文摘gydF4y2Ba
在这项研究中,我们调查的含义NLRP3 inflammasomes特发性肺纤维化(IPF)的发病机理和类风湿性arthritis-usual间质性肺炎(RA-UIP)。gydF4y2Ba
NLRP3 inflammasome激活在基线和与脂多糖刺激后/ ATP是评估通过测量白介素(IL) 1β和地震水平在支气管肺泡灌洗液(BALF)流体和BALF细胞的文化。IL-1βBALF和地震水平明显升高,BALF巨噬细胞培养RA-UIP病人,符合预先存在的inflammasome激活这些病人。相比之下,在IPF BALF IL-1β水平升高相对大大小于RA-UIP和地震-低于控制。此外,在inflammasome刺激,IPF BALF巨噬细胞文化未能上调IL-1β和部分地震-分泌,显示与控制,健壮的IL-1β和地震upregulation。有趣的是,RA-UIP BALF细胞培养用脂多糖治疗/ ATP显示地震的有力刺激分泌但不是IL-1β,后者如果文化已经升高,而考试的胞内IL-1β水平RA-UIP BALF细胞在NLRP3 inflammasome刺激显示的一个重要upregulation IL-1β暗示NLRP3通路可能进一步激活。gydF4y2Ba
综上所述,我们的研究结果表明,不同inflammasome激活配置文件自身免疫性和特发性肺纤维化之间的关系。gydF4y2Ba
文摘gydF4y2Ba
自身免疫性之间不同NLRP3 inflammasome激活配置文件和IPF肺巨噬细胞与控制gydF4y2Bahttp://ow.ly/UKYlpgydF4y2Ba
介绍gydF4y2Ba
的主要致病的事件特发性肺纤维化(IPF)仍不确定,尽管近年来增加了临床和科研(gydF4y2Ba1gydF4y2Ba,gydF4y2Ba2gydF4y2Ba]。中位数生存的时间是3年,解释了为什么IPF诊断是目前被认为比许多癌症致死(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba]。IPF的放射和病理模式是常见的间质性肺炎(摘要)gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。摘要,与其他胶原蛋白组织障碍,也是最常见的模式在肺间质参与发生在类风湿性关节炎患者(RA-UIP) [gydF4y2Ba5gydF4y2Ba]。RA-UIP和IPF一些相当有趣的相似性在临床和分子水平上gydF4y2Ba5gydF4y2Ba,gydF4y2Ba6gydF4y2Ba]gydF4y2Ba。gydF4y2Ba因此,它是至关重要的确定初始的事件驱动肺纤维化的发病机制,自身免疫性和IPF肺纤维化,与组织学或放射的摘要特别是现在我们正式进入了一个新的时代,有两个新的代理能够减缓IPF进展(gydF4y2Ba7gydF4y2Ba,gydF4y2Ba8gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
Inflammasomes是多分子的蛋白复合物负责caspase-1-driven激活炎性细胞因子白介素(IL) 1β(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba11gydF4y2Ba]。他们被承认其为参与先天免疫的分子模式(pamp;在细菌、病毒和真菌)和细胞内和细胞外的有关分子模式(gydF4y2Ba9gydF4y2Ba]。此外,先天免疫机制提出了一个基本角色在IPF的起始,主要通过toll样受体的激活(TLR) 9,使肺纤维化疾病的迅速发展通过肺成纤维细胞的分化成myofibroblasts [gydF4y2Ba12gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
我们组曾表明,原代细胞培养的巨噬细胞IPF患者感染单纯疱疹病毒显示一个管制先天免疫轴与表达血管生成增加,纤维发生标记(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。在IPF NLRP3激活也可能受损,是细菌和病毒感染的固有免疫反应在IPF成纤维细胞和巨噬细胞(gydF4y2Ba3gydF4y2Ba,gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba14gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
