文摘
哮喘是一种气道的慢性炎性疾病,细菌可能充当主角的慢性炎症。对气道炎症的关系的存在特定的细菌类群。我们试图描述痰微生物在成人哮喘控制不佳。
DNA提取诱导痰和微生物群落是异形使用16 s rRNA焦磷酸测序。细菌种类特点,微生物种群之间的关系,哮喘炎症亚型和共探讨。实时PCR用于识别Tropheryma whipplei和流感嗜血杆菌在痰。
成人患者中性粒细胞哮喘降低了细菌多样性和物种丰富度。Tropheryma是识别和实时PCR证实12例(40%)的参与者。嗜血杆菌最常发生在一群年轻的雄性特异反应性与中性粒细胞比例增加。PCR证实了的存在流感嗜血杆菌35(76%)参与者与哮喘控制不佳。
有phenotype-specific改变在哮喘气道微生物。减少细菌多样性结合盛行的流感嗜血杆菌在中性粒细胞哮喘,而嗜酸性哮喘有丰富吗t . whipplei。
文摘
有phenotype-specific改变在哮喘气道微生物调节炎症http://ow.ly/UbB9k
介绍
哮喘是一种慢性异构气道发炎的疾病包括嗜酸性和noneosinophilic炎性表型。驾驶noneosinophilic气道炎症的机制,尤其是中性粒细胞炎症是知之甚少。
越来越多的证据支持在殖民细菌保持炎症条件下航空公司(1,2]。中性粒细胞哮喘气道炎症反应表明细菌激活显著调节toll样受体2表达和增加白介素(IL) 8和1β水平相比其他哮喘炎症亚型(3]。中性支气管炎患者通常培养阳性流感嗜血杆菌(1,2]。这些数据表明存在的潜在作用降低气道细菌,尤其是流感嗜血杆菌在中性粒细胞哮喘气道炎症的持续观察。
技术进步等文化无关微生物群落分析做一个详细的评估气道细菌群落可能(4]。可能会有一个改变在哮喘患者的气道,微生物细菌的门变形菌门(包括嗜血杆菌物种)在哮喘与健康对照组相比更为普遍4,5),特别是那些有corticosteroid-resistant哮喘(6]。这些变化的功能意义尚不清楚;然而,将细菌殖民化与一个典型的宿主炎性反应将提供有力的证据在哮喘气道失调的作用。对气道炎症之间的关系模式,是与特定的细菌类群。在目前的研究中,我们使用文化无关微生物群落分析描述患者下呼吸道微生物和没有哮喘。使用这些资料,我们探讨了居民微生物群落和气道炎性表型之间的关系。我们假定的中性粒细胞哮喘患者的特点是占主导地位的一种独特的微生物嗜血杆菌物种与嗜酸性和paucigranulocytic哮喘。
方法
参与者
30研究参与者(初始群体)与一个完整的微生物分析评估(16 s焦磷酸测序)从四个中心在澳大利亚(纽卡斯尔,新南威尔士州;珀斯,西澳大利亚;昆士兰州布里斯班和两个中心)。额外的16个成年人与中性粒细胞哮喘控制不好随后被包含在订单确认的存在流感嗜血杆菌使用实时PCR。
本研究是依法进行的修改赫尔辛基宣言。当地的机构审查委员会批准了这项协议(细节在网上补充材料)和书面知情同意是获得所有的病人。
哮喘诊断成立使用美国胸科学会指南基于当前的情景呼吸道症状,医生的诊断和变量气流阻塞的证据(7]。参与者与哮喘稳定但症状,尽管规定维护吸入激素(ICS)治疗哮喘控制问卷6 (ACQ6)评分> 0.7 (8]。参与者没有发作,感染或改变呼吸系统药物治疗前4周。排除标准和病人评估可以在网上找到辅料细节。不吸烟的健康对照组没有正常的肺功能和气道疾病的诊断。
设计
所有参与者出席了一次与预处理和post-bronchodilator肺量测定法和文档的哮喘症状,asthma-specific生活质量(9),药物的使用和吸烟状况评估,痰诱导。
DNA制备、16 s rRNA PCR,扩增子焦磷酸测序和实时PCR
细菌DNA制备样品的细节,测序,测序数据分析以及验证实时PCR方法的补充材料。
数据分析
临床数据分析使用占据11(美国占据,大学城,TX)使用标准方法中描述在线补充材料。
结果
临床、炎症和典型的文化形象
参与者与中性粒细胞哮喘略年轻和一般男性,具有类似肺功能、哮喘控制分数和哮喘症状与non-neutrophilic哮喘组相比(表1)。痰炎性细胞计数显示更多总细胞比例增加中性粒细胞和嗜酸性粒细胞比例减少,巨噬细胞和柱状上皮细胞相比non-neutrophilic哮喘组(表1)。
痰液微生物
与中性粒细胞哮喘痰样本参与者更多样,主要由少数物种(低丰富度和均匀度),而non-neutrophilic哮喘参与者多样化物种和他们更均匀分布在社区(丰富度和均匀度高)。这是由香农指数明显降低,丰富性和辛普森指数与中性成人哮喘(表2)。这种差异后保持校正年龄、性别,以前吸烟和ICS剂量(ANCOVA, p = 0.035)。
