一个惊险的故事粘稠的粘液
囊性纤维化患者有呼吸困难,因为他们的航空公司满是厚厚的粘液。这种粘液积累,因为有一个缺陷是如何生产出来的?还是因为其他疾病积累特性,如脱水或气道壁重构?区分这些可能性是重要的未来的药物开发。在小猪的囊性纤维化的一项研究中,Hoeggeret al。识别粘液生产作为主要缺陷(见酒的角度来看)。仔猪的呼吸道腺体合成股粘液正常,但链没有释放,保持拴在腺导管。
文摘
在患有囊性纤维化肺病(CF)是由缺陷宿主防御,容易使呼吸道细菌感染。先进的CF的特点是黏膜纤毛的运输(MCT)的赤字,这一过程陷阱和推动细菌的肺,但这是否赤字第一或二次发生气道重塑一直不清楚。评估特定轴,我们跟踪运动的radiodense microdisks航空新生仔猪的CF。胆碱能刺激,抒发粘液分泌,显著降低了microdisk运动。受损的MCT不是由于periciliary液体损耗;相反,CF黏膜下腺体分泌的粘液股仍然拴在腺导管。抑制阴离子non-CF航空公司复制CF异常分泌物。因此,受损的MCT在CF主要缺陷,表明黏膜下腺体和拴在粘液可能是早期CF治疗的目标。
囊性纤维化(CF)是一种遗传性疾病的突变造成的雌性生殖道,一个基因编码离子通道(囊性纤维化跨膜电导调节(雌性生殖道)],传输跨上皮细胞膜氯离子和碳酸氢(1)。肺疾病,多数患者死亡率CF的来源,来自缺陷宿主防御,容易使呼吸道细菌感染。黏膜纤毛的运输(MCT)保护气道粘液中俘获的病原体,和纤毛推动肺的食物(2- - - - - -4)。其特定的观测异常发达CF (3)和一些体外研究(5)导致了MCT原因受损CF肺部疾病的建议。然而,体内的数据表明CF MCT缺陷可能是继发于炎症和气道重塑。例如,在一些研究中CF成年人没有特定异常,和CF的孩子表现出没有特定缺陷(3,6,7)。此外,MCT赤字增加CF肺部疾病的严重程度增加,和其他肺部疾病,气道炎症也与MCT缺陷(8)。直到现在,缺乏敏感的MCT化验和动物模型复制人类CF阻止从一开始就确定特定轴是否受损,从而导致发病机制或者是一个次要缺陷。
猪的CF模型提供了一个机会来测试其特定体内疾病的起源(9)。出生时,航空公司与CF猪感染和炎症但缺乏自发发展标志CF功能,包括感染、炎症、粘液积聚,阻碍。测定MCT体内具有良好的空间和时间分辨率,我们开发了一个x射线计算tomography-based试验跟踪运动的350 -μm直径钽microdisks (10)(见补充材料和方法)。
最新MCT化验指标的消失(间隙)在吸入放射性标记的放射性粒子(3,6,7)。吹气后新生的小猪航空公司,类似比例的microdisks CF和non-CF肺在10分钟(图1,A和B和图S1) (10)。microdisks被向喉,他们迁移到腹侧气管表面两种基因型(图1 c),符合我们发现纤毛取向驱使microdisks罕见(10)。两种基因型推动microdisks具有类似最大和平均速度,和microdisks花了相似比例的时间移动(图1 D F)。因此,在基础条件下,CF MCT似乎完好无损。
(一个)图像重建ventral-dorsal non-CF和CF航空基础条件下,后1.28×107静脉注射(IV)醋甲胆碱摩尔/公斤。图像的开始和结束一段10分钟跟踪(电影S1, a和B)。microdisks位置显示为球体(实际面积扩大~ 40倍)。(B来F从八个小猪没有CF)符号表示数据和八个动物CF研究1.28×10之前和之后7四乙酰甲胆碱摩尔/公斤。每个数据点代表的平均行为个人microdisks小猪在10分钟追踪运行。行个人数据均值±SEM和胡须旁边。*P< 0.05;成对的学生的t测试。(B)的百分比microdisks,扫清了10分钟追踪期间跟踪领域。(C)径向位置的microdisks 10分钟跟踪周期的开始和结束。数据的绝对值角度相对于腹侧(0°)。(D和E) microdisks最大和平均速度。(F)的时间百分比microdisks正跟踪运行期间。__P< 0.05;未配对学生的t测试。分析与线性混合效应模型进行随机效应对猪产生了一个类似的结论(P= 0.024)。分析(F)没有调整的多重比较。
气道侮辱可以引起胆碱能反射,增加纤毛击败保护性反应并生成丰富的粘膜下腺体粘液分泌(4,11,12)。胆碱能受体激动剂乙酰甲胆碱引起纤毛拍频CF和non-CF肺(图S2A)。然而,它倾向于减少的百分比microdisks清除肺部CF (图1,A和B和电影S1)。个人microdisk行为的测量表明,醋甲胆碱加速最大和平均microdisk速度在没有CF的小猪,但不是那些疾病(图1,D和E图S1, C, E)。基因型的最显著区别是与CF小猪,醋甲胆碱减少的时间百分比个人microdisks运动~ 40% (图1 f)。因此,而不是加强MCT和气道防御,胆碱能受体激动剂阻碍MCT和CF小猪。一个可能的体内研究的局限性在于,小猪是懒散的,麻醉,没有咳嗽;胆碱能刺激清醒动物可能会产生不同的反应。
几项研究气道上皮细胞培养的报道,雌性生殖道增加Na的损失+通道活动,导致多余的液体从气道表面吸收;减少periciliary液体;纤毛功能受损;,从而减少MCT (5)。然而,文化模型没有概括其特定的复杂性,因为粘液不能输入或逃避文化和模型缺乏黏膜下腺体,估计产生粘液的~ 95%大航空公司(4)。注入乙酰甲胆碱后,我们发现periciliary液体深度没有不同基因型(图开通),与以往的研究一致与CF猪和人类(13,14)。然而,粘液覆盖纤毛是经常脱落在处理过程中,我们不能评估潜在影响的分泌量减少了CF黏膜下腺体(15,16)。结果表明,中华人民共和国交通部负责在一起,可能会破坏腺体的CF异常而不是表面的上皮细胞。为了验证这一点,我们从methacholine-treated淹没了气管与盐水小猪卷> periciliary液体体积的1000倍(图2一个和电影S2)。这种干预可以防止气道表面上皮细胞改变液体的体积或组成覆盖航空公司。
