文摘
背景突变骨形态形成蛋白II型受体(BMPR2)已发现先天性心脏疾病患者的肺动脉高血压(CHD-PAH)。我们的研究旨在阐明是否缺乏BMPR2信号行为通过下游效应器,抑制剂的dna结合蛋白(IDs)在心脏发育为冠心病患者的多环芳烃的进步。
方法确认id下游效应器BMPR2信号在心脏中胚层祖细胞(cmp)和导致PAH,我们cardiomyocyte-specific生成Id 1/3基因敲除小鼠(Ids cDKO), 12个25发达温和的多环芳烃与血液动力学的改变指数和肺血管重塑。此外,我们生成的ID1和ID3double-knockout (IDs KO)人类胚胎干细胞,重现了BMPR2信号缺乏CHD-PAH诱导多能干细胞(万能)。
结果心肌细胞分化的细胞则来源于CHD-PAH骨形态发生蛋白受体突变患者表现出不正常的心脏分化和减少钙(Ca2 +)瞬变,共焦显微镜实验就证明了这一点。Smad1/5磷酸化和ID1 ID3 CHD-PAH万能干细胞和表达式Bmpr2+ / -大鼠右心室。此外,超声显示33%的Ids cDKO小鼠心室中隔和肺返流可检测的缺陷。心肌细胞分离从鼠标右心室也显示Ca2 +瞬变和缩短观察。cmp的单细胞RNA序列分析发现受损的分化和表达下调USP9X表达式在IDs中KO细胞相对于野生型细胞。
结论我们发现BMPR2信号通过id和USP9X调节心脏分化,ID1的丧失和ID3表达有助于CHD-PAH患者心肌细胞功能障碍BMPR2突变。
文摘
这项研究首次报道,抑制剂的dna结合蛋白基因敲除小鼠肺动脉高血压,而开发的USP9X基因的下游效应器ID CHD-PAH患者心脏发育期间BMPR2突变。https://bit.ly/3ciUNim
介绍
肺动脉高压(PAH)是一种进行性疾病病理特色,包括肺微血管的增厚和缩小,导致肺血管阻力升高和右心室肥大,往往导致右心室衰竭(1,2]。在过去的二十年中,突变组件的骨形成蛋白(BMP)信号通路被发现患者的遗传形式的多环芳烃(3]。例如,突变BMPR2已确定先天性心脏疾病患者多环芳烃(CHD-PAH) [4]。到目前为止,相关的研究主要集中在肺血管重塑理解PAH / CHD-PAH的病因学BMPR2突变(5,6]。是否最终的心力衰竭患者的多环芳烃主要有关心肌细胞异常尚未阐明。
尽管先前的研究提供证据表明心脏缺陷,包括室间隔缺损(VSD),可能是由于胚胎BMPR2突变小鼠,小鼠多环芳烃没有报道是否因为与这种突变相关的寿命很短7]。此外,最近的一项研究表明,老鼠的monoallelic突变Bmpr2自发发展PAH 6个月后,他们的右心室心肌细胞表现出减少钙(Ca2 +)响应性与野生型小鼠相比8]。心输出量甚至减少非自发PAH老鼠,和进一步研究建议的右心室心肌细胞Bmpr2突变的老鼠缺乏适应野生型鼠的心肌细胞。这份报告之前,证据只有心脏缺陷的突变CHD-PAH来支持我们的假设BMPR2影响PAH患者的心肌细胞。
抑制剂的dna结合蛋白(IDs)是helix-loop-helix(通过)转录因子和已报告在cardiogenesis下游重要目标受体(9,10]。在我们之前的审查,我们推测BMPR2有助于心脏在开发过程中形成通过下游效应基因Id基于类似的表型Id敲除小鼠(KO)和BMPR2 mox-cre KO小鼠(11]。最近的一项研究表明,Id基因的关键心脏发展KO四种亚型的4倍id(1 - 4)在小鼠体内导致没有心脏的发展(12]。骨形态发生蛋白受体表达信号通过磷酸化Smad1/5诱导IDs表达在大多数细胞类型,和突变BMPR2和BMP I型受体报道在PAH / CHD-PAH可能影响id,从而影响心肌细胞基因转录。
