文摘
背景气道平滑肌细胞(ASM)是哮喘发病机制的基础,影响支气管收缩,气道高反应性和气道重塑。细胞外基质(ECM)可以影响组织改造途径;然而,迄今为止没有一项研究调查了ASM ECM刚度和交联对哮喘气道重构的发展。我们提出,转变增长factor-β(TGF-β)由ASM细胞激活是影响ECM在哮喘和寻求调查机制。
方法本研究结合在体外和在活的有机体内方法:人类ASM细胞在体外研究基底TGF-βECM交联酶的激活和表达。人类从哮喘和支气管活检nonasthmatic捐助者被用来确认赖氨酰化氧像在ASM 2 (LOXL2)表达式。哮喘慢性卵白蛋白(OVA)模型被用来研究LOXL2抑制对气道重塑的影响。
结果我们发现哮喘ASM细胞激活更多TGF-β基底比nonasthmatic控制和病变细胞衍生ECM TGF-β激活水平的影响。我们的数据表明,ECM交联酶LOXL2增加在支气管哮喘ASM细胞和活组织检查。至关重要的是,我们表明,LOXL2抑制减少ECM刚度和TGF-β激活在体外,可以减少牙龈胶原蛋白沉积和ASM厚度、气道重构的两个特性,在一个卵子的哮喘小鼠模型。
结论这些数据是第一个突出角色LOXL2哮喘气道重构的发展,有必要进一步研究表明LOXL2抑制潜在治疗减少严重哮喘的气道的改造。
文摘
小说角色矩阵交联酶在哮喘气道重塑LOXL2: #哮喘LOXL2增加,但LOXL2抑制减少刚度矩阵在气道平滑肌细胞,减少改造在活的有机体内https://bit.ly/3FnzGb3
介绍
哮喘气道重塑是一个常见的特性,包括上皮脱落,增加气道平滑肌(ASM)质量和牙龈纤维化。细胞外基质(ECM)正成为一个关键的调制器的炎症和重塑事件(1- - - - - -3]。蛋白质存在哮喘ECM内可以影响ASM的分泌细胞和促进他们的扩散4,5),和影响气道重构,高反应性和炎症6]。ECM的相对刚度也可以影响细胞的行为(7,8]。在肺,增加ECM刚度发起epithelial-mesenchymal过渡,使成纤维细胞合成胶原蛋白(9,10]。此外,增加刚度矩阵可以增加ASM细胞增殖和收缩力11,12]。综上所述,这些研究表明,增加ECM刚度可能导致气道重塑的发展。
ECM刚度由交联的影响,ECM蛋白质之间的共价键的形成,这是催化了ECM交联酶。赖氨酰化氧像2 (LOXL2)属于赖氨酰化氧酶家族,和负责交联并稳定胶原纤维。各纤维化疾病[LOXL2表达明显增加13- - - - - -17)和LOXL2抑制减少纤维化在多种疾病的动物模型17- - - - - -20.]。到目前为止,还没有研究调查LOXL2在哮喘发病机制或气道重构的作用。
这项研究调查了ECM的角色变化和LOXL2哮喘气道重构的发展。我们发现激活转换增长factor-β(TGF-β)ASM细胞受到ECM的影响,和ASM细胞与哮喘捐助者表现出增强的基底TGF-β激活和存款更严厉的ECM。我们表明,LOXL2表达式是增加哮喘,这LOXL2抑制减少ECM刚度和TGF-βASM细胞活化在体外,减少气道重构的在活的有机体内哮喘模型。
材料和方法
ASM的文化细胞丙烯酸甲酯明胶水凝胶
从前体明胶水凝胶盘是methacrylol (GelMA)解决方案包含2959 Irgacure 0.5%紫外线下交联(365海里)。解决方案5、10和15% w / v GelMA溶解获取水凝胶,是1×6×12×气管平滑肌的生理刚度报道之前(22]。水凝胶相对刚度(E)是由一个助教。HDplus texture analyser (Stable Micro Systems, Godalming, UK) (补充图S1)。ASM细胞被播种在2×104细胞·厘米−2和培养6天。
磷酸化Smad2免疫荧光
细胞被固定(4%多聚甲醛),permeabilised (triton - x - 100 0.3%),然后沾磷酸化Smad2 (p-Smad2)主要抗体(1:10 0)和一个Alexa萤石488抗体(1:3000)。核沾染了4′,6-diamidino-2-phenylindole。图像分析是使用蔡司LSM执行710年共焦显微镜(蔡司、从德国)和细胞分析器(23]。