(一个)示意图显示气管从小猪醋甲胆碱处理(1.28×105摩尔/公斤,IV),沿腹侧表面,与生理盐水、应用microdisks钽表面,和跟踪的运动。图像(B)的例子;数据(C)的平均水平。(B)microdisks轨道。红色圆圈表示microdisk开始的位置。箭头指示的位置跟踪领域退出。黑色圆圈表示结束的位置microdisks未能明确跟踪领域。红圈黑色的轮廓显示磁盘,一动也不动。虚线框显示跟踪领域。规模酒吧、2毫米。从10分钟跟踪图像是编译期(电影S2, a和B)。C)的时间百分比microdisks移动。N= 4气管从小猪和CF。*P< 0.05;未配对学生的t测试。误差棒表示SEM。
Microdisks添加到水下non-CF航空公司几乎没有停止过,因为他们发展到颅和腹侧边缘(图2 b和电影S2, A和B)。在CF气管,一些microdisks旅行就像那些non-CF气管。然而,CF microdisks在运动的时间降低了~ 50% (图2 c在良好的协议与体内数据(),图1 f)。这些结果进一步排除periciliary液体损耗是MCT受损的原因。此外,在某些情况下,我们可以看到,消除CF粘液与附加股microdisks(电影S2C)。
进一步调查CF粘液异常,我们检查了醋甲胆碱反应,因为它引起体内和体外(CF MCT缺陷无花果。1和2),它会刺激粘膜下腺体分泌,液体和蛋白质组成的包括黏蛋白,这赋予关键结构属性粘液(11,12)。也可以激活胆碱能刺激雌性生殖道,增加的驱动力阴离子通过雌性生殖道分泌,从而提高液体分泌(17,18)。实时可视化粘液,我们覆盖切除气管与稀盐水含有悬浮的荧光团簇(40直径)(图3和电影S3)。
Submucosal gland duct openings are indicated by arrowheads. (A) Schematic of imaging procedure. All experiments were repeated at least three times. Non-CF tracheas were removed from piglets, opened along the ventral surface, pinned flat, submerged in a HCO3–- and CO2-buffered Ringer’s solution, and treated with 1.28 × 10–5 mol/liter methacholine. Tracheas were opened along the ventral surface so that cilia would propel mucus and nanospheres to lateral edges of the tracheal preparation (10). The solution bathing the trachea contained a dilute suspension of fluorescent 40-nm nanospheres. Images were obtained with a high-speed confocal microscope at the tracheal surface. Green indicates fluorescence from nanospheres (movie S3A). (B) Reconstruction of mucus (labeled with green nanospheres) emerging from a submucosal gland duct onto the airway surface (gray) (movie S3B). Scale bar, 50 μm. (C) Mucus strands grow in length from submucosal glands. (Top) Saline contained a dilute suspension of green and red nanospheres, and both labeled a mucus strand. Green nanospheres were then removed from saline, and the mucus strand continued to elongate from the gland duct, as indicated by labeling with red nanospheres 25 min later (bottom). Scale bar, 50 μm. (D) Mucus strand grew from the openings of submucosal gland ducts and then broke free and rapidly flowed out of the microscopic field (movie S3C). Time is shown at bottom. The gray background in the leftmost panel denotes a reflected light image. Scale bar, 50 μm. (E) Mucus strand “α,” anchored at an arrowhead, temporarily captures another mucus strand (“β”) flowing past. α stretches, and then the connection between α and β breaks at 140 s. Immediately after the break, β leaves the field, and α snaps back to its original length (movie S3D). The gray background in the leftmost panel denotes a reflected light image. Scale bar, 50 μm.