在目前的研究中,我们旨在澄清对多环芳烃ID1和ID3是重要发展和负责突变的影响BMPR2在心肌细胞。我们发现,心肌细胞Id 1/3KO小鼠发达的多环芳烃。此外,单细胞(sc) RNA序列(seq)分析提供新的证据表明人类胚胎干细胞(为)缺乏ID1/3基因分化心肌细胞和少的BMPR2下游效应器ID1/3协调调节心脏通过USP9X发展。心肌细胞Id 1/3KO小鼠发达PAH,进一步加强BMPR2信号对心脏的影响的知识发展和PAH / CHD-PAH发病。这些患者的不良预后需要遗传筛查可疑的基因,包括BMPR2和其他信号通路组件。
方法
所有支持数据和方法都包含在这篇文章,在线补充材料;扩大材料和方法部分可以在网上补充材料。
建立特定的诱导多功能干细胞系
体细胞重编程是用来产生诱导多能干细胞(iPSC)行外周血单核细胞(PBMCs)从四个CHD-PAH患者和四个健康受试者使用仙台病毒重组协议,如前所述[13]。提供了更详细的描述补充材料和表S1。
建立ID1和ID3double-knockout细胞系
的ID1和ID3CRISPR / Cas9质粒生成根据以前的报告(14]。这两个质粒转染到H9细胞,克隆选择和嘌呤霉素。中提供了一个详细的描述补充材料。
道德的考虑
前书面知情同意是由所有参与者提供研究的开始。本研究机构审查委员会批准的基本医疗科学研究所,中国医学科学院,北京(014 - 2015),浙江大学(2021 - 020),中国。
统计分析
的t检验、单因子变异数分析和双向方差分析是用于统计分析,使用GraphPad Prism 6.0执行。所有数据都意味着±扫描电镜。
结果
BMPR2突变会损害CHD-PAH万能干细胞向心肌细胞的分化,减少了心肌细胞Ca2 +瞬变
检查的影响BMPR2在心肌细胞中突变CHD-PAH,我们生成的万能CHD-PAH患者骨形态发生蛋白受体(BMPR)突变(CHD-PAH狗则),没有BMPR突变(CHD-PAH w / o万能)和健康的捐赠者(控制)的细胞则通过重组PBMCs仙台病毒和突变特征根据CHD-PAH病人的临床表型,包括三个突变携带者有轻微由心房间隔缺损(asd)和一个突变载体与动脉导管未闭(PDA)缺陷(补充图S1a和S1和S9补充表)。所有的细胞系表现出人类多能干细胞的形态与平面和紧凑的细胞克隆和多能性标记基因表达(补充图印地)。
控制和CHD-PAH万能(有/没有BMPR2自发突变)被分化成心肌细胞,有节奏地收缩。免疫荧光染色显示减少的表达加工第二天和心脏发生的特定TBX5 NKX2.5 4(天图1一个)。NKX2.5和MESP1影响更明显的分化CHD-PAH狗细胞6天(图1一个和补充图S2a)。控制和CHD-PAH iPSC-differentiated细胞表达了cardiomyocyte-specific标记cTnTα-Actinin分化后16天(图1一个),但CHD-PAH cTnT的狗细胞几乎没有表达。实时PCR分析表明的表达Brachyury(T),TBX5在突变CHD-PAH显著降低细胞相比,控制和CHD-PAH w / o 2天。GATA4和cTnT在突变细胞表达明显减少每天6和8 (图1 b)。16天的区别,fluorescence-activated细胞排序分析表明,90.84±0.26%和91.80±1.36%的细胞分化的控制和CHD-PAH w / o则表示cTnT,同时显著减少细胞分化从CHD-PAH万能表达cTnT (67.32±2.91%, p < 0.001) (图1 c)。因此,万能CHD-PAH患者BMPR2变异分化成成熟的心肌细胞,不同于心肌细胞分化的控制和CHD-PAH w / o万能。