周期性拉伸
完全汇合的ASM细胞胶原蛋白I-coated BioFlex板拉伸(15%,0.3赫兹)使用Flexcell fx - 6000 t张力系统(Flexcell、伯灵顿、数控、美国)。额外的盘子是孵化与Flexcell设备作为未拉伸控制。
西方墨点法
如前所述(执行p-Smad2免疫印迹24]。测量LOXL2和LOXL3表达,细胞溶解产物电泳,转移到PVDF膜,然后对使用抗体LOXL2 (1:1000) LOXL3(1:20 00)和GAPDH (1:3000)。乐队使用清晰的视觉发射极耦合逻辑(Bio-Rad、大力神、钙、美国)和微执行使用ImageJ (https://imagej.nih.gov)。
改变了貂肺上皮细胞试验
转换后的貂皮肺上皮细胞(TMLC)(一种礼物的丹尼尔·里夫金,格罗斯曼纽约大学医学院,纽约,纽约,美国)是一种广泛使用TGF-β记者细胞表达荧光素酶TGF-β为了活跃。如前所述(执行TMLC共培养试验24)利用ASM细胞播种在6.289×10 96 -孔板上4细胞·厘米−2。
p-Smad2 ELISA
p-Smad2在细胞溶解产物测定使用酶联免疫试剂盒(细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国)根据制造商的指示。由于缺乏标准的一代的标准曲线,提出了数据作为原始的光密度值。
胶原凝胶收缩试验
收缩是由细胞胶原凝胶收缩试验(美国细胞生物学实验室,圣地亚哥,CA)根据制造商的指示。短暂,ASM细胞被播种在0.5×106细胞每在24-well板块(按照制造商的推荐细胞密度)和凝胶直径是量化后24小时使用尼康SMZ1500立体显微镜(尼康、东京、日本)和j .正面和负面形象控制进行使用醋甲胆碱和2,分别3-butanedione单肟。
牵引力显微镜
ASM细胞被播种(62 890厘米−2)3 kPa聚二甲硅氧烷NuSil凝胶涂- 8100 - 96 -孔板与嵌入式荧光微球(25]。荧光珠位移是用来计算牵引力量使用牵引血细胞计数(傅里叶变换的方法26]。牵引力数据从日到24日获得独立井每细胞系。牵引的均方根值(Pa)。
ECM交叉实验
ASM细胞被播种在62 890厘米−2培养3天,然后消化0.016氢氧化铵为30分钟。Nonasthmatic细胞被播种在自己的ECM或ECM沉积哮喘ASM细胞在62 890厘米−2在无血清的媒体和反之亦然对哮喘ASM细胞。端点进行24 h后分析。
原子力显微镜
MFP-3D独立的原子力显微镜(英国牛津仪器,阿宾顿)被用来获得ECM的力-位移曲线为杨氏模量(E)计算。仪器灵敏度校准与卸力-位移曲线的斜率在玻璃,而仪器热波动被用来提取的有效弹性常数,固有谐振频率。对于每个样品测量,至少100 -位移曲线记录。
支气管活检集合
支气管活检从哮喘控制和健康的捐赠者获得每组(n = 6)被用来确定LOXL2 ASM包内表达。所有组织收集诺丁汉生物医学研究中心,诺丁汉大学(英国诺丁汉),通知下,书面同意与伦理批准(12 / EM / 0199)。提供更多的细节补充材料。
免疫组织化学
平行5µm部分肺组织在柠檬酸缓冲煮,然后用一个孵化LOXL2(1:1000)或α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA)(1:1000)抗体在一夜之间,后跟一个山羊anti-rabbit抗体(1:200)。部分是孵化与3、3′-diaminobenzidine和迈耶的苏木精复染色。ImageJ被用来覆盖积极LOXL2染色α-SMA地区量化反应百分比。
LOXL2抑制在一个在活的有机体内卵白蛋白模型
研究批准的诺丁汉大学动物福利伦理审查委员会和执行在内政部许可机关内的动物(科学程序)法案1986。敏化作用后的腹腔内注射卵白蛋白(OVA) /明矾,动物被随机的四个治疗组:PBS +车辆,PBS + PAT1251,卵子+车辆或卵子+ PAT1251。提供的全部细节的模型补充材料。