细菌的类群变形菌门和厚壁菌门(由链球菌物种)最常见,占> 90%的业务分类单元(辣子鸡)中性粒细胞哮喘组(表2和图1)。有显著降低的比例辣子鸡放线菌和厚壁菌门和更多变形菌门相比,那些中性non-neutrophilic哮喘(表2)。中性的丰富性和多样性降低哮喘组似乎是由一群四个参与者大量的序列嗜血杆菌很少有其他类群,如所示图1。没有差别的香农或辛普森指数根据研究网站,收集到的样本(在线补充表S1)。微生物群落的主要成员包括在内普氏菌,链球菌,奈瑟氏菌科和嗜血杆菌(图1)。
吸烟
16(53%)参与者过去吸烟;这组倾向于有更高的患病率序列的细菌类群放线菌和拟杆菌门,和患病率较低的细菌门与不吸烟者相比,变形菌门。细菌从门Fusobacteria过度吸烟者与不吸烟者相比更普遍。还有一个重要的海拔在香农和辛普森指数在过度吸烟者与不吸烟者相比,表明增加多样性这一组(表3)。
吸烟久与放线菌的患病率显著相关,(r = 0.420, p = 0.021),但不与任何其他的细菌类群。没有联系吸烟久香农或辛普森指数。
Tropheryma whipplei
七个(23%)被调查者序列对应的属Tropheryma(门放线菌)诱导痰。参与者Tropheryma序列有相似的年龄、肺功能、ACQ6得分,视觉模拟量表症状评分和痰液细胞微分为那些没有辣子鸡Tropheryma(表4)。在七个参与者Tropheryma被确认,有一个重大的负面关联TropherymaOTU和喘息的分数(枪兵r =−0.821, p = 0.023)(数据没有显示)。值得注意的是,五个参与者Tropheryma也有嗜酸性气道炎症。
利用PCR筛选Tropheryma whipplei12(40%)发现积极的参与者:六个参与者确定从原来的焦磷酸测序分析和一个额外的六个新发现的样本。这些数据证实了Tropheryma辣子鸡实际上是t . whipplei。
流感嗜血杆菌
图2显示了主成分分析(PCA)和确认Haemophilus2(OTU4)作为主导微生物组的哮喘的参与者。的临床和炎症特征的高频嗜血杆菌序列(嗜血杆菌高)然后更加仔细的检查。嗜血杆菌高的参与者通常是年轻男性过敏性,从未吸过烟的人,一般的中性粒细胞哮喘炎症亚型(表5)。使用一元线性回归中性粒细胞比例,检查其他可能的因素没有显著关联的年龄,吸烟久、性别或剂量ICS。的参与者嗜血杆菌高集团其他参与者痰中性粒细胞比例高于20% (p = 0.074)。
使用逻辑回归,我们要求的临床和炎症与参与者的相关结果嗜血杆菌高集团。年龄、性别和痰中性粒细胞比例中每个参与者的独立预测指标嗜血杆菌高集团使用单变量分析。吸烟久和剂量ICS并不相关嗜血杆菌高集团。
多元逻辑回归模型显示,包括年龄,性别和痰中性粒细胞比例预测包含在一起嗜血杆菌组高(p = 0.0004;R2= 0.599)。自己的三个变量预测包含在嗜血杆菌高集团;然而,这可能是一个权力的问题。
鉴于四丰度高的六个样品嗜血杆菌OTU4 PCA的中性粒细胞炎症亚型,我们试图丰富中性粒细胞哮喘参与者的数量和确定的物种嗜血杆菌确实是流感嗜血杆菌。我们进一步确定了16个参与者与中性粒细胞哮喘控制不好。实时PCR分析所有46名参与者进行(初始群30与中性粒细胞哮喘和额外的16)来识别流感嗜血杆菌。进一步的临床和炎症概要文件16参与者在线补充表所示S2。
24岁的30最初的参与者和11额外的16中性粒细胞哮喘受试者pcr阳性流感嗜血杆菌。的检出率流感嗜血杆菌不是那些不同的中性和non-neutrophilic哮喘(81%,75%,p = 0.453)。没有明显差异,年龄,性别,特异反应性、肺功能,ICS剂量或吸烟史pcr阳性或阴性的人之间流感嗜血杆菌(数据没有显示)。ACQ6得分显著高于在pcr阳性的人与那些PCR-negative相比,意味着±sdACQ6 1.9±1.1与1.1±0.9,p = 0.037。
讨论
在目前的研究中,成人哮喘降低了细菌多样性最低的多样性在中性粒细胞哮喘患者。优势类群被确定在特定炎性表型。我们确定了一群丰度高的成年男性嗜血杆菌序列以中性粒细胞为主的气道炎症。我们还发现了一组参与者与哮喘的人Tropheryma我们确认为序列t . whipplei。这些参与者通常表现出嗜酸性粒细胞哮喘亚型。