确定分化心肌细胞的功能特征,我们检查了自发的Ca2 +瞬态控制在三行成熟心肌细胞,三行CHD-PAH w / o心肌细胞和三行CHD-PAH狗心肌细胞通过共焦显微镜。控制和CHD-PAH心肌细胞保持节奏性基于门店Ca的检测2 +条目(图1 d- f和补充图开通)。值得注意的是,Ca2 +瞬时振幅、衰减τ和半衰减时间心肌细胞来源于CHD-PAH狗则是显著降低与来自控制和CHD-PAH w / o万能(图1 g、h和补充图S2c);然而,没有明显差异的一半上升时间或达到峰值的时间(补充图S2c),表明Ca2 +存储在CHD-PAH狗心肌细胞受损通过肌浆网功能障碍或Ca的流出2 +通过钠(Na+ca)2 +换热器。此外,控制的规律和CHD-PAH关于sarcomeric狗心肌细胞蛋白质时安排类似的信号通过快速傅里叶变换分析,没有区别的相关系数基于costainingα-Actinin和cTnT (补充图S2d, e)。这些结果表明,BMPR2突变影响了分化和Ca2 +处理CHD-PAH iPSC-cardiomyocytes。
ID1 CHD-PAH万能干细胞和ID3表达水平降低BMPR2突变,表现出协调的监管
BMP4心血管发育过程很重要,包括心脏形成和血管生成(15,16]。因此,我们刺激控制和CHD-PAH万能BMPR2信号反应的BMP4审视自己的磷酸化的基础上Smad1/5 ID1的表达和ID3, BMPR2信号的主要下游效应基因在人类和小鼠(17,18]。治疗后30 ng·毫升−1BMP4 2 h,免疫印迹显示CHD-PAH ID1水平低的傻瓜iPSC线比控制iPSC线(图2一个和补充图S3a)。也发现了类似的结果BMPR1b突变CHD-PAH线(补充图S3b)。CHD-PAH w / o则有完整pSmad1/5 ID1水平(补充图S3c)。这些结果显示减少BMPR2 / ID信号CHD-PAH万能BMPR突变。
此外,我们评估的影响monoallelic删除Bmpr2(Bmpr2+ / -)BMPRII蛋白表达和下游信号通路在大鼠右心室。正如所料,BMPRII降低了50%的蛋白表达的右心室组织6个月大Bmpr2突变鼠(Bmpr2+ / -)。我们观察到显著降低蛋白质含量pSmad1/5和Id1 / Id3的右心室Bmpr2+ / -大鼠和野生型小鼠相比,(图2 b和补充图S3d)。这个结果表明monoallelic删除Bmpr2也降低了Id1和Id3蛋白表达水平在活的有机体内。
然后我们研究之间的关系BMPR2信号通路和ID蛋白质为(h9细胞株),它有相同的分化潜能和变异生成特征作为万能,对基因功能分析。免疫印迹显示IDs的蛋白质含量(ID1, ID2, ID3和ID4)相似的两个传统的文化条件。具体来说,比ID4 ID1和ID3蛋白质更丰富,也没有检测到表达ID2观察(补充图S3e)。我们检测了基线ID1表达荧光素酶/ ID1-GFP记者线(补充图S3f)和发现ID1BMP9启动子活性显著增加,据报道,激活BMPR2(补充图S3g)。免疫印迹分析表明ID1诱导,而ID3表达式被BMP4治疗2 h(影响较小图2 c)。我们还展示了ID1/3感应的时间进程BMP4刺激36 h,并发现ID3达到最高水平的感应BMP4刺激后6 - 12 h;此后ID1 BMPR2的主要形式下游信号(图2 d)。
进一步调查ID1的监管和ID3骨形态发生蛋白受体,为其治疗与LDN193189 (LDN),已知的激活素受体激酶抑制剂(碱性)2。ID1的表达降低报道(19),而同时ID3的蛋白表达在缺乏BMP4的增加(图2 e)。我们建立了ID1, ID3-inducible超表达细胞系H9-ESC-3F-ID1 H9-ESC-3F-ID3,分别用慢病毒tet-on 3 g诱导表达系统(补充图S3h和我)。减少ID3表达式时观察到ID1超表达与强力霉素诱导(阿霉素)(图2 f)。相比之下,ID1蛋白质水平降低时观察到的ID3是过表达(图2 g)。综上所述,我们的研究结果表明,ID1 / ID3的表达减少CHD-PAH万能BMPR2突变,ID1和ID3表现出协调的监管。
