摘要
抗胆碱能治疗慢性肺部疾病如慢性阻塞性肺病(COPD)的有益效果已得到充分证实,尽管胆碱能刺激可能抑制液体吸收,增加纤毛搏动频率,增加气道表面液体运输。
我们使用猪气管支气管外植体,在与临床使用的溴化异丙托品(阿托品)和乙酰胆碱刺激孵育前和孵育后对基础黏液运输进行了定量。
如预期的那样,乙酰胆碱和卡巴胆碱增加了表面液体的输送。相反,通常由纤毛运输的粘膜下腺体分泌的黏液束被乙酰胆碱阻止移动,溴化异丙托品则抑制了这一作用。有趣的是,在缺乏功能性囊性纤维化(CF)跨膜电导调节(CFTR)通道的猪中,黏液束几乎不能移动。与野生型猪一样,刺激后CF表面液体运输增加。滞留的CF黏液束被滞留在气管表面,附着在杯状细胞表面。铜绿假单胞菌在野生型猪中,细菌被黏液束所移动,而在CF猪中则没有。
乙酰胆碱从而脱开从表面粘液束的输送气道表面液体运输为束动态乙酰胆碱和CFTR通道抑制,说明CF和COPD的起始,并打开新的治疗窗口。
摘要
乙酰胆碱从粘液束的运输脱开气道表面液体的运输和缺乏CFTR抑制束移动的http://ow.ly/Izbm30kb2F4
介绍
气道粘液阻塞常见于许多慢性肺部疾病,如哮喘、慢性阻塞性肺病(COPD)以及囊性纤维化(CF),这在很大程度上导致了气流受限[1]。这是由于迷走神经张力增加和乙酰胆碱(ACh)水平升高引起的气道平滑肌张力增加。此外,ACh还可引起粘膜下腺体分泌,增加纤毛搏动频率,抑制空气表面液体吸收[2,3.]。治疗与毒蕈碱拮抗剂气道疾病阻断副交感神经信号是一个古老的传统,但它不是直到引入不可吸收的阿托品衍生物如异丙托铵,这成了公认的疗法,尤其是慢性阻塞性肺病的。然而,抗胆碱能治疗的有益作用,除了肌肉松弛作用,是矛盾的部分地面对什么可以被认为是生理上是有利的。
通过纤毛清除系统,呼吸道基本上不受吸入颗粒物和细菌的影响。不断跳动的纤毛产生一个自动扶梯,将黏液头侧输送到喉部。然而,由于常用的小型实验动物和高等动物的粘液系统的组织结构不同,人们对此产生了一些困惑。老鼠基本上没有粘膜下腺体,而人类和猪却有许多腺体[2]。粘膜下腺体产生形成线性聚合物的MUC5B粘蛋白[4]。在粘膜下腺体中,最外围的细胞产生一种富含氯和碳酸氢盐的液体,这种液体经过分泌粘液的细胞,并通过这种液体展开和拉出MUC5B聚合物[5,6]。在管道通过这些聚合物形成厚粘液包(25 - 30μm)超过1000聚合物组成。的包出现腺开口,然后移动或在7 - 10μm深气道表面液体(ASL)的平均速度0.3μm·分钟−1(2,6]。美国手语的移动速度(3 - 5μm·分钟−1),我们认为差异是由于黏液束被锚定在杯状细胞表面[6]。现在,我们已经研究了从正常的新生仔猪和仔猪缺乏CF跨膜电导调节器(CFTR)通道,在CF直播气管组织粘液束传输,并能证明乙酰胆碱块粘液束运动,因此,我们给予额外的解释异丙托溴铵的有益效果(爱全乐),其中在CF粘液束基本上是不动的。
材料与方法
小猪和气道准备
所有的动物程序都是根据德国动物福利法进行的,并得到了当地管理机构的许可。CF型和野生型(WT) littermate仔猪的育种工作如前所述[7]。如前所述,在出生后24小时内诱导分娩,并解剖气道并运输[6]。对于其他方法,请参阅补充材料。
统计分析