先前的研究在动物模型表明,刺激与石棉、博来霉素、二氧化硅和他汀类药物激活inflammasomes IL-1β并最终生产活跃,刺激生产的转化生长因子(TGF) -β中央中介发展的肺纤维化gydF4y2Ba通过gydF4y2Ba成纤维细胞增殖、胶原蛋白生产和抑制纤维母细胞凋亡(gydF4y2Ba15gydF4y2Ba,gydF4y2Ba16gydF4y2Ba]。有趣的是,它假定药物诱导NLRP3激活导致间质性肺疾病(gydF4y2Ba17gydF4y2Ba]。Caspase-1活动也被直接联系系统性sclerosis-related纤维化,这表明自分泌信号由IL-1β和地震-促进pro-fibrotic表型观察到这些患者(gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。此外,NLRP3 inflammasome激活中性粒细胞哮喘(有关gydF4y2Ba19gydF4y2Ba),而inflammasome-regulated细胞因子至关重要介质的急性肺损伤gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。另外,最近的一份报告表明,NLRP3 inflammasome途径不是稳定的慢性阻塞性肺疾病的严重程度相关分析后在支气管肺泡灌洗液(BALF)和细胞组件(gydF4y2Ba21gydF4y2Ba]。最近的证据表明吸烟可能激活NLRP3,另一个环境风险因素对IPF和风湿性关节炎,进一步支持inflammasomes在肺纤维化的可能的含义gydF4y2Ba10gydF4y2Ba,gydF4y2Ba18gydF4y2Ba]。IL-1β的角色出现在香烟烟雾诱发肺气肿的发病机制和小气道重构(gydF4y2Ba22gydF4y2Ba,gydF4y2Ba23gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
在目前的研究中,我们试图调查是否NLRP3 inflammasomes参与在特发性肺纤维化的发病机制(IPF)和自身免疫性(RA-UIP)肺部疾病。我们使用IL-1β和地震BALF中细胞因子的表达和BALF巨噬细胞文化NLRP3激活的替代标记。我们的研究结果显示不同的自身免疫性肺纤维化和IPF之间inflammasome激活配置文件。gydF4y2Ba
患者和方法gydF4y2Ba
病人gydF4y2Ba
连续33受试者参加本研究三组:IPF组(n = 16), RA-UIP组(n = 8)和对照组(n = 9)。从所有患者知情同意了。这项研究是大学医院的伦理委员会批准的伊拉克里翁,克里特岛,希腊(17517/19 - 12 - 2013)。gydF4y2Ba
所有患者接受完整的肺功能测试在线(见补充材料)。之前没有收到任何免疫抑制治疗的患者支气管镜检查。gydF4y2Ba
生物样品和处理gydF4y2Ba
BALF是获得所有的病人和控制使用标准方法网上(见补充材料)。BALF分数是汇集和分裂一样:一个样本被送到临床微生物学和细胞学实验室和其他样本用于这项研究,隔离后巨噬细胞数量,如前所述网上(见补充材料)gydF4y2Ba13gydF4y2Ba]。BALF细胞计数进行了使用一种改进的纽鲍尔室。gydF4y2Ba
等量的BALF细胞样本被加载到six-well heat-inactivated盘子用RPMI补充10%胎牛血清的培养基。gydF4y2Ba
BALF样本分析使用标准方法网上(见补充材料)。gydF4y2Ba
Inflammasome激活gydF4y2Ba
地刺激与脂多糖(LPS,gydF4y2Ba大肠杆菌gydF4y2BaO111;默克公司)(pg·250毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba,孵化在37°C / 2 h公司5%gydF4y2Ba2gydF4y2Ba湿润孵化器)随后NLRP3 inflammasome激活5毫米ATP脉冲(三磷酸腺苷二钠盐水合物;Sigma-Aldrich) 20分钟在37°C / 5%的股份有限公司gydF4y2Ba2gydF4y2Ba的存在与否,caspase-1抑制剂(Calbiochem)(在线补充图S1),如前所述[gydF4y2Ba24gydF4y2Ba]。细胞被离心收获1500×gydF4y2BaggydF4y2Ba在4°C。收集上清液和细胞细胞溶解在里帕缓冲区(Sigma-Aldrich),根据制造商的指示。上层清液和细胞提取存储在−80°C。gydF4y2Ba
总RNA提取和实时PCR进行使用标准方法网上(见补充材料)。gydF4y2Ba
地震,分泌IL-1βTNF-α和il - 6在上层清液都是评估ELISA使用商业套装(eBioscience),根据制造商的指示。结果正常化代表pg·毫升gydF4y2Ba−1gydF4y2Ba每10gydF4y2Ba6gydF4y2Ba细胞。gydF4y2Ba
细胞内IL-1β蛋白质含量(正常肌动蛋白)评估通过免疫印迹,如前所述网上(见补充材料)。gydF4y2Ba
统计分析gydF4y2Ba
ELISA、免疫印迹以及定量实时PCR相对表达式结果评估使用一个示例Kolmogorov-Smirnov拟合优度检验和t检验和团体之间的配对(每组之间的配对条件)。使用SPSS 17.0统计分析进行了(美国SPSS,芝加哥,IL)。统计学意义是设定在95%的水平(p < 0.05)。gydF4y2Ba