id条件double-knockout老鼠容易受到多环芳烃和肺血管重塑
调查的角色Id基因在心脏的内在变化的多环芳烃,绕过限制胚胎的杀伤力Id1和Id3双基因敲除(10),我们穿过Id1敲除小鼠(KO) (Id1−/ -)与老鼠窝藏的液氧插入Id3等位基因(Id3f / w)和有针对性的Id3消融在pre-cardiac中胚层利用CRE重组酶,它最早是由心血管祖标记Mesp1 (Mesp1-cre老鼠),从而生成id条件double-knockout老鼠(Ids cDKO) (补充图S4a)。基因分型后,我们确认了蛋白表达降低Id1和Id3的老鼠心脏(E18.5)与PCR结果一致(补充图S4b)。然后,我们在2个月大的老鼠表现超声波扫描(成人)。右心室显著降低心输出量和三尖瓣环平面收缩Id1游览(TAPSE)检测−/ -Id3f / w;Mesp1-cre Id1+ / -Id3/ f;Mesp1-cre老鼠相比,控制老鼠(补充图自己)。没有明显差异的左心室射血分数(LVEF)、左心室部分缩短(LVFS)控制,Id1−/ -Id3f / w;Mesp1-cre Id1+ / -Id3/ f;Mesp1-cre老鼠(补充图S4d),这表明Ids cDKO老鼠可以发展多环芳烃。
接下来,心导管进行6个月大的老鼠的血流动力学指标比较两种类型的Ids cDKO老鼠和老鼠的控制。大部分小鼠(五12 Id1−/ -Id3f / w13 Id1; Mesp1-cre和7+ / -Id3/ f显著;Mesp1-cre老鼠)开发的右心室收缩压升高(RVSP)和肺血管阻力(PVR),称为自发PAH (SPAH),而其他Ids cDKO老鼠没有出现多环芳烃(non-SPAH) (图3一个和补充图S4e)。老鼠与SPAH显示更糟糕的右心室功能,更高的富尔顿TAPSE指数和低,心输出量、心脏指数的值控制老鼠(图3罪犯)。虽然在non-SPAH老鼠RVSP没有升高,减少心输出量和心脏指数的值表明,心脏功能也影响在这些老鼠(图3d)。值得注意的是,然而,不变LVEF和LVFS Ids cDKO老鼠表明左心脏功能不受影响(图3e)。
免疫组织化学的小鼠肺样本α-smooth肌肉肌动蛋白(SMA)和CD31染色显示增加muscularisation SPAH小鼠肺微血管的(直径100μM) (图3f和3 h)。弹性蛋白Van Gieson染色显示了显著增厚肺动脉壁SPAH老鼠,但不是在non-SPAH老鼠与控制老鼠相比,这表明肺血管重塑发生在SPAH老鼠(图3g和3我)。这些结果表明,Ids cDKO老鼠容易肺血管重塑。
心室缺陷和减少Ca2 +瞬变在心肌细胞损害心脏功能在Ids中cDKO老鼠
评估Ids cDKO老鼠的心脏缺陷,我们采用彩色多普勒超声心动图。我们观察到异常血液流动的心33.3%的Ids cDKO老鼠在2个月,包括三尖瓣返流(一个鼠标),房间隔缺损(两只老鼠)和肺动脉瓣缺陷小鼠(6)(图4与回流)。50%的老鼠多环芳烃在6个月。肺动脉瓣返流检测在Ids cDKO老鼠心脏舒张期,而不是控制老鼠(图4b)。此外,房间隔缺损显然是被超声波扫描顺序和切片心脏部分(图44 c和d)。中间的心肌细胞和外右心室心肌壁从Ids cDKO老鼠小于控制老鼠(图44 e和f)。这种差异并没有发现室间隔心肌细胞的。
检测心肌细胞的功能,我们从控制分离心肌细胞和Ids cDKO老鼠。显著降低Ca2 +瞬变和肌节长度缩短的右心室心肌细胞中发现了孤立的Ids cDKO老鼠而不是那些从左心室分离控制小鼠相比图4g和图4h)。此外,控制的规律和Ids cDKO心肌细胞类似关于sarcomeric蛋白质信号时安排通过快速傅里叶变换进行了分析,而且没有观察到的差异的相关系数确定基于costainingα-Actinin和cTnT (补充图S5a和b)。综上所述,这些研究结果表明Id1的丧失和Id3心脏右心室功能受损的蛋白表达。