所有统计检验使用Prism版本7.02进行(的GraphPad,拉霍亚,CA,USA),所有数据表示为平均值与平均值的标准误差。每次间隔拍摄被认为是一个重复。差异用双尾曼 - 惠特尼U检验来比较两个组和Kruskal-Wallis检验,随后Dunn多重比较检验用于多重比较适当评估;P <0.05被定义为显著。没有统计方法被用来预先确定的样本量,并没有采用随机化。没有动物被排除在分析和CF因为仔猪气管的形态是不同的,实验无法进行盲观察者。
结果
溴化异丙托品对胆碱能的抑制促进了粘液束的运输
粘液束从粘膜下层的腺体,通过扫描在表面上,以收集碎屑和细菌[清洁气道6]。阿利新蓝染黏液束的运动可在温度可控的体外培养仔猪气道中进行研究[6]。的爱茜蓝染色的粘液束的不均匀运动最好通过电影所示(补充电影S1)。胆碱能信号在慢性阻塞性肺病等肺部疾病中已被证实增加[8],哮喘[9]及CF [10]。为了模拟这种情况,我们在培养箱中加入了代谢更稳定的乙酰胆碱类似物(Cch),并研究了WT仔猪气管中粘液束的运输。令人惊讶的是,黏液束的运输基本上被Cch (图1一个)。为了排除脱靶效应,我们接下来测试的内源性胆碱发射机上爱茜蓝染色的粘液束的传输,发现施加乙酰胆碱作为Cch中相同的效果。乙酰胆碱 - 停止粘液由非选择性毒蕈碱受体拮抗剂溴化异丙托品再次动员。Interestingly, the ipratropium bromide effect lasted only 45 min as the transport returned to ACh levels 45 min after ipratropium removal (图1 b)。异丙托溴铵在乙酰胆碱刺激前后均未抑制阿利新蓝染色束的形成(图1 c分别和d)。
纤毛运输,通常被称为粘液传输,传统上由粒子的移动粘膜表面上可视化[11]。与他人相似[12,我们使用添加到小猪气道制剂中的40nm羧化荧光珠。如前所述[6],阿尔新蓝和珠子在WT仔猪气管染色不同材料(补充图S1和补充电影S2)。
阿利新蓝束从粘膜下腺开口(图2一个,绿色箭头),并收集在点上的上皮表面,有时在直线图形的羧化珠(图2一个)。阿利新蓝束和珠子不会染出相同的形状(补充图S2)。为了进一步解决这些差异,对珠子和管束的速度进行了比较,发现珠子的移动速度比阿利新蓝染的管束(图2 b)。Furthermore, adding Cch caused the beads to move even faster, whereas the Alcian blue-stained mucus bundles further slowed down within 5 min of Cch application (图2 b)。如之前对于这个被称为粘液和对应于ASL黏液纤毛清除所观察到的荧光珠这样回应Cch中刺激通过增加运输。为了避免混淆,我们建议您使用“ASL”由纤毛直接输送液体。珠聚集绳股是在ASL和它们的速度给定为,所述ASL的。
MUC5AC和MUC5B黏液免疫染色显示,腺体内主要黏液为MUC5B,而杯状细胞表面主要含有MUC5AC (图2 c)。以前曾用扫描电子显微镜(SEM)在WT仔猪气道中识别出粘膜下腺体的黏液束[6]和,作为人类也有无数的粘膜下腺体,我们发现人的呼吸道表面上相同类型的粘液束(图2 d)。
粘液束是不动的在CF气管
