摘要gydF4y2Ba
我们旨在描述支气管扩张和囊性纤维化(CF)肺中的淋巴样新生,并研究细菌感染的作用。gydF4y2Ba
采用免疫组织化学染色和形态计量学分析对非吸烟者、支气管扩张或纤维化患者的手术肺切片进行淋巴聚集物检测。gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba——或者gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba在小鼠气管内灌注涂覆琼脂糖珠。在14天内检测淋巴样新生和趋化因子表达动力学。gydF4y2Ba
在非吸烟者的肺中淋巴聚集物很少,但在支气管扩张和CF中发现了大量含有b淋巴细胞、t淋巴细胞、生发中心和高内皮小静脉的支气管周围淋巴聚集物。小鼠的肺在基线时没有淋巴聚集物。在持续gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba或gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba发生气道感染支气管周围淋巴样新生。灌注后第14天,淋巴聚集物表达三级淋巴器官标记物和趋化因子CXCL12和CXCL13。气道上皮是CXCL12、CXCL13和白细胞介素- 17a表达的重要部位,开始于灌注后第1天。gydF4y2Ba
支气管扩张和CF中存在支气管周围三级淋巴器官,持续的细菌感染引发小鼠支气管周围淋巴细胞新生。三级淋巴器官的支气管周围定位和趋化因子的上皮表达提示气道上皮在淋巴新生中的作用。gydF4y2Ba
摘要gydF4y2Ba
支气管扩张和CF患者细菌感染诱导的支气管周围淋巴样新生可累及气道上皮gydF4y2Bahttp://ow.ly/pDMB308a3B0gydF4y2Ba
简介gydF4y2Ba
慢性细菌感染是支气管扩张患者肺部疾病的标志[gydF4y2Ba1gydF4y2Ba]以及囊性纤维化(CF)患者[gydF4y2Ba2gydF4y2Ba].革兰氏阴性菌感染(gydF4y2Ba例如:铜绿假单胞菌gydF4y2Ba)及/或革兰氏阳性(gydF4y2Ba例:金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba)促进气道炎症和结构损伤,促进两种疾病的疾病进展[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba].这些疾病的宿主-病原体相互作用研究通常集中在先天免疫反应,包括气道上皮反应和吞噬细胞的募集(gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba中性粒细胞及巨噬细胞)[gydF4y2Ba3.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba].然而,支气管扩张患者的支气管活检显示上皮下浸润,主要由单个核细胞组成,以t淋巴细胞为主[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba].此外,一项对CF患儿支气管活检的研究表明,与气道腔内以中性粒细胞为主的炎症相反,淋巴细胞积聚在支气管黏膜[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba].这些数据表明,适应性免疫反应有助于支气管扩张和CF的病理生理学。gydF4y2Ba
适应性免疫反应始于次级淋巴器官,如淋巴结和脾脏,其中T和b淋巴细胞克隆扩增,然后被招募到炎症部位[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba].次级淋巴器官在胚胎发育期间发育,但出生后粘膜表面可发育异位淋巴结构,其结构与次级淋巴器官(称为三级淋巴器官)相似[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].正常肺中不存在三级淋巴器官[gydF4y2Ba12gydF4y2Ba],但在患有慢性气道疾病(包括哮喘)的受试者的肺部也有发现[gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]和慢性阻塞性肺病[gydF4y2Ba14gydF4y2Ba],以及肺癌[gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba].尽管长期以来在一些支气管扩张患者中描述了淋巴样聚集物[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]以及严重CF患者[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba],但尚不清楚这些聚集物是否被组织成三级淋巴器官,其中包含不同的B细胞和t细胞区,以及可以启动抗原特异性适应性免疫反应的生发中心[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba19gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