心肌细胞分化受损ID1 / ID3double-knockout hESC行
澄清的效果BMPR2/IDCHD-PAH发展不足,我们生成的ID1和ID3double-knockout hESC行(IDs KO)游离CRISPR / Cas9质粒。我们设计了三个小指南(sg) rna的目标ID1和ID3(补充表S5向量),然后转染293 t细胞识别sgRNA最高的编辑效率(补充图S6a-c)。我们成功subcloned三ID1和ID3double-knockout (IDs KOs行),两个ID1−−/行,三个ID3−−/线和两个ID3−−/ID1−/ +行(图5一个,补充图S6d和e)。接下来,我们这些细胞分化成心肌细胞。使用差异化协议使用前,细胞呈阳性的人口cTnT和α-Actinin(成熟的心肌细胞的标志)是完全迷失在三行id KO (图5 b和图5 c)。免疫印迹显示加工的蛋白质含量减少的IDs KO线比野生型细胞系(图5 d)。中胚层的进一步描述标记显示的表达水平Brachyury,MIXL1和TBX5在第二天的分化显著降低。在第四天,的表达TBX5,GATA4和ISL1进一步降低(图5 e)。这一发现表明,ID double-knockout hESC行也受损心脏分化,类似BMPR2突变CHD-PAH万能。
scRNA-seq分析显示心脏的主要受灾民众中胚层祖细胞在IDs KO线
检查的影响ID淘汰赛上为其分化对心脏血统,野生型和IDs KO的单细胞转录组为其检查后对心肌细胞诱导分化。我们确定了ID1表达式在分化和观察峰mRNA表达野生型为4(天图6)。同时,我们观察到心脏的表达中胚层祖(CMP)标记,包括加工和MESP1(图6)。
然后我们准备单细胞样本scRNA-seq根据10×基因组学在第四天一般的样品制备方法。测序和数据处理后,我们获得了高质量的转录组数据从8690年单个细胞(4761野生型和3929 ID KO细胞)在严格的隔离和消除漂浮死在分化细胞分离。随后,无监督聚类分析显示6个集群的活细胞和微分表达式模式收集野生型和IDs KO (图6 b)。然后,我们结合原样品信息和表达水平的著名标志来确定细胞每个集群和分析他们的生物特征的身份通过执行基因本体论(度)的差异表达基因的分析。我们确定了六个主要细胞集群:C0是最大的细胞集群,主要包含神经祖细胞有高表达STMN2,SOX11和TUBB2B。C1集群细胞主要是定义和表达CITED2和置。C2是一群CMPs表示心脏中胚层标记MESP1,HAND1和FOXC1。C3集群是由细胞表达高水平的MKI67,CDK1和PLK1参与细胞分裂和增殖。一些C4集群细胞表达了多能性标记POU5F1与金属离子反应的基因MT2A和MT1E。C5是一群细胞从mesendoderm细胞cmp过渡态中高度表达SOX17,GATA3和ISL1(图6 c和6 d)。C2和C5主要由野生型细胞,而C0和C1 KO细胞主要是由id。总的来说,这些结果表明,ID1和ID3驱动中胚层分化向心脏血统的淘汰赛ID1和ID3有助于神经标记gene-expressing细胞的出现。
USP9X是ID1的下游效应基因和ID3 cmp的吗