粘膜下腺管开口用箭头表示。(一个)成像过程的示意图。所有实验至少重复三次。Non-CF气管从小猪取出,打开沿着腹侧表面,压平,HCO淹没3- - - - - -- - -有限公司2缓冲林格氏溶液,1.28×10对待5摩尔/升醋甲胆碱。气管被打开在腹侧表面使纤毛推动粘液和团簇的侧边缘气管准备(10)。解决洗澡气管包含一个稀释暂停荧光40团簇。获得图像高速共焦显微镜在气管表面。绿色表示从团簇荧光(电影S3A)。(B)重建的粘液(标有绿色团簇)新兴从粘膜下腺体导管在气管表面(灰色)(电影S3B)。酒吧,规模50μm。(C从黏膜下腺体)粘液链长度增长。(上)盐水含有稀释暂停绿色和红色的团簇,并贴上粘液链。绿色的团簇然后从盐水中取出,粘液腺管链继续拉长,用红团簇的标签25分钟之后(底部)。酒吧,规模50μm。(D)粘液链增长从黏膜下腺体导管的开口,然后迅速挣脱了,流出的微观领域(电影S3C)。时间显示在底部。最左边的面板的灰色背景代表一个反射光图像。酒吧,规模50μm。(E)粘液链“α”,锚定在一个箭头,暂时捕获另一个粘液链(β)流过去。α延伸,然后α和β优惠在140年代之间的联系。休息后,β叶子,和α突然恢复到原来的长度(电影S3D)。最左边的面板的灰色背景代表一个反射光图像。酒吧,规模50μm。
团簇与粘液时,增加当地强调链密度和小球的粘液流动或与航空公司(电影S3A)。醋甲胆碱刺激生产的粘液链从黏膜下腺体导管上散发出来,有时扩展数百微米的锚点(图3 b和电影S3B)。链增长从腺导管的长度(图3 c)。随着粘液链增长,他们挣脱了,进行气道(图3 d和电影S3C)。粘液链流动表面有时、拉伸固定线。如果两条线分开,链连接到一个黏膜下腺体通常仰像橡皮筋(图3 e和电影S3D),表明弹性和韧性,粘液的重要属性。反射光的研究(电影S3E),扫描电子显微镜和免疫细胞化学研究(图S3, A和B),还揭示了粘液链从黏膜下腺体导管。
因为我们的初步观察显示更多的粘液CF航空公司,我们开发了一个时间平均过程优先可视化静止的粘液和整个气管段提供全景视图(图4无花果,S4和电影S4)。在下半场基底内,固定粘液很少发现non-CF航空公司(图4 b和电影S4A)。添加醋甲胆碱之后,nanosphere-labeled粘液移动,因此没有可视化;只有积累在腹侧和颅后变得明显的边缘气道部分。在基础条件下,表面的CF气管透露只有少量的静止的粘液。然而,醋甲胆碱刺激产生了明显不同的外观,与许多固定粘液链和小球未能脱离黏膜下腺体导管(或附加到固定股),而不是整个气道流动(图4,C和E无花果,S5和电影S4B)。
(一个)成像过程的示意图。(B来D)图像全景气管部分获得的时间平均技术,可视化静态粘液用荧光团簇标记(见图S4和电影S4)。黑色线条的图像是别针气管。荧光标记粘液灰度图所示。(图片(B) (D)代表个人气管;实验的平均数据和数字所示(E)和(F)) (B, D)航空公司从methacholine-treated (1.28×105摩尔/公斤,(四)小猪和图片被抓获的下半场基底段,然后添加1.28×10后45分钟5摩尔/升醋甲胆碱。规模的酒吧,1毫米。看电影S4, A到c (B) Non-CF气管。注意沿颅粘液(白色)的积累和腹侧的边缘组织。一些静态粘液的左下non-CF气管连接销的组织优势。(C) CF气管。(D)。Non-CF气道刺激HCO醋甲胆碱3- - - - - -无HEPES-buffered (pH值7.4或6.8)盐水含有10μM布美他尼。(E)粘液拴在黏膜下腺体non-CF和CF航空45分钟后加醋甲胆碱。见补充材料和方法的描述拴在粘液得分。N= 7 non-CF和7 CF气管,*P< 0.05;未配对学生的t测试。误差棒表示SEM。(F)粘液拴在黏膜下腺体non-CF气管45分钟后加醋甲胆碱。气管在HCO沐浴3- - - - - -- - -有限公司2缓冲盐(N= 12),HCO3- - - - - -- - -有限公司2缓冲盐含有10μM布美他尼(N= 8),HCO3- - - - - -无HEPES-buffered (pH值7.4或6.8)盐(N= 9),或HCO3- - - - - -无盐含布美他尼(N= 11)。*P< 0.05单向方差分析和Bonferroni测试后。(G和H)结合反射的光和荧光图像显示的位置钽microdisks(黄色圆圈)和粘液;粘液经常缠绕在microdisks和部分被遮挡。Microdisks HCO应用于non-CF气管3- - - - - -无盐含有布美他尼(G)和CF气管(H)。随后添加荧光团簇盐水显示所有固定microdisks粘液。这些数据还表明,粘液链形成独立的团簇。箭头指示黏膜下腺体导管。实验至少重复三次。规模的酒吧,1毫米。看电影S4, E和F。