疣状
小鼠肺组织受到α-SMA免疫荧光和量化的小气道(< 100µm半径)染色进行如前所述[21]。
统计分析
数据报告为n的值观察和非参数测试是在所有情况下使用。所有统计测试统计学家(I.D.S.)进行了讨论。进一步的细节中补充材料。统计检验的详细信息包含在使用图的传说。
结果
基板刚度和周期性拉伸刺激人类ASM TGF-β细胞
我们曾表明,收缩受体激动剂增加integrin-mediated TGF-β激活人类ASM细胞(21]。因为基板刚度和周期性拉伸可以影响integrin-mediated TGF-β激活在上皮细胞(30.,31日),我们调查是否这些过程影响ASM TGF-β活化细胞。人类ASM细胞培养在GelMA水凝胶的刚度增加7天。水凝胶的硬度决定使用一个纹理分析器(补充图S1)。活跃TGF-β信号(核p-Smad2)是目前人类ASM细胞培养时的衬底等效刚度气管平滑肌的生理刚度(表示为1×)[22与基体刚度(增加)和水平增加图1一个和b)。此外,周期性的机械拉伸造成4 h后p-Smad2水平增加(图1 c和d)。综上所述,这些数据表明,基底由ASM TGF-β激活细胞可以受到基体刚度和周期性拉伸。
哮喘ASM细胞激活TGF-β水平上升
我们下一个试图探讨基底是否TGF-βASM细胞异常活化的哮喘。ASM细胞基底TGF-β激活增加隔绝哮喘捐助者与nonasthmatic细胞以TMLC共培养试验(图2一个)和通过p-Smad2 ELISA酶标法(图2 b)。来决定是否增加TGF-β哮喘ASM细胞激活是由于增加我们测量TGF-β基因的转录TGFB1,TGFB2和TGFB3信使rna水平。我们发现没有显著差异的三个基因与哮喘nonasthmatic ASM细胞(补充图S1b-d)。当我们和其他人显示细胞收缩的作用在调节TGF-β激活(21,30.,32),我们测量细胞的收缩性。收缩性哮喘ASM细胞增加而nonasthmatic控制当测量使用胶原凝胶收缩试验(图2 c)和收缩性弱的程度与TGF-β激活的细胞量(图2 d)。然而,细胞收缩类似哮喘和nonasthmatic ASM细胞之间衡量牵引力显微镜(TFM) (补充图S2a)。
进一步探索是否差异cytoskeleton-mediated TGF-β激活可以解释观察到的表型的增强TGF-β哮喘ASM细胞激活我们应用周期性机械拉伸。拉伸导致哮喘和增加p-Smad2 nonasthmatic ASM细胞(补充图开通和c)。我们发现无显著差异在p-Smad2水平拉伸哮喘ASM细胞与nonasthmatic ASM细胞(补充图开通和c)。我们得出结论,而收缩和细胞骨架的改变影响基底TGF-β激活,这些因素是不可能单独负责驾驶增强TGF-β激活细胞在哮喘ASM。
我们提出,ECM的改变可能是一个额外的因素驱动增加哮喘ASM TGF-β活化细胞。我们执行ECM交叉实验使用decellularised ECM准备调查ECM是否可以推动基底TGF-β激活的变化。培养nonasthmatic ASM细胞在哮喘细胞衍生ECM TGF-β激活而增加自己培养内生ECM(用蓝色虚线图2 e)。同样,培养哮喘ASM细胞nonasthmatic ECM导致TGF-β激活明显降低与自己培养内生ECM(用蓝色虚线图2 e)。的大小的影响相反的疾病状态ECM细胞在哮喘ASM大细胞与nonasthmatic细胞(p = 0.0159) (补充图S2c)。
ECM交联酶LOXL2是哮喘和调节ECM刚度增加
调查机制推动改变哮喘ECM我们评估ECM交联酶的表达。LOXL2和LOXL3mrna在哮喘ASM显著增加细胞与控制(图3一和b)。也有增加的趋势TGM2,液态氧和LOXL4表达,但没有区别LOXL1表达式(补充图S3a-d)。我们试图确认增加LOXL2和LOXL3在蛋白质水平(图3 c)。LOXL2哮喘ASM细胞蛋白表达增加与nonasthmatic细胞(图3 c和d)。尽管水平的提高LOXL3信使rna (图3 b),LOXL3蛋白表达降低哮喘ASM细胞(图3 c和补充图S3e)。