CF是由非功能性CFTR的疾病,其特征是减少粘膜纤毛清除和粘液积聚。当爱茜的输送速度蓝染色的粘液束新生WT和CF仔猪气管进行比较,在CF气道中观察到粘液转运戏剧性损害(图3一)。Alcian blue染色CF气管延时录像显示运输非常缓慢(补充电影S3)。为了研究异丙托溴铵是否能消除CF中速度的下降,与WT中观察到的情况相似,我们测量了异丙托溴铵处理后阿利新蓝染束速度。异丙托品预孵育对CF无直接影响(图3 b)。在CF中加入ACh进一步抑制束的运动,并与异丙托品预孵育没有挽救作用。在异丙托品(ipratropium)处理后,CF上与WT气管上的管束形态相似(图3 c),但乙酰胆碱的刺激并未造成额外的粘液分泌,而相比之下,WT气管(图3 d)。
CF气管的SEM显微照片显示长束离开粘膜下腺(图4一黄色箭头),在粘膜下腺和MUC5AC在表面杯状细胞的免疫染色MUC5B(图4 b我们研究了荧光小珠和阿利新蓝染色黏液束的运输。这些珠子以类似WT的形状聚集并向喉部移动(补充电影S4)。当图像叠加,很明显的是,珠没有重叠与阿尔新蓝染色(补充电影S5)。与WT中一样,Cch刺激后,念珠的移动速度有加快的趋势,而阿利新蓝染束的移动速度减慢(图4 c)。因此,ASL和粘液捆包也有在CF相反的响应,虽然速度被显着地降低。
在CF中,来自粘膜下腺体的MUC5B粘液束被来自体表杯状细胞的MUC5AC所保留
的爱茜蓝染色的束有MUC5B的芯染色与翅荚百脉根植物血凝素(LTL) [6]在WT和CF(图5ac).经荧光素标记的LTL染色的活仔猪气管粘液束,但荧光珠不与LTL阳性的粘液束结合,因为它们直接出现在粘膜下腺体(图5b因此,这些黏液束离开腺体时没有粘珠,但在以后的时间点黏液束收集了这些黏液束,这表明后来收集这些黏液束的物质也聚集在了黏液束上。可见,经阿利新蓝或LTL染色的黏液束与荧光珠有明显的区别,与WT相似。
阿利新蓝染菌束的厚度在WT和CF (图6)。从LTL染色估计的束厚度也相似,具有一种倾向,是在CF更薄(图6 b)。有研究表明,黏液束被困在大鼠的腺体内。12],这可能导致在CF.更少粘液束的现象当测量凝集素染色的束的总体积,没有观察到主要的差异(图6 c)。
我们之前已经证明了,对于小肠粘液的正常剥离,足够量的碳酸氢盐是必要的,而去除碳酸氢盐浆膜导致WT小肠与CF相似[13]。当用阿利新蓝染色的WT气管外植体从缓冲液中去除碳酸氢盐时,运输速度与CF (图6 d),强调碳酸氢盐和功能性CFTR的重要性。
在CF中,黏液束被MUC5AC从表面的杯状细胞中保留下来
为了探索束运输在CF中是如何减慢的,我们用LTL(绿色)和MUC5AC粘蛋白从表面杯状细胞中染色MUC5B束,用UEA1凝集素(红色)(图2 c和4b)。在WT(图7A)和CF(图7C),捆扎物由涂有MUC5AC的MUC5B核心组成[6]。束与杯状细胞之间的接触点可以在高倍共焦图像中观察到(图7A'及c ')及扫描电子显微镜图像(图7b和d)。在WT和CF,所述粘蛋白MUC5AC从气管表面杯状细胞出现时,涂覆在MUC5B束和连接的两个。测量束和上皮之间的距离,揭示用于在CF更短的距离与WT相比的趋势(图8a)。有趣的是,经评估为muc5ac染色连接的杯状细胞和束之间的接触点数量在CF (图8B)。