粘液未能分离,尽管是沐浴在盐水的成分控制,表明CF粘液异常之前出现在气道表面。这个结果指向一个缺陷在黏膜下腺体;他们表达丰富的雌性生殖道(19,20.),开展Cl- - - - - -和HCO3- - - - - -(21),导致液体分泌(11,17,22,23)。测试如果阴离子运输的损失可能在CF改变粘液的行为负责,我们沐浴在HCO non-CF气管3- - - - - -无盐或盐含有布美他尼,抑制基底Cl- - - - - -进入上皮细胞(23)。无论是单独引起粘液超然的失败(图S6)。然而,结合时,他们的CF表现型复制拴在粘液链和小球(图4 D和F和电影自己)。跟踪粘液链的源显示黏膜下腺体导管作为他们的起源(电影S4D)。由于上皮细胞衬离子运输航空公司不会改变液体覆盖表面的组成,这些变化可以归因于阴离子为黏膜下腺体分泌减少流明。结果也符合先前的调查结果,同时抑制Cl- - - - - -和HCO3- - - - - -分泌改变粘膜下腺体分泌物的粘弹性特性(4,24)。
探索是否粘液阻碍microdisks我们使用体内的运动(图1),我们应用它们non-CF HCO上皮细胞3- - - - - -无盐+布美他尼,发现他们未能在表面移动。添加荧光团簇透露microdisks连着粘液(图4 g和电影S4E)。我们获得类似的结果在航空公司的小猪CF (图4 h和电影S4F)。
我们的研究结果确定受损粘液脱离CF黏膜下腺体破坏MCT作为主要缺陷。Na+hyperabsorption气道上皮细胞表面和periciliary液体损耗(5)不解释数据。这些体内和体外结果链接雌性生殖道的损失和减少阴离子改变粘液分泌,减少能力从腺体后打破。既减少了Cl- - - - - -和HCO3- - - - - -端依赖液体分泌(23,24)和减少HCO3- - - - - -分泌(或酸性pH值)(25- - - - - -27)提出了改变CF粘液性质。我们的数据表明,无论是本身,可能就足以产生异常CF粘液。
结合我们以前的结果(28),这些研究结果显示,雌性生殖道的损失破坏两肺防御过程:MCT和分泌抗菌活性。脊椎动物和无脊椎动物使用这两个防御的接触环境病原体。CF并不能消除防御,但它确实减少它们的有效性。恶性循环造成的局部破坏的两个进程可以部分解释更严重的肺病的CF与原发性纤毛运动障碍相比,它抹平了MCT (29日),因为一个防御可能强调牺牲另一个缺陷。例如,粘液,未能分离会损害其特定条件下为微生物的生长提供一个病灶,促进抗宿主防御已经削弱了CF (28,30.)。相反,抗菌活性的减少可能会导致感染,引起粘膜下腺体分泌,和有缺陷的粘液脱离会损害其特定。炎症导致的缺陷都将引起粘膜下腺体肥大,进一步增加静态粘液。因为新生儿普遍筛查CF在许多国家,一个早期干预存在的机会。我们的数据表明,黏膜下腺体和粘液拴在他们可能的早期治疗目标,MCT化验报告治疗效果。
补充材料
引用和笔记
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应答:我们感谢m·阿布阿莱瓦,r . j .亚当,e . Allard l . a . Askland d . c . Bouzek k .查洛n . d . Gansemer o . a . Itani想知道t·a·梅休s Mobberley j·h·摩根,l . r . Reznikov j . Sieren m . r . Stroik p•j•塔夫脱,t·j·沃伦宝贵的帮助和讨论。这项工作是由美国国立卫生研究院(HL051670、HL091842 DK054759),卡佛基金会和囊性纤维化基金会(CFF)。支持D.A.S.基科学研究学者计划在囊性纤维化和美国国立卫生研究院(DP2 HL117744)。A.J.F. CFF奖学金支持。M.J.W.霍华德·休斯医学研究所的研究员。爱荷华大学研究基金会提交专利申请CF猪和范例遗传学许可材料和技术。M.J.W.范例遗传学的创始人和持有股权。E.A.H.是维达诊断的创始人和持有股权,公司商业化肺图像分析软件。
![Fig. 4 Mucus strands fail to detach from submucosal glands when ex vivo CF airways are treated with methacholine or when liquid secretion is inhibited in non-CF airways.(A) Schematic of the imaging procedure. (B to D) Images are panoramic views of tracheal sections obtained with a time-averaging technique that visualizes static mucus labeled with fluorescent nanospheres (see fig. S4 and movie S4). Black lines on the sides of images are pins holding trachea. Fluorescently labeled mucus is shown in grayscale. [Images in (B) to (D) represent individual tracheas; average data and numbers of experiments are shown in (E) and (F).] (B to D) Airways were removed from methacholine-treated (1.28 × 10–5 mol/kg, IV) piglets, and images were captured at the end of a 15-min basal period and then 45 min after adding 1.28 × 10–5 mol/liter methacholine. Scale bar, 1 mm. See movie S4, A to C. (B) Non-CF trachea. Note the accumulation of mucus (white) along the cranial and ventral edges of the tissue. Some static mucus on the lower left of the non-CF trachea was attached to a pin at the tissue edge. (C) CF trachea. (D). Non-CF airways stimulated with methacholine in HCO3–-free HEPES-buffered (pH 7.4 or 6.8) saline containing 10 μM bumetanide. (E) Mucus tethered to submucosal glands on non-CF and CF airways 45 min after adding methacholine. See supplementary materials and methods for description of tethered mucus score. N = 7 non-CF and 7 CF trachea, *P < 0.05; unpaired Student’s t test. Error bars denote SEM. (F) Mucus tethered to submucosal glands on non-CF trachea 45 min after adding methacholine. Trachea were bathed in HCO3–- and CO2-buffered saline (N = 12), HCO3–- and CO2-buffered saline containing 10 μM bumetanide (N = 8), HCO3–-free HEPES-buffered (pH 7.4 or 6.8) saline (N = 9), or HCO3–-free saline containing bumetanide (N = 11). *P < 0.05 by one-way analysis of variance and Bonferroni post-test. (G and H) Combined reflected light and fluorescence images show the positions of tantalum microdisks (yellow circles) and mucus; mucus often wrapped around microdisks and partly obscured them. Microdisks were applied to non-CF trachea in HCO3–-free saline containing bumetanide (G) and to CF trachea (H). Subsequent addition of fluorescent nanospheres to saline revealed that all stationary microdisks were attached to mucus. These data also indicate that mucus strands formed independently of nanospheres. Arrowheads indicate submucosal gland ducts. Experiments were repeated at least three times. Scale bars, 1 mm. See movie S4, E and F.](https://science.sciencemag.org/content/sci/345/6198/818/F4.large.jpg?width=800&height=600&carousel=1){kind=link}