进一步调查LOXL2表达式是否增加哮喘气道的我们染色平行部分从nonasthmatic活检和哮喘捐助者α-SMA和LOXL2 (图4一)。我们量化平滑肌的百分比(α-SMA-positive)在活组织检查是阳性LOXL2 (图4 b)。我们的数据表明变化LOXL2积极性哮喘活检的平滑肌束内,包括高水平没有观察到nonasthmatic控件(图4 b)。LOXL2积极性也观察到non-α-SMA-positive内细胞群现在活检在哮喘和nonasthmatic活检(图4一)。
LOXL2抑制减少ECM刚度和allergen-induced气道重塑
调查的影响LOXL2 ECM的刚度由ASM细胞沉积我们对待ASM细胞LOXL2抑制剂(PAT1251;平均抑制浓度(IC50)0.71µM)。治疗1µM PAT1251减少ECM的刚度由哮喘ASM细胞沉积的等效刚度,沉积nonasthmatic控件(图5一个)。此外,1µM PAT1251导致基底TGF-β虽小但显著降低由哮喘细胞激活(图5 b)。
我们下一个调查在OVA-induced LOXL2气道重构的作用在活的有机体内。每日口服剂量30毫克公斤−1PAT1251 [18从一开始的卵子挑战保护小鼠免受卵子challenge-related减少体重(图6)。在开始体重没有显著差异治疗组(补充图S4a)。卵子的挑战导致增加支气管肺泡灌洗(炎症图6 b和c),包括嗜酸性粒细胞的百分比增加,淋巴细胞和中性粒细胞,相应减少巨噬细胞(补充图S4b-e)。PAT1251没有显著影响卵子challenge-induced气道炎症(图6 b和c)也没有影响微分细胞嗜酸性粒细胞计数,淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞(补充图S4b-e)。
卵子挑战引起牙龈胶原沉积增加与盐水control-challenged动物见马森的三色的染色(图7)。周围的胶原蛋白量航空在PAT1251-treated OVA-challenged动物减少而OVA-challenged车辆控制(图7)。这是受picrosirius红染色偏振光显微镜的肺组织,这表明治疗PAT1251减少总数量的胶原蛋白在航空公司和组织胶原纤维,如图所示的转变,颜色从红色和黄色的结合观察车辆control-treated动物只红色PAT1251-treated动物(补充图S4g)。此外,卵子挑战引起了周围的ASM层增厚小航空公司(< 100µm半径)(图7 b和c)。我们证明倍降低ASM厚度PAT1251-treated动物与控制(图7 c)。
讨论
纤维发生的过程和组织改造是由ECM刚度在多种组织和器官7]。严重哮喘气道重塑与牙龈纤维化和ASM层的增厚,这两个可能增加气道壁刚度(12]。我们研究了ECM如何影响在ASM TGF-β激活细胞,并确定了小说和重要作用矩阵交联酶LOXL2在哮喘气道重塑。
TGF-β是哮喘气道重构的关键驱动因素,我们曾表明,ASM细胞激活TGF-β收缩反应受体激动剂(21]。这里,我们第一次表明,基底TGF-βASM细胞活化的影响由ECM刚度和周期性拉伸,证实了先前的研究在其他细胞类型(30.,32]。由于这些研究证实的本质我们使用相对较少的三行ASM供体细胞为了保存价值的主要假说驱动的人力ASM细胞培养在本文的其余部分探索性实验。鉴于我们之前发现的多个其他研究小组21,30.,33),我们将假设的影响ECM刚度和周期性拉伸ASM细胞TGF-β激活是由细胞表面蛋白;然而,其他机制包括蛋白酶的作用[34)基于当前的研究不能打折。
我们发现哮喘ASM细胞比nonasthmatic收缩时测量使用胶原凝胶收缩试验和TGF-β激活与收缩性,证实了以前的研究(35]。然而,我们没有发现哮喘之间的收缩性差异和nonasthmatic细胞解冻时利用。这可能是由内在的差异来解释这两个化验。ASM细胞胶原凝胶的结果在一个三维的文化,而二维单层TFM执行。对我们的数据解释至关重要的是,弱相关性TGF-β激活和胶原凝胶收缩性结合TFM数据,这更像的二维性质TMLC培养化验,让我们得出这样的结论:细胞收缩性差异是不负责增加哮喘ASM TGF-β活化细胞。