接下来,我们使用R-Seurat分析细胞分化成心肌细胞来识别不同的第4天调节基因通过。聚类分析所示,大部分细胞CMP-related集群2和5是野生型细胞,很少IDs KO细胞包含在这些集群(图7)。我们进一步证明cardiogenesis-related标记(MESP1,HAND1,加工,GATA4和BMP4)和右心室特定标记(ISL1)是广泛表达于集群2或集群5,主要包括野生型细胞(图7)。令人惊讶的是,我们发现USP9X(ubiquitin-specific蛋白酶9 x)是最影响不同基因在野生型细胞在大多数集群(C0, C1, C2, C3和C5)与IDs KO细胞(图7 b)。USP9X的同系物果蝇脂肪方面,deubiquitinating酶。功能丧失的突变USP9X据报道在17岁女性独特的先天畸形,包括心脏缺陷(20.]。的表达USP9X在集群2(最高图7 c),和度分析表明,USP9X水平改变更广泛CMPs比其他集群ID1 / ID3击倒(图7 d)。因此,的表达水平USP9X和cardiogenesis-related基因减少相对于那些在野生型细胞。
期间通过E47 BMPR2不足/ ID信号会使USP9X CHD-PAH iPSC向心肌细胞分化
进一步调查是否ID1的蛋白质含量和ID3与USP9X表达式,我们检查的影响改变ID1/3表情USP9X分化细胞通过免疫印迹分析。ID KO细胞,USP9X表达式是心肌细胞分化的第4天低于野生型细胞(图8)。所有三个IDs KO线明显减少USP9X表达式的价格相比三个野生型线4天(图8 b)。我们下一个检查是否BMPR2突变CHD-PAH万能干细胞心肌细胞分化的影响通过USP9X。我们区分CHD-PAH万能BMPR2下游信号突变成跳动的心肌细胞和检查。4天,Smad1/5磷酸化以及ID1、ID3和USP9X表达相比,这些CHD-PAH细胞减少控制细胞(图8 c)。免疫荧光染色显示减少USP9X表达式的细胞质CHD-PAH傻瓜分化细胞(图8 d)。此外,我们过表达ID1确认相关,发现USP9X表达增加ID1蛋白表达的诱导后,观察和相应的减少ID3表达(图8 e)。在心肌细胞分化的水平加工和TBX5在IDs中显著降低KO细胞相对于野生型细胞(图5 e和图8 f)。过度的USP9X IDs KO细胞增强的表现加工和TBX5天2和4的心肌细胞分化而在IDs中KO +空细胞(图8 f)。因此,cardiogenesis-related标记表达式的减少所致ID1和ID3淘汰赛USP9X获救的过度。
研究监管IDs对下游基因表达的影响,我们检查了可能的合作伙伴ID绑定,如E47 E蛋白转录因子包含一个基本的dna结合地区并列通过域。没有dna结合区,ID蛋白质只有一个通过域的形成与E47从而形成竞争绑定与其他E蛋白抑制靶基因的转录。根据以前的报告,E47压制生龋齿的中胚层基因表达(12),我们进一步发现USP9X启动子区域包含E47结合位点序列(CACCTG)通过搜索JASPAR (http://jaspar.genereg.net)(图8 g)。一个染色质immunoprecipitation-PCR试验表明E47的绑定USP9X启动子是增加在IDs中KO细胞(图8 h和图8我)。此外,我们过表达E47和观察到的减少USP9X水平由定量PCR (图8 j),说明E47的抑制作用USP9X基因转录。我们的研究结果表明,突变体BMPR2信号通过ID1、导致E47的积累的USP9X子,这消极的调节USP9X心肌细胞分化过程中基因表达(图9)。
讨论