结果gydF4y2Ba
病人的特点gydF4y2Ba
人口统计数据和病人肺功能测试和控制所示gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba。临床特点和IPF的肺功能测试gydF4y2Ba与gydF4y2BaRA-UIP组没有统计学意义,除了性(主要是女性RA-UIP组,p = 0.003)、用力肺活量在RA-UIP组高(p = 0.03)。患者的年龄也差不多。此外,扩散能力显著低于IPF RA-UIP病人与控制(gydF4y2Ba表1gydF4y2Ba)。IPF BALF细胞群没有区别,RA-UIP患者(gydF4y2Ba表2gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
NLRP3 inflammasome-related蛋白和促炎细胞因子在IPF和RA-UIP BALFgydF4y2Ba
最初,我们测量IL-1β,IPF BALF中il - 6和地震水平和RA-UIP病人与控制相比,作为一个表明NLRP3 inflammasome激活。我们观察到显著水平升高IL-1β和地震-分泌RA-UIP患者的肺的肺泡空间与控制和IPF患者相比(gydF4y2Ba图1一个gydF4y2Ba和gydF4y2BacgydF4y2Ba),清楚地表明在RA-UIP inflammasome通路的激活。虽然不像RA-UIP和控制之间的差异明显,IPF BALF表现出更高水平的IL-1β和低水平的地震与控制相比,因此并不表明inflammasome激活。有趣的是,我们观察到BALF中il - 6水平升高和IPF RA-UIP患者,建议其他炎症通路在IPF可能活跃的(gydF4y2Ba图1 bgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
接下来,我们研究先天免疫细胞的作用,如巨噬细胞衬里肺泡上皮细胞,分泌的IL-1β和地震在IPF和RA-UIP病人。的表达NLRP3 inflammasome组件以及IL-1β地震生产评估如果BALF巨噬细胞文化(gydF4y2Ba图2gydF4y2Ba)。我们观察到基线水平的mRNA的表达NLRP3 inflammasome组件gydF4y2BaNLRP3gydF4y2Ba和gydF4y2Bacaspase-1gydF4y2Ba在RA-UIP和IPF患者升高与控制(gydF4y2Ba图2一个gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba)。然而,有趣的是,我们观察到,类似于BALF、文化BALF RA-UIP患者巨噬细胞分泌显著大量的IL-1β与IPF患者和控制(gydF4y2Ba图2 cgydF4y2Ba)。的地震,但是,显示高值在两个病人组,IPF有最高的分泌水平(gydF4y2Ba图2 egydF4y2Ba)。此外,il - 6,高架RA-UIP和IPF患者(gydF4y2Ba图2 dgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
Inflammasome IPF肺泡巨噬细胞激活受损gydF4y2Ba
肺泡巨噬细胞需要两个信号以激活inflammasome-dependent caspase-1,导致成熟的IL-1β和地震的释放,PAMP时信号,如toll样受体激动剂,和组织损伤的第二信号,如ATP (gydF4y2Ba25gydF4y2Ba]。我们进行了gydF4y2Ba体外gydF4y2Ba治疗方法与有限合伙人和ATP的文化巨噬细胞从NLRP3 BALF确定感应途径在这些细胞。此外,由于pro-IL-1β乳沟是主要由caspase-1介导,导致生产IL-1β,我们执行NLRP3激活在存在caspase-1抑制剂(IL-1β转换酶抑制剂)。gydF4y2Ba
控制样品,有限合伙人治疗导致显著增加IL-1β地震-分泌2 - 3.7倍,分别为(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba)。然而,增加ATP有限合伙人预处理细胞进一步导致显著增加IL-1β独自和地震-分泌相对于LPS处理3.7 - 4倍,分别。正如预期的那样,IL-1β和地震水平显著降低caspase-1抑制剂的存在,表明一个特定的激活NLRP3 inflammasome主文化的肺泡巨噬细胞(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba)。IL-1β和地震相比,有限合伙人+ ATP治疗并没有导致显著增加il - 6和TNF-α水平相对有限合伙人单独治疗,如预期(gydF4y2Ba图4gydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们下一个治疗肺泡巨噬细胞从BALF的IPF和RA-UIP病人,作为控制的描述。