长期以来人们一直认为在哮喘气道壁硬度;然而,很少有研究直接调查了刚度矩阵在哮喘。被动哮喘平滑肌外植体的刚度增加长度扰动后(36)和哮喘成纤维细胞杨氏弹性模量高于nonasthmatic控制(37]。我们所知,本研究是第一个直接测量ASM细胞衍生ECM的刚度和存款硬ECM表明哮喘ASM细胞。
ECM影响多种细胞通路,可以影响ASM细胞生物学(4,5,38- - - - - -40和影响支气管狭窄41,42]。这里给出的数据证明细胞之间的联系增加了ASM ECM刚度和哮喘气道重塑通过TGF-β激活。从力学上看虽然是一个缺乏数据连接增加ECM刚度和气道重塑,矩阵加劲激活肺动脉平滑肌触发血管重塑(43,44]。
ECM刚度是通过基质蛋白质的交联驱动的。之前就有报道称,ASM细胞可以改造细胞外胶原纤维(45]。LOXL2是交联酶研究制药靶点在纤维化疾病(46]。我们的数据证实了早先的研究表明增加LOXL2基因表达在哮喘47),但也证明LOXL2蛋白质增加哮喘ASM。LOXL2增加一些疾病相关的组织改造(13- - - - - -17,46),但增加的功能后果LOXL2在哮喘从未被研究过。我们的数据表明异质性LOXL2捐助者之间的表达,这可能是疾病严重程度的反射;然而,目前的研究没有足够的动力检测LOXL2表达式和哮喘严重程度之间的关联。哮喘的机制推动增强LOXL2表达可能是复杂和多因子的,和可能包括转录调节、小分子核糖核酸,可变剪接和/或表观遗传调控。开发一个更大的理解这些潜在机制显然是未来研究的一个重要领域;然而,这已经超出了本文的范围。
我们承认LOXL2变化表达式不一定会导致酶活性的变化;然而,目前还没有商业化分析方法来衡量LOXL2活动。因此,我们试图探讨功能抑制LOXL2活动的影响在体外和在活的有机体内。我们的研究表明,LOXL2 ASM细胞ECM的刚度,增加驾驶TGF-β激活和改造。具体来说,LOXL2抑制在活的有机体内减少allergen-induced气道重构以胶原蛋白沉积在航空公司和ASM层增厚。这是第一个报告连接LOXL2和气道重塑,但以往的研究链接LOXL2血管重塑通过对平滑肌的影响(48]。重要的是要注意,虽然前景的纤维化动物模型显示LOXL2抑制(17- - - - - -20.,49),这还没有翻译病人的临床效益(50]。其原因尚不清楚,有值得进一步考虑LOXL2抑制治疗哮喘气道重塑。
我们专注于量化ASM层厚度在规模较小的航空公司< 100µm半径符合我们的以前的工作21]。虽然气道重构的变化可能会影响各种规模的航空公司,我们和其他人发现最大的改造变化发生在小型航空公司相比,大型航空公司(21,51,52]。此外,hyperpolarised肺的气体磁共振成像表明气体通风和显著的区域性异质性分布,暗示微分效应在规模较小的航空公司53]。
除了测量ASM层厚度我们使用两个组织学染色证明LOXL2抑制在活的有机体内减少沉积胶原的航空公司。利用偏振光显微镜想象picrosirius红点的肺组织证明减少胶原的航空公司OVA-challenged动物对待LOXL2抑制剂相比,车辆control-treated动物。至关重要的是,观察到的颜色之间的胶原纤维是改变两组动物的红色,橙色和黄色出现在车辆control-treated动物与动物主要是红色纤维相比LOXL2抑制剂治疗。这是暗示的胶原纤维组织的变化和方向(54),符合改变胶原成熟。
除了改变矩阵交联,LOXL2最近被证明有转录和表观遗传监管职能(55]。转录和表观遗传调控的变化一直与哮喘发病机理(56,57]。这就提出了一个可能性,哮喘LOXL2表达增加可能会影响大量独立的途径与哮喘发病机制相关的矩阵交联酶活性。这些通路可能包括免疫和炎症通路除了这里显示的数据展示角色LOXL2在哮喘气道重构的事件。这在未来的研究需要进一步调查。