为了说明观察到的不同粘液束运动对清洁细菌气管表面的影响,我们加入了tamra染色铜绿假单胞菌细菌(红色),以对仔猪气管LTL染色束(绿色)(图8C和d)。在WT,细菌很快在移动束收集基本上不含细菌的(离开表面图8C和补充电影S6)。与此相反,在CF中,细菌覆盖在上皮表面,而管束上的细菌基本停滞(图8d和补充电影S7)。粘液束扫过气管表面,因此可用于清洗气管支气管表面和CF结果停滞在束从上皮表面的细菌的低效结算必需的。
讨论
分析粘液在活的有机体内要么离体在生理方式是具有挑战性的。一个主要的问题是,粘液是完全透明的,因此不可见。阳离子阿辛蓝染料结合到所述多个负电荷的粘蛋白结构域的发现的聚糖,并已使用了几十年来染色粘液上的组织切片。现在,我们已经利用了这一点,并用阿尔新蓝染色住气管外植体。我们最初的惊喜,我们观察到从粘膜下腺开口出现厚阿尔新蓝染色粘液束[6]。其他研究人员使用40纳米荧光珠染色“黏液”[14]。这些珠子是羧酸改性的,因此带负电荷。这些珠子没有黏液束,而是聚集在其他未知结构上,被阿利新蓝或LTL染色很弱。Cch刺激阿利新蓝束和珠束在WT和CF中的转运方向相反;这进一步支持阿利新蓝和荧光珠标记不同的材料。Cch后珠子运输速度的增加与我们观察到的粘液纤毛清除的速度相似,例如,微光学相干断层扫描(micro-optical coherence tomography) [2,15]。该表面液体经常被称为“粘液”,但在正常肺这是一样的ASL。为了避免混淆,我们使用珠运输术语“ASL”。该正常ASL应当分开来自于人支气管上皮培养物中观察疾病期间积聚在上皮表面粘液[16]。
在猪和人类肺部有许多粘膜下腺体组织的理想,从线性MUC5B黏蛋白聚合物[使粘液束5]。在正常的肺中,这些粘液束是头侧运输的,并通过这种方式扫过气管表面[6]。的正常气管支气管的表面覆盖着美国手语∼10µm,其中4 - 5µm是被纤毛在猪和人类2]。粘液包远厚(平均厚度µm 27日)比美国手语深度,因此包正在和部分动用美国手语。
期间朝向喉部传输从腺体粘液束覆盖有材料从既在WT和CF.表面杯状细胞此物质含有MUC5AC粘蛋白,是由外源凝集素UEA1染色以及连接在表面杯状细胞与束。束和上皮表面之间的距离是在WT和CF类似,但连接的数量在CF.是高四倍正如从捆WT和CF腺体出现了,并且发现气管表面上至约相同的程度,我们发现难以设想,粘液束被专门连接到腺开口,如已经提出别处[12,17]。相比之下,我们的结果表明,黏液束被锚定在CF的杯状细胞表面。黏液束的MUC5B核心被MUC5AC黏液蛋白包裹,杯状细胞也存在于腺体导管中[2,6)提供一个解释如何可以看到粘液包被保留在CF腺开口。我们的研究结果表明,表面粘液包固定在表面上皮杯状细胞,这包是保存在表面,从而阻碍脱落进入气管腔。由于黏液束的传输速度比ASL慢10倍,我们进一步假设黏液束的传输是由杯状细胞束锚栓的附着/脱落控制的。这与我们在小肠中观察到的情况相似,小肠中需要一种特殊的蛋白酶将黏蛋白从杯状细胞锚中分离出来[13,18]。
CF的特点是停滞的黏液允许细菌过度生长。我们现在表明,粘液束被新生仔猪CF以及在WT移除时碳酸氢基本静止。一个s the piglets were <24 h old at analysis, our results suggest that human CF lung disease also starts at birth, strongly suggesting that treatment of human CF should start early.