动物研究表明,与慢性气道疾病相关的刺激,包括过敏原,可诱导肺第三淋巴器官[gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]、香烟烟雾[gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]、病毒感染[gydF4y2Ba22gydF4y2Ba]以及反复使用细菌产物挑战气道[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba,gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]或热灭活细菌[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].然而,目前尚不清楚慢性细菌感染是否会导致第三淋巴器官的发育,这一过程称为淋巴样新生。导致淋巴样新生的机制似乎因刺激而异:抗原- [gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]、香烟烟雾- [gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]和病毒引起的[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba淋巴新生似乎依赖于趋化因子CXCL13,而热灭活gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba-诱导的淋巴样新生发生在CXCL13缺失的情况下,需要趋化因子CXCL12 [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].最后,肺中三级淋巴器官的发育依赖于t细胞产生的白介素(IL)-17A [gydF4y2Ba25gydF4y2Ba,gydF4y2Ba27gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
在本研究中,与不吸烟的对照组相比,支气管扩张或CF患者肺部的淋巴细胞浸润是其特征。支气管扩张和CF患者的支气管周围淋巴样聚集物表现为三级淋巴样器官的特征。由于支气管扩张和CF的特征是慢性气道感染,我们假设感染在淋巴样新生过程中发挥了作用。因此,我们通过革兰氏阴性菌(gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba)或革兰氏阳性(gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba)细菌对小鼠气道淋巴细胞募集和淋巴样新生的影响。gydF4y2Ba
方法gydF4y2Ba
人体肺标本gydF4y2Ba
在手术中获得了17例因单发肺癌而进行肺切除术的患者(对照组),8例因局部支气管扩张而进行大叶切除术的患者(6例为结核后,1例为儿童肺炎后遗症,1例为特发性)和17例移植时的成年CF患者的肺标本。所有患者均为非吸烟者,对照组患者支气管抽吸物培养中未发现细菌。患者的临床特征见在线补充表S1。在对照组中,只有在远离癌症的宏观正常区域切除的一块组织是可用的。在支气管扩张或CF患者中,从两到三个不同的组织块中获得组织,其位置是随机选择的,以减少与组织重塑不规则分布相关的潜在采样偏差。该研究获得了当地伦理委员会的同意(CPP Ile de France II;编号1072)使用人类来源的样本。gydF4y2Ba
动物研究gydF4y2Ba
持续性气道感染琼脂糖珠模型gydF4y2Ba
所有的动物实验都获得了巴黎笛卡尔大学伦理审查委员会的批准(CEEA34.PRB.135.12)。10周龄的雌性C57BL/6N小鼠购自Harlan(法国Gannat),并在常规条件下饲养。通过气管内滴注含琼脂糖珠获得持续性气道感染gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2BaO1群(PAO1;5×10gydF4y2Ba5gydF4y2Ba每只动物的CFU)或gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba(SA);从CF患者痰液中分离的甲氧西林敏感临床菌株;10gydF4y2Ba7gydF4y2Ba每只动物CFU),采用MgydF4y2Ba阿廷gydF4y2Ba等gydF4y2Ba.[gydF4y2Ba28gydF4y2Ba].无菌、PAO1或sa包被小球灌注小鼠,于灌注后第1、4、7、14天处死小鼠。gydF4y2Ba
免疫组织化学染色gydF4y2Ba
