摘要
CF气道炎症环境对CFTR调节剂的疗效有重要影响,这表明在模拟CF气道炎症的条件下进行临床前评估对优化治疗至关重要。http://ow.ly/VrD130m770X
到编辑:
囊性纤维化是一种常染色体隐性遗传的缩短寿命的遗传性疾病。大多数囊性纤维化的发病率和死亡率与肺部疾病有关。囊性纤维化跨膜传导调节基因(CFTR)编码了气道上皮表面适当水化所需的氯离子通道,该基因在囊性纤维化中发生突变,导致气道脱水。因此,囊性纤维化患者患有慢性气道感染、炎症和粘液分泌过多,从而导致气道阻塞。在过去的十年中,基础和临床研究导致了靶向治疗策略,成功恢复囊性纤维化患者的CFTR功能。
囊性纤维化中最常见的突变蛋白F508del CFTR被保留在内质网中,这阻止了大量的蛋白质到达上皮细胞的顶面。由于F508del CFTR的有效纠正应使大多数囊性纤维化患者受益,因此它在囊性纤维化治疗中具有较高的优先级。2015年,美国食品和药物管理局批准了Orkambi,包括校正器lumacaftor (VX-809)和增强器ivacaftor (VX-770),用于F508del纯合子患者。Orkambi对这些囊性纤维化患者的2期和3期临床试验表明,肺功能只有轻微的改善[1那2]与下游病理生理学的常规治疗相似,如。多纳酶、高渗盐水或阿奇霉素[3.].由校正剂tezacaftor (VX-661)与VX-770联合组成的新药Symdeko获得了类似的结果[4.].因此,有一个未满足的需求,以改善在活的有机体内cftr靶向治疗F508del纯合子患者的有效性。
CFTR校正器尚未被调查在体外在囊性纤维化通气中发现的炎症病症下在活的有机体内.因为人支气管上皮(HBE)的炎症通过上调内质网伴侣蛋白,折叠酶和脂质的表达来增加内质网蛋白折叠能力[5.-7.],我们假设HBE炎症会增强VX-809的纠正作用,从而增强VX-809和VX-770的治疗效益在体外.
为了评估VX-809和VX-770在重新携带囊性纤维化通气通气的炎症状态下的动作,我们利用了一个由长期(30-40天旧的)培养,分化的F508del /的前期临床模型Hbe在空气液体界面种植[6.]并从切除的人囊泡纤维化肺气道收获的粘液孔(SMM)上暴露于上清液[5.-8.].SMM包含囊性纤维化气道中存在的可溶性感染性和炎性因子在活的有机体内[8.],如细菌产物、中性粒细胞因子、巨噬细胞和上皮细胞因子、粘蛋白和数百种肽。它的细胞因子组成在病人之间是可复制的[8.].因为囊性纤维化患者的气道上皮暴露于SMM中所有因素的组合,而不是单一的炎症因素,我们推断SMM的使用(与使用确定的刺激)将更适合评估囊性纤维化气道炎症环境对CFTR调节剂疗效的影响。在这项研究中,SMM从8个个体人类囊性纤维化肺中提取。
我们利用了一种协议,该方案将24小时与VX-809处理和VX-770进行急性处理,以提供最大增强CFTR功能的条件。该议定书目前最常用于由工业和学术界研究小组进行的HBE细胞的研究。将良好的F508del / f508del Hbe培养物暴露24小时,以对顶部添加的pbs或smm [5.-8.]与基石外侧接触到车辆或5μm,VX-809的组合。值得注意的是,长期囊性纤维化培养物在没有SMM的情况下没有表现出高炎性表型[6.].随后,基于A)官能离子传输研究进行CFTR的分析,利用允许的腔室协议进行允许内源性F508del活性的敏感测量,这包括急性添加Forskolin,VX-770和CFTR抑制剂(CFTR异烟肼-172), b)通过Western blot对蛋白质成熟的生化评价[9.-11.], c)利用我们建立的方法,通过定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)评估CFTR mRNA水平[8.].
图1A说明vx -809处理的F508del/F508del HBE培养物对forskolin和VX-770表现出更大的cftr介导的反应与vehicle-treated文化。令人惊讶的是,SMM治疗显著提高了这些反应(图1A).vx - 809增加forskolin + vx - 770诱导Cl-SMM暴露以剂量依赖的方式增强分泌反应(数据未显示)。值得注意的是,smm增强的vx -809增加的forskolin+VX-770反应被CFTR减弱异烟肼-172(图1A).用于量化Forskolin + VX-770诱导的F508del介导的CFTR的响应和抑制的编译数据异烟肼-172显示在图1B..