这里给出的数据突出显示一个潜在的重要作用为LOXL2哮喘气道重构的发展。我们表明,增加ECM可以开车在ASM TGF-β激活细胞,证明LOXL2导致ECM刚度。我们首次展示,LOXL2表达式是增加哮喘和我们已经表明,LOXL2抑制在活的有机体内可以减少气道重塑。综上所述,我们的研究表明,抑制LOXL2可能值得作为一个方法来减少严重哮喘气道重塑。
补充材料
补充材料
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补充图S1。一)GelMa基质(5、10和15% GelMa wt /卷)受到压缩模量使用纹理分析器来确定相对刚度。5% GelMa大约相当于气管平滑肌的刚度描述[22]所以被表示为1 x刚度。b)TGFB1信使rna由存在决定。数据表示为中隆变化与意味着non-asthmatic集团。非参数曼惠特尼测试使用。c)TGFB2信使rna由存在决定。数据表示为中隆变化与意味着non-asthmatic集团。非参数曼惠特尼测试使用。d)TGFB3信使rna由存在决定。数据表示为中隆变化与意味着non-asthmatic集团。非参数曼惠特尼测试使用。erj - 04361 - 2020. - figure_s1
补充图S2。一)基底牵引力决心使用牵引力显微镜。数据表示为平均均方根牵引(n)在所有捐赠者细胞系进行测试。非参数曼惠特尼测试使用。b) ASM细胞受到拉伸(15%,0.3赫兹(S))或左未拉伸(U) 4 h, PSmad2总Smad2/3和GAPDH被西方墨点法测量。图所示是代表n = 6 non-asthmatic和n = 6哮喘捐赠细胞系。Densitometrical的墨迹图进行分析和数据表示为比PSmad2: tSmad2/3。Kruskall沃利斯非参数测试和邓恩的多重比较测试使用。从图2 e c)数据表达在一个格式,允许比较基底TGF-β活动的影响ECM non-asthmatic和哮喘ASM细胞。曼惠特尼是用来测试区别ECM效果三角洲non-asthmatic和哮喘之间的细胞(p = 0.0159)。erj - 04361 - 2020. - figure_s2
补充图S3。一)TGM2信使rna在ASM细胞由存在决定。数据表示为中隆变化与从non-asthmatic均值数据组。非参数曼惠特尼测试使用,b)液态氧信使rna在ASM细胞由存在决定。数据表示为中隆变化与从non-asthmatic均值数据组。非参数曼惠特尼测试使用。c)LOXL1信使rna在ASM细胞由存在决定。数据表示为中隆变化与从non-asthmatic均值数据组。非参数曼惠特尼测试使用。d)LOXL4信使rna在ASM细胞由存在决定。数据表示为中隆变化与从non-asthmatic均值数据组。非参数曼惠特尼测试使用。e) Densitometrical LOXL3分析西方的屁股(图3 c)。数据表示为中位数比LOXL3: GAPDH。非参数曼惠特尼测试使用。erj - 04361 - 2020. - figure_s3
补充图S4。一)开始从老鼠的体重数据在活的有机体内哮喘模型。使用非参数Kruskall-Wallis邓恩的多重比较检验。b)中位数百分比的嗜酸性粒细胞炎性细胞群内BALF(图6 b)是由微分细胞计数。使用非参数Kruskall-Wallis邓恩的多重比较检验。c)的平均百分比的炎性细胞群内中性粒细胞BALF(图6 b)是由微分细胞计数。使用非参数Kruskall-Wallis邓恩的多重比较检验。d)淋巴细胞的平均百分比BALF的炎性细胞群内(图6 b)是由微分细胞计数。使用非参数Kruskall-Wallis邓恩的多重比较检验。e)的平均百分比巨噬细胞炎性细胞群内BALF(图6 b)是由微分细胞计数。使用非参数Kruskall-Wallis邓恩的多重比较检验。 