位基因频率的显著差异,表明我们的研究结果不受尼古丁成瘾的SNP。
附近的连锁不平衡块全基因组单核苷酸多态性显著使用Haploview使用默认选项[确定37]。所有20个SNP,其中包括两个直接基因分型,rs4544201和rs2006950,属于上15q26.2同一连锁不平衡块;the latter two SNPs were 11 563 nucleotides apart and were strongly correlated (D'= 0.977,R2= 0.854)(补充图S3)。根据两个snp的邻近性和它们的连锁不平衡关系,可能在该区域存在一个单一的易感位点。它们位于基因沙漠之间MCTP2(含2的多个C2和跨膜域;1.1 Mb远)和NR2F2(700 kb away) that contains many long noncoding RNAs (图3)。两者的SNPs有轻微的和A和G的主要等位基因,而在S-LAM队列比对照群体显示较低的MAF。在S-LAM队列单个次要等位基因的OR值分别为0.49和0.47,分别在与对照比较人口(表2)。要调整为“胜利者的诅咒”可能造成的影响,我们使用BR2(38,发现rs4544201和rs2006950的偏差调整or值分别为0.57和0.53。
我们计算了基因型SNPs解释表型变异的比例, 。估计 根据疾病的患病率变化(补充图S4)。患病率为10万分之一的女性, 为15%(基于所观察到的0-1刻度0.3%)。
鉴于TSC2突变一致发生在LAM细胞,遗传变异体中每一个的TSC1和TSC2被认为是先验考生与S-LAM关联。Hence, we checked SNPs within 1 Mb away from either gene. There were 566 and 416 SNPs forTSC1和TSC2,respectively, and only rs11552431 (located at 16:1 823 024, 274 kb away fromTSC2在CLR)是显著以Q <0.1(标称p Bonferroni校正后= 5.97×10−5)。我们认为包括SNP和九人与这些基因作为CLR协最低的p值。rs4544201和rs2006950的意义改微创下面这个调整(补充表S3)。
1)409的非西班牙裔白人健康:两个全基因组显著和基因分型的SNP,这是在各自的三个控制数据集进行基因分型在196额外的非西班牙裔白人S-LAM患者并与SNP等位基因频率进行复制的分析COPDGene女性谁不用于发现的分析,2)1121名西班牙裔白人从MESA数据集女性[25,39] and 3) 225 731 British White females in the UK Biobank dataset [26]。在所有三组比较中均观察到这些snp的小等位基因与S-LAM之间存在相似的or关系(表2)。此外,我们还将LAM患者中两个snp的MAFs与其他7项研究(由非西班牙裔、欧洲白人或美国人组成)的MAFs进行了比较,包括所有英国Biobank个体。LAM患者中两个snp的MAFs明显小于其他队列的报道(补充表S4)。
要尝试识别与低的p值的SNP之间的因果SNP(S),我们进行了PICS分析对所有SNP表1。rs41374846曾与林都显著协会和最大的PICS概率(P图片= 0.65)(补充表S5),使其成为该关联中的候选因果SNP [23]。
我们也质疑GTEx数据库中可能有任何基因的表达水平的eQTL关系这个连锁不平衡块的SNP。没有进行鉴定。
协会GWAS-显著与单核苷酸多态性NR2F2
大多数与人类疾病或其他表型相关的SNP的被认为通过在增强子区或编码基因的包含SNP [在TAD内的其它调控元件的影响,以使关联40]。以鉴定含有这些SNPs的TAD,我们使用可用于四种组织TAD信息:IMR90细胞[41,肺组织[42],H1-MSC的[43和HUVECs [41]。补充数据S5-S8显示包含GWAS snp和的3mb区域的Hi-C热图NR2F2对于这些细胞/组织。HUGIN显示rs4544201之间的p值和NR2F2分别为<10-18对于IMR90细胞,<10-16对H1-MSC和〜0.1为肺组织(没有可用的血管内皮细胞)28]。因此,包含我们与显著的SNP相互作用的区域NR2F2在IMR-90细胞和H1-MSC的基因组区域。