经右心冲洗4%多聚甲醛后取出肺,固定于4%多聚甲醛中。如前所述,在人或小鼠肺中获得的5µm石蜡切片进行免疫染色[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba]用于检测b淋巴细胞(CD20gydF4y2Ba+gydF4y2Ba), t淋巴细胞(CD3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba),高内皮小静脉(外周淋巴结地址素(PNAdgydF4y2Ba+gydF4y2Ba)、滤泡树突状细胞、增殖细胞核抗原(PCNA;用于鉴别生发中心[gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba])和CXCL12、CXCL13和IL-17A。一抗来源、稀释和揭罩技术的详细描述见在线补充表S2。生物素化抗鼠、抗兔、抗鼠或抗山羊抗体(稀释1:200;使用Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)用于二抗,并根据亲和素-生物素-过氧化物酶复合物方法的标准协议显示结合抗体(Elite ABC试剂盒;向量的实验室)。组织切片用苏木精或甲基绿反染色(Vector实验室)。当省略一抗时,未观察到染色(在线补充图S1)。gydF4y2Ba
的形态学分析gydF4y2Ba
在人类和动物研究中,定量形态测量分析由两名独立的观察者使用光学显微镜(Leica Microsystems, Wetzlar, Germany)与计算机连接[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba].淋巴样聚集物定义为CD20gydF4y2Ba+gydF4y2Ba或CD3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba可以使用低功率场检测到的细胞聚合(×16)。淋巴组织聚集数以cm表示gydF4y2Ba2gydF4y2Ba的肺。CXCL12、CXCL13和IL-17A染色的上皮细胞体积比由点计数法测定,如前所述[gydF4y2Ba29gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
流式细胞术gydF4y2Ba
用2 mL生理盐水冲洗小鼠肺进行支气管肺泡灌洗,用40 μm尼龙膜过滤支气管肺泡灌洗液,去除琼脂糖珠。balf以250倍离心gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C下放置6分钟。将细胞颗粒悬浮在含胎牛血清的200 μL PBS中,并将其分离成相等的两部分,用流式细胞术评估髓系和淋巴系染色,如前所述[gydF4y2Ba32gydF4y2Ba].造血细胞亚群的特征如先前报告所述[gydF4y2Ba33gydF4y2Ba](在线补充表S3),在线补充表S4提供了一次抗体的描述。gydF4y2Ba
肺匀浆中CXCL12、CXCL13和IL-17A蛋白的测定gydF4y2Ba
根据制造商的建议,使用ELISA试剂盒(R&D Systems, Abingdon, UK)测定小鼠肺匀浆中的CXCL12、CXCL13和IL-17A蛋白浓度。gydF4y2Ba
统计数据gydF4y2Ba
使用非参数Kruskal-Wallis检验分析从形态测量分析中获得的数据gydF4y2Ba事后gydF4y2Ba邓恩的测试。形态测量的观察者间变异系数<15%。从肺匀浆中蛋白质浓度测量中获得的数据采用单向方差分析对重复测量进行分析gydF4y2Ba事后gydF4y2Ba学生-诺伊曼-基尔斯多重比较测验。所有分析均使用Prism 5软件(GraphPad, La Jolla, CA, USA)进行。p值≤0.05为有统计学意义。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
人肺支气管周围淋巴聚集物gydF4y2Ba
在对照组非吸烟者的肺中,CD20gydF4y2Ba+gydF4y2Ba淋巴聚集体稀少而小,不含生发中心;它们位于血管周围或距离支气管较远的肺泡间隙。在支气管扩张或CF患者的肺部,可见大量的大CD20gydF4y2Ba+gydF4y2Ba淋巴样聚集,主要集中在支气管附近。在支气管扩张或CF患者的肺中,许多淋巴聚集物显示出三级淋巴器官的特征,具有明显的b细胞和t细胞区,高内皮小静脉和生发中心(特征为滤泡树突状细胞(FDC)和PCNA染色阳性)。代表性的显微照片显示在gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba而且gydF4y2BabgydF4y2Ba.定量形态分析证实CD20数量显著增加gydF4y2Ba+gydF4y2Ba, CD3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba, FDCgydF4y2Ba+gydF4y2Ba, PCNAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba和PNAdgydF4y2Ba+gydF4y2Ba支气管扩张或CF患者肺部淋巴样聚集(gydF4y2Ba图1 c ggydF4y2Ba).gydF4y2Ba