为了探讨SMM和/或VX-809治疗是否影响CFTR介导的其他生物电反应,我们评估了所有组的基线电流、阿米洛利反应、残留/阿米洛利不敏感电流和UTP反应。从这些分析中得到的汇编数据在图1C..虽然基线短路电流(ISC.)在任何组中没有显着差异,在SMM处理的培养物中存在底部电流的趋势。此外,在VX-809处理基团中减少的amiloride反应存在趋势,可能是由于CFTR功能的恢复以及随后的上皮钠通道的活性抑制enac。在SMM处理的基团中略微增强残留电流,这可能是由于CFTR(在FORSKOLIN激活之前)的基线功能增加和/或额外的渠道的激活,如。,加利福尼亚州2+-Activated Cl.-频道(CACC)。事实上,如前所述[8.], UTP反应在smm处理的培养中增强,可能反映了CaCC功能的上调。此外,我们不能排除可能受到SMM影响的其他渠道的直接或间接贡献。然而,由于获救的CFTR反应是SMM影响的主要电流,而CFTR在很大程度上是受抑制的异烟肼-172,我们的数据表明SMM对修复的F508del的作用具有高选择性和特异性与其他渠道。
与功能数据一致,Western blot分析显示,在没有VX-809 (图1D).值得注意的是,虽然B带在SMM或VX-809处理的培养液中没有显著增加,但在同时处理SMM和VX-809的培养液中显著增加(图1D和e,smm / vx-809)。另一方面,在仅用VX-809(PBS / VX-809)处理的F508DEL培养物中形成成熟带C,SMM处理进一步增加了VX-809救出的成熟带C的量(图1D多发性骨髓瘤和f / vx - 809).利用相同的实验条件,我们发现SMM暴露在VX-809的存在或不存在下没有显着增加CFTR的mRNA水平(图1g.).从中发现图1D, e和g表明SMM对F508del的转录和翻译没有显著的促进作用。相反,我们的数据表明,在VX-809存在的情况下,smm增强CFTR水平的机制可能是通过smm诱导的F508del稳定来介导的,从而降低CFTR蛋白降解。事实上,我们实验室的初步数据表明,通过慢性VX-770治疗,SMM克服了vx -809拯救的F508del的不稳定在体外(数据未显示)。
与我们的研究结果相反,以前的研究表明假单胞菌铜绿假单胞菌减少VX-809-和VX-809+ vx -770刺激的F508del cftr介导的Cl-分泌[12.].但是,有可能对这种差异的解释。首先,因为这些研究被进行了6 H假单胞菌铜绿假单胞菌曝光,我们推测细菌暴露的时间可能没有足以扩大内质网隔室并随着我们报告的,增加其蛋白质折叠能力[5.],增强VX-809介导的F508del救援。第二,因为假单胞菌铜绿假单胞菌与SMM不同的是,它不可能触发HBE中有效促进内质网扩张所需的许多信号通路的激活在体外.
我们的调查结果为CFTR调制器的临床前评估提供了一种新的模型。关于炎症对人类受试者中CFTR调节剂的疗效的影响很少的数据。然而,因为在囊性纤维化肺病中发生的增加的炎症发生,所以即使在轻度疾病中也存在的气道炎症可能足以引发本研究中所述的效果。在未来的研究中应解决CF气道炎症和CFTR调节剂的疗效之间的剂量 - 反应关系。CF患者气道炎症状态的比较在活的有机体内Orkambi或Symdeko的疗效,对这些暴露于自身气道分泌物的患者细胞的研究将解决这一关系。
从我们的研究中获得的知识也可能适用于拯救稀有的CFTR突变[13.],为所有CF患者提供临床前模型和精确的治疗策略。此外,拟议的研究可能与其他气道疾病有关,IE。,COPD,功能障碍CFTR作为治疗目标的兴起[14.].有必要进行额外的研究来确定炎症期间VX-809介导的F508del救援的提高的机制,这可能在临床试验中缺乏VX-809的缺乏效益。我们推测初步增强VX-809介导的CFTR活性恢复在炎症条件下,随着时间的推移,通过其纠正效应(如。CFTR功能的校正可能会降低气道上皮炎症反应,从而降低VX-809校正)。事实上,最近的数据表明恢复功能性CFTR减少囊性纤维化呼吸道中的炎症[15.]同意这个概念。值得注意的是,下一代校正器可能对降低囊性纤维化患者的气道炎性反应产生更大的影响。
总之,我们的研究表明,囊性纤维化气道传染性/炎性Milieu对CFTR调节剂的疗效产生了重大影响。随着更多CFTR调制器组合可用(参见www.cff.org/Trials/Pipeline),临床前评估调节剂在模拟天然炎症囊性纤维化气道上皮的条件下的疗效,可能是优化囊性纤维化治疗的关键。
致谢
作者感谢Scott H. Randell和北卡罗来纳大学囊性纤维化中心组织采购和细胞培养核心,用于从人CF Airways提供HBE细胞和粘液型材料(由囊性纤维化基础授予R026-CR11和NIH Grant P30DK065988),以及Charles R. Esther,JR,批评讨论。
脚注
利益冲突:M.根茨希没有什么可透露的。
利益冲突:D. Cholon没有什么可透露的。
利益冲突:N. Quinney没有什么可披露的。
利益冲突:S.博伊尔斯没有什么可透露的。
利益冲突:M. Martino没有什么可披露的。
利益冲突:C.里贝罗没有什么可透露的。
支持陈述:本研究得到囊性纤维化基础(R026-CR11,Bouche15R0,Ribeir17P0),囊性纤维化研究,Inc。(2018NH-001)和国家卫生研究院(P30DK065988和R56HL136733)。本文的资金信息已存入Crossref资助者注册表.
- 收到了2018年6月15日。
- 公认2018年9月22日。
- 版权©2018人队