NR2F2是包含相关的SNPs的TAD内唯一的蛋白质编码基因。这表明,该SNP区域可能影响的表达NR2F2它与S-LAM关联的机制。
为了进一步验证这种可能性,我们使用SKAT-O对GWAS SNPs周围的15号染色体2 Mb区域的三个蛋白编码基因中的每个SNPs进行了基于基因的关联分析。NR2F2是位于该染色体区域的三个基因中唯一显示出显著相关性的(p=0.03) (表3)。
NR2F2,也称为COUP-转录因子II,编码的成员的类固醇/甲状腺核受体超家族的激素[44在许多发育过程中起重要作用,包括神经嵴[45],它被认为是LAM的来源的潜在候选小区[46,以及淋巴管生成和血管生成[47]。因此,我们认为这是与林郑月娥(表2),并进行进一步研究。
分析NR2F2肾血管平滑肌脂肪瘤和LAM
使用RNA测序数据,我们比较了来自TCGA [四个肾血管肌脂瘤,并具有广泛组的人类癌症之一腹部LAM肿瘤(基因表达32])和正常组织(从GTEx [29])(图4)。NR2F2lamo相关肿瘤的表达高于TCGA癌(图4a),并也相对高度与正常组织相比,在表达LAM相关肿瘤(P = 6.38×10−6, limma统计)(图4b)48]。相比之下,其他两个基因,SPATA8(精子发生相关联的8)和MCTP2,that were next closest to the SNP region showing association with LAM (1.1 and 1.2 Mb distant) (图3b)在与ram相关的肿瘤中无表达(数据未显示)。
免疫组化分析也显示出强大的核表达NR2F2在两个LAM肺切片(N = 8)和肾血管肌脂瘤切片(N = 4)(图5)。
讨论
LAM在育龄女性几乎都发生。谁前来就医的大多数病人LAM是散发病例无需TSC和LAM的S-LAM患者的起源是完全陌生的。在本研究中,我们在一大群S-LAM科目进行了GWAS。20我ntergenic SNPs were identified in a 34 kb linkage disequilibrium block on chromosome 15, which met genome-wide significance for association with LAM, including rs4544201 and rs2006950 that were directly genotyped (表1)。这种关联在验证种群中得到了复制。
与关联到S-LAM在于上远端染色体15q26.2的基因沙漠的SNP。最近的蛋白质编码基因NR2F2而考虑到染色质TADs在这一区域的分布,仅表明NR2F2在/于含有表示与四个相关细胞/组织S-LAM关联的SNP的TAD区域的边界,这表明这些SNP等位基因可能影响NR2F2表达为其与S-LAM发育相关的潜在机制。
NR2F2是一种孤核受体,在发育和肿瘤发生过程中具有已知的关键功能[49],使其成为LAM发病有希望的候选驱动性基因。林几乎全部发生在女性,雌激素水平的影响LAM和发展[50,51]。在MCF-7乳腺癌细胞敲低雌激素受体α的小干扰RNA降低NR2F2表达,而用雌二醇处理增加了其表达[52]。雌激素受体α和之间的相互作用NR2F2也可起到LAM发展中的作用。
NR2F2在具有大癌症和正常组织的数据集,和比较高表达在LAM和血管肌脂瘤通过RNA测序分析NR2F2示出高的表达与在两个LAM和血管肌脂瘤通过免疫组织化学的核定位。尽管我们没有发现任何与S-LAM在任何正常组织或癌症类型相关联的任何基因的单核苷酸多态性20的eQTL关系[29],可能的是,存在对LAM细胞这样的eQTL关系。我们还注意到,这些SNPs的区域包含几个非编码RNA的长,一些反义转录物和微小RNA miR1469(图3b)。这可能是一个或多个这些非编码基因的表达水平由这些SNP等位基因的影响,在LAM发展中的作用,这需要进一步调查的可能性。