趋化因子CXCL12和CXCL13在人肺中的表达gydF4y2Ba
在对照组非吸烟者的肺中,CXCL12和CXCL13的免疫染色较弱,并定位于气道上皮。在支气管扩张和CF肺中,CXCL12和CXCL13免疫染色出现在支气管周围淋巴聚集物中。此外,纤毛细胞气道上皮中CXCL12和CXCL13染色强烈,但杯状细胞中没有(在线补充图S2)。IL-17A免疫染色在对照组非吸烟者的上皮细胞中较弱,但在支气管扩张或CF患者的上皮细胞中升高gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba气道上皮中CXCL12、CXCL13和IL-17A染色的形态学分析见gydF4y2Ba图2罪犯gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
持续性气道感染诱导小鼠支气管周围淋巴细胞新生gydF4y2Ba
接下来,我们研究了持续性细菌感染对小鼠淋巴细胞新生的影响。单次气管内灌注含PAO1或SA的琼脂糖珠导致细菌感染持续14天(在线补充图S3)。在灌注PAO1或sa包被小球后的第14天,淋巴聚集物中含有CD20gydF4y2Ba+gydF4y2Bab细胞和CD3gydF4y2Ba+gydF4y2Bat细胞,CD21gydF4y2Ba+gydF4y2Ba种,PNAdgydF4y2Ba+gydF4y2Ba高内皮小静脉和PCNAgydF4y2Ba+gydF4y2Ba在含珠(感染)气道附近发现了增殖的b细胞。而形态正常的肺在这些气道附近未见淋巴样聚集。同样,在灌注无菌珠的小鼠和对照组(未灌注)小鼠的气道中也未发现淋巴样聚集物。代表性的显微照片显示在gydF4y2Ba图3gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
要考察执着的作用gydF4y2Ba与gydF4y2Ba急性淋巴细胞新生感染,我们在小鼠鼻内灌注亚致死剂量的PAO1 (10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba每只动物的CFU)或SA (10gydF4y2Ba9gydF4y2Ba每只动物CFU),而不将细菌嵌入琼脂糖珠中。在灌注后14天,PAO1或SA感染消失,未发现淋巴聚集(未显示),证实需要持续的气道感染才能诱导支气管周围淋巴样新生。gydF4y2Ba
细菌诱导小鼠肺淋巴样新生的动力学gydF4y2Ba
首先用流式细胞术评估了持续细菌感染期间呼吸道中髓样细胞和淋巴样细胞的招募,并在BALF中灌注pao1包被小球(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba).PAO1感染的早期反应包括在灌注后24小时内大量粒细胞重新聚集,但持续性感染与随后BALF中细胞总数的减少有关。在灌注后第4天,中性粒细胞数量的减少与其他先天免疫细胞的招募有关,包括巨噬细胞、单核细胞和自然杀伤细胞。骨髓树突状细胞和适应性免疫细胞的气道招募gydF4y2Ba即。gydF4y2BaB-和t淋巴细胞开始于第4 ~ 7天,并在灌注后第14天增加。sa感染小鼠BALF的视觉细胞计数显示了类似的结果,而无菌珠的灌注导致BALF巨噬细胞的短暂和中度增加,中性粒细胞或淋巴细胞数量没有变化(在线补充图S4)。gydF4y2Ba
免疫组化染色分析淋巴细胞的组织募集情况。在灌注PAO1或sa包被小球24小时内,CD20gydF4y2Ba+gydF4y2Bab细胞被招募到含珠气道上皮附近;在感染的第一周,CD20延长gydF4y2Ba+gydF4y2Ba淋巴组织聚集在含珠气道附近。感染诱导的CD3募集gydF4y2Ba+gydF4y2Bat细胞延迟:CD3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba淋巴样聚集物在灌注PAO1或sa包被小球后第7天首次发现,并在第14天达到高峰。CD20数量的形态计量学分析gydF4y2Ba+gydF4y2Ba和CD3gydF4y2Ba+gydF4y2Ba在气管内灌注PAO1或sa包被小球后14天出现淋巴样聚集物gydF4y2Ba图5gydF4y2Ba.有代表性的显微照片显示在在线补充图S5中。第三淋巴器官在灌注后持续≥28天(未显示)。gydF4y2Ba
细菌诱导小鼠肺中CXCL12、CXCL13和IL-17A表达的动力学gydF4y2Ba
在对照组(未灌注)小鼠和灌注无菌琼脂糖珠小鼠中,肺匀浆中可检测到CXCL12、CXCL13和IL-17A蛋白(gydF4y2Ba图6 a - cgydF4y2Ba);仅在气道上皮可见弱免疫组化染色(未显示)。gydF4y2Ba