尽管肺负荷被认为是重要的PAH患者右心室功能,有一些遗传因素右心室衰竭。我们感兴趣的各个组件的影响BMPR2信号通路中胚层形成原肠胚形成过程中(12,21]。决定id为PAH患者右心衰BMPR2变异仍然是具有挑战性的。我们的研究结果表明,从CHD-PAH iPSC-cardiomyocytes患者骨形态发生蛋白受体突变,总ID蛋白质水平降低,心肌细胞分化效率和Ca2 +处理受到影响。我们发现减少Ca2 +瞬变,τ衰变,衰变一半时间,但一半上升时间和时间变异iPSC-cardiomyocytes峰并没有改变。此外,我们确认减少ID1 / ID3表达正确的样本Bmpr2+ / -老鼠。通过生成条件淘汰赛,我们绕过双KO Id1/3老鼠的胚胎杀伤力和发现一些id cDKO小鼠自发发达的多环芳烃。SPAH定义了平均肺动脉压力由H(肺动脉平均)≥25毫米汞柱autefortet al。(8]。他们的Bmpr2缺乏老鼠SPAH在年龄相关性的方式开发,发病率在16.7%和27.8%之间不等,完全模仿PAH患者的发病率BMPR2突变。此外,易感性SPAH与高水平的并发血管周的纤维胶原蛋白。在图3我们演示了肺血管重塑SPAH组,而在以改造肺动脉的速度差异不明显“非自发PAH”相比,控制老鼠被发现。我们发现一些Ids cDKO小鼠心室缺陷或肺返流。减少钙2 +瞬变和肌节长度缩短可能负责减少心输出量在Ids中cDKO老鼠,这是与受损心肌细胞功能一致Bmpr2+ / -老鼠。然而,许多因素尚未阐明,如下游组织的目标id。
ID1/3 heart-specific效应的进一步研究,我们采用scRNA-seq分析,它可以方便地分类混合细胞根据其基因表达和识别新的细胞类型或标记基因(22]。在我们的研究中,scRNA-seq结果清楚地表明,IDs KO的心肌细胞分化细胞受损,集群2和5,CMP相关基因表达的影响的主要人口在IDs中KO细胞。度分析表明,USP9X表达减少在大多数集群id KO细胞较野生型细胞集群。我们还展示了减少USP9X表达心肌细胞分化中CHD-PAH patient-derived万能。这些发现促进当前的理解特定的影响BMPR2突变的心。
值得一提的是,为hiPSCs共享相同的特点,包括他们的表达多能标记及其分化的潜能。如何BMPR突变影响心脏发育的早期阶段应该调查hESC分化时的每个行动通过受体心脏中胚层的形成。hESC培养基,基本6介质(E6)不包含纤维母细胞生长因子或factor-β转变增长,这些都包含在基本8介质(E8)。E6不维持多能性为其因为缺乏这两种生长因子,减少Smad1磷酸化水平。减少基底激活smad1,信号转导是评估主要在E8,我们发现ID1和ID3是协调调控下游BMPR2为(图2 gydF4y2Ba)。
本研究也有一些局限性。首先,id并不只受BMPR2。不同的突变BMPR2信号通路组件(导致PAH),如BMPR1B(CHD-PAH 4),也表达下调ID表达式(补充表S1,补充图S3gydF4y2Ba)。其他BMPR2突变信号组件也收敛IDs加强PAH (23)和血管内皮生长因子(VEGF)可以诱导ID表达式(24]。我们一直观察到减少5416年Sugen ID1表达式(VEGF抑制剂)/缺氧肺动脉高压大鼠(25]。尽管击出一个因素id重现在BMPR2心脏缺陷液氧/ -;Mox2-cre老鼠,可比BMPR2cardiomyocyte-specific基因敲除动物没有被研究过的多环芳烃。第二,Bmpr2+ / -杂合的老鼠有一些表型差异,如微分RVSPs,它主要是由老鼠菌株的差异可以解释自两组的目标BMPR2生成一个框架的转变外显子1 (26]。值得研究的是流产胚胎识别可能的心脏缺陷。
BMPR2突变发生在三个分流器类型(房间隔缺损、自闭症和PDA)在CHD-PAH患者相似的频率(4]。例如,CHD-PAH狗2 (AZ2)提供了一个理由确定的存在与否BMPR突变与CHD-PAH病人。病人有一个PDA缺陷与肺动脉平均79毫米汞柱,PVR 19.5木单位(> 5 WU),和肺系统流比为0.85(< 1.5),在手术关闭指示。他发明了比这更严重的多环芳烃由PDA缺陷引起的。另一位女ASD患者CHD-PAH狗3 (AZ3)发达国家严重的多环芳烃在年轻的时候比大多数病人(吴肺动脉平均31毫米汞柱,PVR 9.38)。她把c所示。1042 g >突变BMPR2外显子8,这促使预测基因检测在亲戚的影响。我们发现她的父亲和姐姐有相同的突变尽管没有症状为止(补充表S9)。