在LAM淋巴参与是一个标志性病理特征,与肺中的LAM细胞簇表示淋巴管[标记富集53,54]。VEGF-D可能是LAM淋巴管生长的驱动因素,大部分LAM患者血清VEGF-D水平升高,可作为LAM的诊断性biomarker [55]。在小鼠中,NR2F2已被证明是必需的,用吗SOX18(SRY-框18),用于的偏振表达PROX1(普洛斯彼罗同源)在主静脉内的内皮细胞的一个子集,在胚胎9.5天,一个事件,导致淋巴管内皮细胞的发展[56]。因此,两者之间也存在潜在的联系NR2F2,VEGF-d,淋巴发展和LAM的发病机制。
还有我们的研究可能存在的局限性。虽然我们的样本人群是大的罕见疾病如S-LAM,那也只是中等大小的GWAS的。为了获得足够的患者样本中,我们采用欧洲原产的S-LAM患者全球招聘战略。虽然我们的控制都来自美国,他们被选定为欧洲血统,以尽量减少群体分层的问题。此外,我们采用EIGENSTRAT从S-LAM患者和对照组中删除的遗传异常。最后,我们使用了CLR设计,每种情况下有两个对照匹配以进一步最小化由于遗传异质性混杂。以前的研究已经表明,CLR优于非条件Logistic回归如果用于匹配变量为真混杂变量和唯一的控制中等数量是通过匹配排除[57- - - - - -63]。我们还发现,CLR产生比非条件Logistic回归更显著的结果(补充表S6)。功能分析证实了我们的假设NR2F2被受此SNP基因是由于限定于缺乏可靠的LAM肿瘤细胞系中,丰度非常低的LAM细胞在LAM肺标本(通常<5%)的,缺乏LAM动物模型。
总之,我们的GWAS已经确定染色体15q26.2,其等位基因与S-LAM,它位于一个TAD含孤核受体相关的非编码的SNPsNR2F2,这表明一个模型,其中这些SNP等位基因影响NR2F2从而引发LAM发病机制。NR2F2相对高度在LAM和LAM相关的肿瘤表达。NR2F2以前没有牵连LAM,而这些新的和意外的发现将有望带来更好的理解这往往渐进和致命的肺部疾病的发病机制。
补充材料
确认
我们感谢所有谁参加这个研究项目的LAM患者及以下个人谁对对象招募贡献:休伯特·沃茨(Universitätsklinikum,莱比锡,德国),光圈巴斯(LAM意大利,帕维亚迪乌迪内,意大利),CORINE杜兰德(协会FLAM,巴黎,法国)莱斯利Bogoslavski(以色列LAM组织,耶路撒冷,以色列)和莫迪凯克莱默(贝林松医院,佩塔提克瓦,以色列)。文学硕士Pujana感谢林西班牙协会(AELAM)的支持。
脚注
这篇文章有提供补充材料www.qdcxjkg.com
数据和代码的可用性:主GWAS和复制的数据将通过dbGaP(被提供在这个工作的出版物www.ncbi.nlm.nih.gov差距)。
作者贡献:贡献工作的构思和设计:S.韩元,E.K.西尔弗曼,G Hunninghake和D.J.Kwiatkowski。贡献数据的采集,分析或解释:所有的作者。起草工作或修改批判它重要的知识内容:所有作者。版本最终批准予以公布:所有作者。协议是对各方面工作的负责人:所有的作家。
利益冲突:W. Kim还没有透露。
利益冲突:K. Giannikou有没有透露。
利益冲突:J.R.德赖尔已经没有透露。
利益冲突:S.李有没有透露。
利益冲突:M.E. Tyburczy没有什么要披露的。
利益冲突:E.K.西尔弗曼在研究进行期间报告赠款NIH;酬金从诺华研讨会参与;并授予和葛兰素史克公司的差旅补助,提交作品之外。
利益冲突:拉齐科沃斯卡没有什么要披露的。
利益冲突:S. Wu没有什么要披露的。
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利益冲突:G. Hunninghake从Genentech公司,勃林格殷格翰,格理集团和三菱化学,外提交的工作报告个人费用。
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利益冲突:赢球有没有透露。
利益冲突:D.J. Kwiatkowski没有什么要披露的。
支持声明:这项研究是由科学,信息通信技术和未来规划部的LAM基金会,约翰·阿德勒,对TSC和LAM研究的恩格斯基金和生物协同研究项目(NRF-2017M3A9C4065964)通过韩国国家支持研究基金会和院内研究计划,卫生部,国家心脏,肺的国家机构和血液研究所。本文资金的信息已交存Crossref资助者注册表。
- 收到2018年11月27日。
- 接受2019年3月19日。
- 这项工作的内容是不是受版权保护。设计和品牌是版权©ERS 2019