在灌注pao1包被小球后的第1天,肺匀浆中CXCL13和IL-17A蛋白含量增加,但CXCL12蛋白含量没有增加。肺匀浆中IL-17A含量在感染14天内持续增加,而CXCL13含量在第4天和第14天下降。gydF4y2Ba
免疫组化染色显示气道上皮是CXCL12、CXCL13和IL-17A表达的重要部位,形态测量分析显示感染后第1天气道上皮中CXCL12、CXCL13和IL-17A表达明显增加(gydF4y2Ba图6 d-fgydF4y2Ba).免疫染色显示,在感染的14天内,上皮细胞CXCL13和IL-17A仍然升高,而在持续感染期间上皮细胞CXCL12下降。在PAO1或SA感染后第14天,CXCL12和CXCL13也在淋巴聚集物中表达,而IL-17A则不表达gydF4y2Ba图6克gydF4y2Ba).gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
在支气管扩张或严重CF患者中发现了表现第三淋巴器官特征的支气管周围淋巴样聚集物,而在对照组非吸烟者中没有观察到。在小鼠中,持续性(但不是短暂性)细菌感染gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba或gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba诱导b淋巴细胞在感染气道周围迅速聚集,然后是t淋巴细胞。感染后14天内,支气管周围淋巴聚集物显示出三级淋巴器官特有的结构特征。这些数据表明,持续的细菌感染有助于慢性气道疾病中观察到的淋巴样新生。gydF4y2Ba
在所有严重CF患者和大多数支气管扩张患者的气道上皮下均发现含有大量b细胞的淋巴样聚集物。HgydF4y2BaubeaugydF4y2Ba等gydF4y2Ba.[gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]研究了9名CF患者在移植时气道黏膜浸润的炎症细胞与3名非CF器官供者的比较,并报告了CF患者气道壁上的大群b细胞;此外,远端气道t细胞增多。尚不确定这些聚集物是否表现出三级淋巴器官的特征。WgydF4y2BahitwellgydF4y2Ba[gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]对支气管扩张患者的手术标本进行了组织化学研究,并描述了气道上皮下的淋巴样聚集物,但没有进一步的特征描述。基于CF患儿支气管活检的研究[gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]或非cf型支气管扩张患者[gydF4y2Ba6gydF4y2Ba,gydF4y2Ba7gydF4y2Ba]报告t细胞数量增加[gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]只有偶尔在气道上皮下出现b细胞簇[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba].我们认为,这些研究中b细胞数量较少可能与取样偏差有关,因为b细胞倾向于聚集在特定的上皮下区域,而我们发现t细胞更广泛地存在于上皮下。我们的研究证实了支气管扩张或CF患者气道上皮下存在大量的B细胞聚集物,并通过证明这些淋巴样聚集物包含不同的B细胞和t细胞区、生发中心、fdc和高内皮小静脉来扩展先前的发现。这些特征是三级淋巴器官的标志,在三级淋巴器官中启动局部适应性免疫反应[gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba11gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
通过动物模型,我们发现持续性气道感染诱导的支气管周围淋巴聚集,其特征为三级淋巴器官,与支气管扩张或CF患者中观察到的类似。实际上,两者都是如此gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba- - -gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba-触发的淋巴聚集体包含生发中心、fdc,同时表达CXCL12和CXCL13。这些发现不同于FgydF4y2BaleigegydF4y2Ba等gydF4y2Ba.[gydF4y2Ba25gydF4y2Ba他们报告说,反复吸入热灭活gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba诱导淋巴样聚集,其特征是在C57BL/6小鼠中缺乏fdc或其他cxcl13表达细胞。这些差异可能是由实验刺激的差异所解释的,并提示不同的刺激可能触发淋巴样新生gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba不同的机制。重要的是,我们的感染诱导淋巴细胞新生模型在很大程度上模拟了在支气管扩张或CF患者中发现的CXCL12和CXCL13的表达。此外,我们发现IL-17A在淋巴细胞新生中发挥了重要作用[gydF4y2Ba27gydF4y2Ba],在小鼠持续细菌感染时气道上皮中表达。有趣的是,我们发现IL-17A在支气管扩张或CF患者的气道上皮中表达,证实了之前在CF患者中获得的数据[gydF4y2Ba34gydF4y2Ba].gydF4y2Ba