我们观察到,在IPF, IL-1β水平没有增加有限合伙人+ ATP后单独治疗或有限合伙人(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba),而地震明显调节ATP脉冲时添加到有限合伙人治疗(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba),虽然地震感应的IPF更明显比观察控制(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。在RA-UIP巨噬细胞文化中,我们观察到,有限合伙人IL-1β的分泌增加;然而,增加ATP没有进一步提高IL-1β水平,如前所观察到的控制样品(gydF4y2Ba图3一gydF4y2Ba)。然而地震,由有限合伙人+显著调节ATP治疗RA-UIP巨噬细胞文化同样控制(gydF4y2Ba图3 bgydF4y2Ba)。此外,il - 6和TNF-α水平并没有改变在IPF LPS刺激后,RA-UIP样本,观察在控件(gydF4y2Ba图4一gydF4y2Ba和gydF4y2BabgydF4y2Ba)。gydF4y2Ba
我们也分析了裂解的细胞内水平IL-1β通过免疫印迹,观察控制IL-1β细胞内水平高与IPF和RA-UIP相比,表明大量的IL-1β保留控制BALF巨噬细胞的细胞质(在线补充图S2)。inflammasome激活,IL-1β水平增加控制而caspase-1抑制剂的存在降低IL-1β水平。这个IL-1β模式也观察到RA-UIP样品,但不是在IPF样本。gydF4y2Ba
讨论gydF4y2Ba
目前的研究调查NLRP3通路的激活从IPF患者BALF和RA-UIP基线和后NLRP3 inflammasome激活。gydF4y2Ba
我们的研究结果显示不同的自身免疫性肺纤维化和IPF之间inflammasome激活配置文件。总的来说,我们的研究结果表明,inflammasome激活是IPF BALF巨噬细胞严重受损。此外,RA-UIP inflammasome激活配置文件是不同的,因为IL-1β和地震在基线水平已经很高,尽管upregulation仍然是可能的,如图所示的进一步增加新产生的细胞内成熟IL-1β水平有限合伙人+ ATP后治疗。gydF4y2Ba
Inflammasomes RA-UIP肺被激活gydF4y2Ba
我们发现IL-1β和地震水平升高RA-UIP BALF。IL-1β和地震,至少部分由肺泡巨噬细胞分泌的因为我们观察到,如果巨噬细胞培养这些细胞因子而产生更高水平的控制。此外,mRNA水平的其他组件的NLRP3途径等gydF4y2BaNLRP3gydF4y2Ba和gydF4y2Bacaspase-1gydF4y2Ba也调节RA-UIP-derived BALF细胞。RA-UIP患者主要是不吸烟者和因此明显inflammasome激活不能归因于吸烟,一个已知的inflammasome诱导物。IL-1β水平升高和地震RA-UIP患者也可能由于inflammasome-independent机制。值得注意的是,中性粒细胞的主要生产商inflammasome-independent成熟IL-1β[gydF4y2Ba26gydF4y2Ba]。RA-UIP组BALF中中性粒细胞计数作为预期升高样品,这也可能解释这些患者BALF中IL-1β水平升高。gydF4y2Ba
BALF中il - 6水平也升高和RA-UIP BALF细胞培养上清液的病人。急性IL-1β释放到外周血中细胞刺激反应移植各种促炎细胞因子的表达,包括il - 6 (gydF4y2Ba4gydF4y2Ba,gydF4y2Ba5gydF4y2Ba),它可以假设这也发生在支气管肺泡空间RA-UIP患者。gydF4y2Ba
我们观察到的趋势IL-1βupregulationgydF4y2Ba在体外gydF4y2Ba刺激患者BALF细胞RA-UIP有限合伙人,而细胞内IL-1β生产引发后续增加ATP。但值得一提的是,在控制细胞内IL-1β水平高如果和积累进一步刺激细胞,细胞相比RA-UIP病人。最近的一项研究显示,积累大量的unsecreted IL-1β,保留细胞在LPS-stimulated BALF细胞(gydF4y2Ba25gydF4y2Ba),在控制协议与我们的观测。这个显著的区别是有趣的和一个可能的解释可能是,细胞内IL-1β水平减少由于高架NLRP3 inflammasome RA-UIP患者的激活配置文件。然而,由于我们观察一个强大的细胞内upregulation IL-1β表达式在inflammasome RA-UIP肺泡巨噬细胞活化,这是完全抑制caspase-1抑制剂的存在,我们可以推断出inflammasome通路可以进一步激活这些病人。gydF4y2Ba