f) Representative negative control image for α-SMA immunofluorescence staining in figure 7b. g) Representative images of picro-Sirius red stained mouse lung tissue from the ovalbumin model. Tissue from animals treated with vehicle control was imaged using polarised light microscopy (i) and under brightfield light (ii). Similarly, tissue from animals treated with the LOXL2 inhibitor (PAT1251) was imaged using polarised light microscopy (i) and under brightfield light (ii).erj - 04361 - 2020. - figure_s4
补充表S1。在手稿表详细材料,包括供应商和克隆抗体使用的细节。erj - 04361 - 2020. - table_s1
补充表S2。表描述引物序列中存在。所有使用Primer3在线引物设计软件。erj - 04361 - 2020. - table_s2
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确认
我们想感谢所有患者和捐助者同意提供样品用于这项研究,和所有的临床和研究支持人员在莱斯特和诺丁汉NIHR生物医学研究中心收集和处理样品。我们还要感谢丹尼尔·里夫金(格罗斯曼纽约大学医学院,纽约,纽约,美国)TMLCs的礼物。最后,我们承认生命科学学院的支持和专业技术成像(SLIM)设施诺丁汉大学(英国诺丁汉)。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
利益冲突:j。拉米斯有一个专利“工业合成改性Crosslinkable生物聚合物“悬而未决。
利益冲突:r . Middlewick没有披露。
利益冲突:f .搜集没有披露。
利益冲突:j.t凯恩斯没有披露。
利益冲突:身份证斯图尔特没有披露。
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利益冲突:l .黄油没有披露。
利益冲突:f .玫瑰没有披露。
利益冲突:g·詹金斯报告个人费用和其他(科研协议支付给机构)从生原体,葛兰素史克和落实个人费用从加拉帕戈斯群岛,Heptares,勃林格殷格翰的发言,顺从,罗氏/ InterMune PharmAkea,百时美施贵宝公司,基耶西和罗氏/ Promedior,其他(从Galecto科研协议支付给机构),其他(从RedX协作奖)和北欧生物科学,其他从NuMedii(顾问委员会成员),在提交工作;支持由国家卫生研究所的教授(rp - 2017 - 08 - st2 - 014);是肺纤维化的受托人采取行动。
利益冲突:S.R.约翰逊报告从医学研究理事会(MRC)资助,在进行研究;从国家卫生研究所的资助,MRC和辉瑞公司,阿斯利康的个人费用,在提交工作。
利益冲突:A.L.爱说三道四的人报告个人收费咨询的疗法,在提交工作。
支持声明:这项工作是由英国医学研究基金会/哮喘个人奖学金和一个NC3Rs大卫Sainsbury奖学金,都由A.L.爱说三道四的人(mrfauk - 2015 - 312和NC / K500501/1)。j。拉米斯收到资金从英国的牛顿Agham计划委员会(英国)和科技部门(菲律宾)。人类活组织检查收集用于LOXL2免疫组织化学是由一个医学研究基金会(G1100163)由共和国约翰逊。人类ASM细胞隔离由国家卫生研究所的生物医学研究中心在诺丁汉和莱斯特。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2020年11月30日。
- 接受2021年11月8日。
- 版权©2022年作者。
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