本研究的优势在于使用人类组织来描述人类病理,并使用小鼠模型来探索持续性细菌感染在人类支气管周围淋巴样新生中的可能作用。琼脂糖珠中的包埋细菌定位于气道管腔内,模拟CF气道的气道感染,其中细菌定位于气道管腔内的粘液塞[gydF4y2Ba35gydF4y2Ba].刺激在珠粒中的定位使刺激与淋巴聚集物之间的空间关系得以研究,而淋巴聚集物在含珠气道附近的定位表明气道上皮在淋巴样新生过程中起着作用。细菌感染24小时内气道上皮中CXCL12、CXCL13和IL-17A的免疫定位进一步加强了这一建议。由于感染是通过一次气管内灌注细菌包裹的琼脂糖珠引发的,因此有可能检查淋巴样聚集物形成的动力学,这在使用重复吸入刺激的模型中是不可能的[gydF4y2Ba23gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba25gydF4y2Ba].例如,单次吸入热灭活gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2Ba小鼠淋巴滤泡诱导失败,需要每周重复吸入5至10次[gydF4y2Ba36gydF4y2Ba],因此很难在后一种模型中检验淋巴样新生的动力学。gydF4y2Ba
我们也认识到本研究的局限性。人类手术组织仅在肺移植时严重CF患者中可用,而在病情较轻的患者中无法检查支气管周围淋巴样聚集物的存在。同样,只有接受肺切除术的局部支气管扩张患者的亚群可以检查。我们的研究描述了细菌诱导的淋巴细胞新生的动力学,但没有研究稳态趋化因子的作用(gydF4y2Ba如。gydF4y2BaCXCL12, CXCL13), IL-17A或其他分子(gydF4y2Ba如。gydF4y2Bab细胞活化因子[gydF4y2Ba37gydF4y2Ba,gydF4y2Ba38gydF4y2Ba]或IL-6 [gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]),它们与淋巴细胞新生有关。最后,未来的研究应研究b细胞和t细胞在感染诱导的淋巴样新生中的相对贡献。gydF4y2Ba
本研究显示支气管周围三级淋巴器官存在于晚期(gydF4y2Ba即。gydF4y2Ba接受手术切除局部严重支气管扩张或肺移植)的肺部疾病,而先前的研究表明,CF胎儿肺部的b淋巴细胞非常罕见[gydF4y2Ba40gydF4y2Ba],它们可能不会受到细菌感染。因为呼吸道感染发生在CF患者生命早期[gydF4y2Ba41gydF4y2Ba],我们推测支气管周围淋巴细胞新生可能是生命的早期事件。有趣的是,研究在gydF4y2Ba基本1 bgydF4y2BatggydF4y2Ba+gydF4y2Ba在气道中过度表达上皮钠通道β-亚基的小鼠发现,这些小鼠出现气道粘液堵塞、细菌感染和淋巴聚集[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba].虽然gydF4y2Ba基本1 bgydF4y2BatggydF4y2Ba+gydF4y2Ba在无菌条件下生长,没有气道细菌感染,它们仍然显示气道淋巴聚集[gydF4y2Ba42gydF4y2Ba].然而,淋巴样聚集物在生命早期被发现,当细菌感染时更突出gydF4y2Ba基本1 bgydF4y2BatggydF4y2Ba+gydF4y2Ba老鼠(gydF4y2Ba42gydF4y2Ba].综上所述,这些数据表明,脱水诱导的黏液停滞可能促进气道中的淋巴样聚集,细菌感染可能是慢性气道疾病中观察到的支气管周围淋巴样新生的主要驱动因素。gydF4y2Ba
总之,我们的数据清楚地表明存在局部适应性免疫反应,涉及支气管扩张和CF中的支气管周围淋巴样新生。重要的是,在其他慢性气道炎症性疾病中也观察到持续的细菌感染(gydF4y2Ba如。gydF4y2Ba慢性阻塞性肺病)[gydF4y2Ba43gydF4y2Ba足以引发小鼠支气管周围淋巴细胞新生。虽然目前的研究没有检查淋巴聚集在气道防御病原体和/或疾病免疫病理中的作用[gydF4y2Ba9gydF4y2Ba],我们的动物模型为研究淋巴样聚集物的发展及其在气道中的持久性提供了独特的细胞和分子机制模型。未来的研究应特别关注气道上皮在这些过程中的可能作用。gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
请注意:gydF4y2Ba补充材料不是编辑部编辑的,上传时是作者提供的。gydF4y2Ba