在BMPR2突变我们CHD-PAH患者中发现,几乎所有的错义突变(4]。五种BMPR2突变存在H / IPAH:胡说,删除、转移,拼接的站点和错义。表型和基因突变类型之间的关系值得进一步探索。CHD-PAH患者有更严重的临床表现通常比造成的缺陷应该进行基因测试来检测异常BMPR2及其下游组件。突变携带者比那些没有PAH复发的风险BMPR2突变,应该监视即使手术分流的闭包。从我们的研究是BMPR2建议包括USP9X和风险基因的信号组件面板屏幕CHD-PAH成比例的病人多环芳烃在关系(小)分流(小型室间隔缺损或)或持续进步的多环芳烃和多环芳烃的设置分流关闭后心血管从左到右分流。靶向治疗或移植可以考虑这些患者在疾病的早期阶段。
结论
通过使用数量的方法,包括iPSC生成和分化,scRNA测序CRISPR / CAS9-targeted为和Ids cDKO老鼠心肌细胞功能的分析,我们发现BMPR2信号通过id和USP9X心脏分化。ID1的丧失和ID3表达有助于CHD-PAH患者心肌细胞功能障碍BMPR2突变。
补充材料
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确认
我们感谢壮族田(北京协和医院、北京、中国)和卓施(浙江大学医学院儿童医院,杭州,中国)招募的病人。Bishen丁(四川大学,成都,中国)和杰Na(清华大学、北京)提供了有关转基因小鼠行。Kezhou秦(中国医学科学院基础医学研究所,北京)有助于分析部分scRNA-seq数据和检查Id1 / Id3的可拆卸的影响在某些基因293 t和他细胞(在本文中使用的数据没有)。音)太阳(中国医学科学院基础医学研究所)帮助与超声波扫描和魏阴(浙江大学医学院)共焦显微镜的帮助。Quanwei道(杭州领先Pharmatech、杭州)帮助与超声波扫描。燕李帮助为其文化。
脚注
作者的贡献:小君杨设计研究,修改和完成手稿;Mingxia Du进行了动物和人类干细胞实验和起草的手稿;海滨江进行了iPSC-related实验获得的数据;Hongxian刘执行单个细胞RNA测序数据分析;鑫赵孤立老鼠心肌细胞进行细胞Ca和Yu周2 +瞬态分析;方周进行实验和分析数据;纯美少女朴基因筛选CHD-PAH病人;提供关于徐提供USP9X质粒和冯马代的细胞则提供技术支持;Jianan王提供了仪器检测2 +瞬态分析;弗雷德里克Perros Bmpr2+ / -大鼠心脏样本。我们感谢尼克·莫雷尔所提供的建议和修改。香港顾做出了主要的贡献提供CHD-PAH病人样本和建议。
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
利益冲突:西北莫雷尔报告从Morphogen-IX赠款和个人费用,在提交工作;其他作者披露任何潜在的利益冲突。
支持声明:这项工作是由国家重点支持的研究和发展项目的China-Stem细胞和转化研究(批准号2016 yfa0102300杨小君);中国自然科学基金会(国家自然科学基金委)(格兰特数字81870051和81870051杨小君,格兰特数字81800315和81800315余周);和医学科学的凸轮创新基金(CIFMS)(批准号2016 - i2m杨4 - 003年6月)。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2021年2月2日。
- 接受2021年11月10日。
- 版权©2022年作者。
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