此外,铜绿假单胞菌添加到气管的细菌迅速从WT中去除,但没有从CF组织中去除。这在CF图像中可以作为一个更高的背景来观察。造成这种差异的原因是与上皮表面的特异性结合多还是少,或者是否存在束清扫,或者两者的结合,目前尚不清楚。重要的一点是,在CF中,从出生起气道清洁就已经存在缺陷,细菌的积聚可能导致肺部疾病。
胆碱能系统为呼吸生理学重要的,因为迷走神经胆碱使用,以增加气道平滑肌张力,粘膜下腺的分泌在因为它抑制表面液体吸收[相同的时间和纤毛运动频率2,3.]。在哮喘和慢性阻塞性肺病中胆碱能紧张增加是常见的[8,9],而麝香菌素抑制剂溴化异丙托品(Atrovent)则被用于COPD的药理学治疗。使用这种治疗方法是相当违反直觉的,除了它对支气管收缩的抑制作用。然而,我们发现乙酰胆碱能迅速阻止黏液束的运输,这提示了另一种新的机制,可以解释抗胆碱能治疗的一些有益效果。异丙托品,及其抗疟药M1,米2和M3.受体抑制,有效地逆转了这种效果。新生正常仔猪气管并不代表COPD患者的肺表型,因为这些患者已经积累了粘液并堵塞了气道。然而,COPD患者有临床记录的溴化异丙托品的有益作用,我们认为这是由于其抗胆碱能作用抵消了achc诱导的粘液束运输减少。在慢性阻塞性肺病患者中,这种影响可能局限于受影响较小的部分。异丙托溴铵治疗慢性阻塞性肺病的临床结果在其他文献中有报道[19]。异丙托溴铵有新生仔猪CF影响不大,这表明初始CF疾病作用通过不同的机制比在COPD。然而,缺乏初始CF疾病的效果确实在先进的CF疾病并不意味着缺乏的影响[20]。
增加迷走神经的语气和ACh的生理反应是灰尘吸入,影响屏蔽包运动在美国手语同时移动速度是一个逻辑更有效地收集碎片到粘液包之前,这些都是分离的,能够有效地运输喉部的碎片。我们的结果进一步表明,黏液束的运动受黏液束附着/脱离到表面杯状细胞的控制。
补充材料
补充材料
请注意:补充材料不是编辑部编辑的,而是根据作者提供的内容上传的。
补充材料。ERJ-00457-2018_Supplement
电影S1。阿利新蓝染色管束在WT仔猪气管上。ERJ-00457-2018_Supplement_Movie_S1
电影S2。珠收集有关WT仔猪气管。ERJ-00457-2018_Supplement_Movie_S2
电影S3。CF仔猪气管阿利新蓝染色。ERJ-00457-2018_Supplement_Movie_S3
电影S4。CF仔猪气管上的念珠。ERJ-00457-2018_Supplement_Movie_S4
电影S5。阿利新蓝和珠对CF仔猪气管。ERJ-00457-2018_Supplement_Movie_S5
电影S6。染色铜绿假单胞菌加入到WT仔猪气管与LTL染色束(绿色)的细菌(红色)。ERJ-00457-2018_Supplement_Movie_S6
电影S7。染色铜绿假单胞菌添加到CF仔猪气管的细菌(红色)与ltl染色束(绿色)。ERJ-00457-2018_Supplement_Movie_S7
确认
感谢Jeffrey Wine(美国斯坦福大学)和David Thornton(英国曼彻斯特大学)的宝贵讨论。
脚注
这篇文章有提供补充材料www.qdcxjkg.com
利益冲突:G.C.汉森在研究进行期间报告从健康,欧洲研究理事会,瓦伦堡,Lederhausen和CFF,全国学院资助。
支持声明:这项工作是支持的欧洲研究理事会,瑞典研究理事会,瑞典癌症基金会,克努特和爱丽丝•瓦伦堡基金会IngaBritt Arne Lundberg基金会,卡大学医院(ALF),威廉和玛蒂娜·朗格的基础,国家过敏症和传染病研究所(U01AI095473),艾丽卡马特的基金会,瑞典心肺基础,瑞典的囊性纤维化基金会,马格努斯Bergvall的基础上,哥德堡大学(University of Gothenburg)利德豪森(Lederhausen) CF研究中心和囊性纤维化基金会(CFFT, Hansso14X0)。本文的资助信息已存入Crossref资助者注册表。
- 收到2018年3月5日。
- 接受2018年5月17日。
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