补充表gydF4y2Baerj - 01873 - 2016 - _supplementgydF4y2Ba
补充图S1。用于免疫染色的二抗阴性对照的代表性显微照片。在pao1感染小鼠(上组)或CF患者(下组)中获得切片,用山羊、大鼠、兔子或小鼠Ig继发性Ab孵育,用过氧化物酶进行免疫染色,如方法所述。所有切片均未观察到阳性免疫染色,证实了小鼠和人切片免疫染色的特异性。原始放大倍率为100。酒吧200×;µm。gydF4y2Baerj - 01873 - 2016 - _supplementary_figure_s1gydF4y2Ba
补充图S2。代表性的显微照片描述了囊性纤维化患者气道上皮中CXCL12和CXCL13的定位。切片用Ab免疫染色CXCL12(左)或CXCL13(右),用苏木精反染色。纤毛细胞免疫染色呈阳性(棕色),杯状细胞未见阳性(用*标记)。原放大倍率200倍;Bar 50µm。gydF4y2Baerj - 01873 - 2016 - _supplementary_figure_s2gydF4y2Ba
补充图S3。灌注PAO1或SA小鼠14天内的细菌计数。小鼠在灌注后第1、4、7、14天灌注PAO1或sa包被琼脂糖珠(如方法所述)和祭品。无菌条件下取出牺牲肺,用0.5 ml生理盐水匀浆,10倍稀释后的肺匀浆在37℃无氨苄青霉素溶原肉汤培养基上孵育24小时后计数。N≥5只动物/实验条件。柱状图显示SEM。gydF4y2Baerj - 01873 - 2016 - _supplementary_figure_s3gydF4y2Ba
补充图S4。持续性细菌感染期间BALF的差异细胞计数。小鼠不接受气管内灌注(对照组),或接受无菌琼脂糖珠(无菌)或含有琼脂糖珠的气管内灌注gydF4y2Ba铜绿假单胞菌gydF4y2BaO1 (PAO1)或gydF4y2Ba金黄色葡萄球菌gydF4y2Ba(SA)。对照组在基线和灌注后第1天、第4天和第14天进行BALF。肉眼计数Diff-Quick染色的细胞旋(每种条件n≥6只动物)。*,与对照组相比P<0.05;†,与无菌组相比P<0.05。gydF4y2Baerj - 01873 - 2016 - _supplementary_figure_s4gydF4y2Ba
补充图S5。PAO1或SA持续气道感染时B和T淋巴细胞招募的代表性显微照片。小鼠在灌注后第1、4、7、14天灌注PAO1或sa包被琼脂糖珠(如方法所述)和祭品。切片用Abs染色(棕色),以CD20鉴定B淋巴细胞,以CD3鉴定T淋巴细胞。细菌感染时,支气管周围间隙招募B、T淋巴细胞。有趣的是,B淋巴细胞比T淋巴细胞更早被招募。gydF4y2Baerj - 01873 - 2016 - _supplementary_figure_s5gydF4y2Ba
披露的信息gydF4y2Ba
补充材料gydF4y2Ba
P-R。BurgelgydF4y2Baerj - 01873 - 2016 - _burgelgydF4y2Ba
即FajacgydF4y2Baerj - 01873 - 2016 - _fajacgydF4y2Ba
c·马丁gydF4y2Baerj - 01873 - 2016 - _martingydF4y2Ba
确认gydF4y2Ba
我们感谢Guiti Thévenot和Mélanie Bigeat(巴黎笛卡尔大学,巴黎,法国)和Abdelhouab Bouaboud和Claire Toustou(科钦研究所,巴黎)的技术贡献。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
这篇文章有补充资料可从gydF4y2Bawww.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
支持声明:导致这些结果的研究获得了欧盟第七框架计划(FP7/2007-2013)的资助,资助协议号为603038 (CFMATTERS),来自'Université de Paris (Legs Poix)和法国囊性纤维化协会(Vaincre la Mucoviscidose)。J. Frija-Masson是由“Fondation Groupama”为罕见疾病提供的奖学金获得者。本文的资助信息已存入gydF4y2Ba交叉参考基金注册gydF4y2Ba.gydF4y2Ba
利益冲突:可以在本文旁边的网站上找到信息披露gydF4y2Bawww.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2016年9月22日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2017年1月4日。gydF4y2Ba
- 版权所有©ERS 2017gydF4y2Ba
参考文献gydF4y2Ba
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