受损的激活NLRP3 inflammasome IPFgydF4y2Ba
在IPF RA-UIP相比,我们观察到仅略更高水平的IL-1βBALF中相对于控件,而培养BALF细胞分泌IL-1β水平略低于控制。在这两种情况下,然而,IL-1β水平明显下降相比,RA-UIP样本。有趣的是,在IPF,类似于RA-UIP样本,基线gydF4y2BaNLRP3gydF4y2Ba和gydF4y2Bacaspase-1gydF4y2Ba表达培养BALF巨噬细胞以及地震和il - 6水平高于对照组。有趣的是,有人建议,改变信号在IPF初级纤维母细胞il - 6文化可能会加强这些细胞的抗凋亡,有助于在IPF pro-fibrotic il - 6的影响gydF4y2Ba27gydF4y2Ba]。此外,血清il - 6水平被认为预测早期患者的疾病进展的系统性sclerosis-associated间质性肺疾病(gydF4y2Ba28gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
这项工作的主要发现是IPF患者肺泡巨噬细胞对LPS刺激表现出不良的反应和有限合伙人/ ATP co-stimulation,导致假设地和NLRP3 inflammasome途径提供。特别是,我们观察到没有NLRP3-specific诱导细胞内或在肺泡巨噬细胞分泌IL-1βIPF的文化,而地震的感应显著低于IPF相对于RA-UIP和控制。gydF4y2Ba
我们的观察与累积证据表明协议先天免疫反应是IPF患者受损,包括巨噬细胞的功能能力杀死细菌(gydF4y2Ba29日gydF4y2Ba]。此外,我们组和其他人的最近的数据显示,病毒是IPF的发生和发展的主要辅助因子(gydF4y2Ba13gydF4y2Ba,gydF4y2Ba30.gydF4y2Ba,gydF4y2Ba31日gydF4y2Ba]。我们目前的研究结果表明,放松管制的inflammasome激活纤维化的患者可能在疾病的发展是至关重要的,特别是对发生的急性发作。gydF4y2Ba
inflammasome活动的减少引发的可能机制可能受损的自噬,干扰线粒体营业额,刺激NLRP3激活和诱发IL-1β通过mitochondria-generated分泌过多活性氧(gydF4y2Ba32gydF4y2Ba,gydF4y2Ba33gydF4y2Ba]。自噬和mitophagy缺陷在IPF肺gydF4y2Ba34gydF4y2Ba- - - - - -gydF4y2Ba36gydF4y2Ba),建议一个可能的解释的疲惫inflammasome机械在肺纤维化。gydF4y2Ba
免疫机制已经与IPF (gydF4y2Ba37gydF4y2Ba),也是中央风湿性肺病的发展。然而,自身免疫在IPF进行解释时需要特别谨慎,因为它可以提供一个未来可能的治疗目标。最近,一个潜在的有益的影响利妥昔单抗在间质性肺病与结缔组织疾病有关gydF4y2Ba38gydF4y2Ba)已被高亮显示。我们的研究提供了进一步的证据与IPF先天免疫协会;然而,这种效果更加突出,正如所料,在风湿性肺病。这一发现是在协议与新兴的分子数据连接免疫分子如CD28和IPF(贫穷的结果gydF4y2Ba39gydF4y2Ba]。作为inflammasome起着核心作用的主机防御各种传染病和非传染性的代理,这一发现进一步支持先天免疫反应的调节异常的IPF患者与IPF的发病机制,特别是这些患者无法解决肺部感染与急性加重(gydF4y2Ba20.gydF4y2Ba]。gydF4y2Ba
炎症的重要性在肺纤维化的发生和发展已经建立(gydF4y2Ba40gydF4y2Ba),虽然最初的促炎场景inflammasome激活可迅速进步的纤维化。我们的研究结果揭示了重大失误NLRP3 inflammasome激活在IPF的肺泡巨噬细胞,同时表明自身免疫性肝纤维化激活NLRP3受损,而健康的巨噬细胞。我们假定,肺外在刺激激活NLRP3 inflammasome IPF影响巨噬细胞施加低于RA-UIP巨噬细胞,尽管在建立etiopathological进一步的研究是必要的联系NLRP3 inflammasome流程和IPF。因此必须探索所有可能的病理和治疗影响的inflammasomes肺纤维化。gydF4y2Ba
脚注gydF4y2Ba
可以从本文的补充材料gydF4y2Bawww.qdcxjkg.comgydF4y2Ba
支持声明:这个项目是由胸希腊社会给予支持。为这篇文章一直存放在资助信息gydF4y2BaFundRefgydF4y2Ba。gydF4y2Ba
利益冲突:没有宣布。gydF4y2Ba
- 收到了gydF4y2Ba2015年4月9日。gydF4y2Ba
- 接受gydF4y2Ba2015年的11月9日。gydF4y2Ba
- 版权©2016人队gydF4y2Ba
引用gydF4y2Ba
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