我们的数据显示在中性粒细胞减少细菌多样性哮喘。这是第一次考试的细菌多样性哮喘炎症亚型。据报道多样性已经增加(5,11)或类似的(6)在哮喘患者和健康对照组之间。类似的多样性的变化一直在报道慢性阻塞性肺病(COPD)患者中细菌多样性被报道为增加(12)或减少(13)与控制。的多数参与者ICS,我们不能确定是否使用ICS影响细菌的多样性。我们纠正的剂量ICS的多样性分析,发现辛普森和香农指数的差异ICS剂量校正后维护。
在成人和儿童哮喘的研究报告增加频率序列的门变形菌门(4- - - - - -6,14]。H独角仙et al。(1430),在他们的研究成年人患有严重哮喘,观察到恶化ACQ得分与大量的变形菌门和一个辅助17-related基因表达之间的联系(包括CXCL8及其受体)与变形菌门类群。我们扩展这个变形菌门分类单元的增加与中性粒细胞哮喘最突出的。我们也观察到显著减少辣子鸡从门壁厚菌门的细菌和放线菌在中性粒细胞哮喘。厌氧细菌门Fusobacteria也少在中性粒细胞哮喘,尽管不是统计不同。这个门已经与corticosteroid-resistant哮喘(15]这是自然和noneosinophilic表明没有常见的口腔厌氧菌哮喘亚型可能是一个重要区别。
目前,长期ICS使用细菌多样性的影响是未知的。早期研究表明,ICS使用可能会影响呼吸道微生物,导致集群独特的COPD患者服用ICS比那些没有服用ICS (12]。同样有一个独特的类群集群那些corticosteroid-resistant哮喘,包括属嗜血杆菌和Tropheryma(15]。在这项研究中,大多数的受试者服用高剂量ICS,我们还盛行的t . whipplei和流感嗜血杆菌控制不佳的哮喘。很少了解吸入药物在口腔菌群的影响。ICS可能促进口腔的不利影响;最常见的是较高的口头报告假丝酵母种检测(16粘膜损伤的),有证据表明在儿童哮喘17]。
本研究在其横截面性质是有限不可能区分因果关系。本研究的优势包括人口特征明显的研究结合详细的临床评估和评估气道炎症和气道微生物。诱导痰一直经常研究气道微生物(18- - - - - -20.]。我们试图减少口服污染通过选择低气道部分从唾液样本材料;然而,口语不能排除污染。其他研究表明,同时降低呼吸道样本含有丰富的口腔微生物群,有一个lung-specific信号,一些辣子鸡都不成比例地发现在支气管肺泡灌洗与口腔清洗相比,特别嗜血杆菌物种(21]。
我们确定了七位哮喘患者序列属于属Tropheryma(门放线菌)。唯一命名种的属,t . whipplei惠普尔氏病原因,肠胃失调的特点是关节炎、腹泻和体重减轻(22]。越来越多的证据支持的角色t . whipplei在呼吸道疾病识别在间质性肺病23)、肺炎(24,25和最近在corticosteroid-resistant哮喘6]。肺部症状可能会先于胃肠道症状,包括间歇性发热、干咳气短,这表明气道殖民或感染可能导致哮喘的症状和发作观察。我们的PCR进一步确认了五个参与者的证据t . whipplei,用PCR检测率为40%。Tropheryma也被报道在无症状的HIV感染(13%),特别是在肺而不是口(26),这是进一步的证据,我们的鉴定Tropheryma在诱导痰液样本可能起源于降低气道。的参与者Tropheryma倾向于采取高剂量ICS;然而,这并不是统计不同。而与纵向后续需要进一步的研究来确定这组病人会发展惠普尔氏病,识别Tropheryma显示未知微生物可能出现在航空公司,有可能导致哮喘症状和气道炎症。
流感嗜血杆菌是最常见的物种从门变形菌门导致呼吸道感染,并与成人和儿童哮喘的航空公司(1,27,28]。在中性粒细胞哮喘,有高的发病率流感嗜血杆菌确定使用传统文化的方法,相对于其他炎性表型(2]。在这项研究中,我们观察到一群成年人患有哮喘的优势嗜血杆菌辣子鸡年轻,过敏性,不吸烟的男性倾向于有更高比例的中性粒细胞。因为焦磷酸测序方法的敏感性不允许精确的物种,我们进行了实时PCR使用特定的调查,发现80%的参与者与哮喘控制不佳是积极的流感嗜血杆菌。虽然PCR不区分死和活有机体的存在,重要的是要认识到,即使是死亡或退化的细菌可以引起免疫反应,如。细菌内毒素能引起显著的炎症和免疫的信号。我们曾描述了高水平的痰中性粒细胞哮喘患者内毒素,在同一集团积极文化的高发病率流感嗜血杆菌(2]。
总之,我们已经能够连接不同的气道细菌改变宿主炎性反应的哮喘。有phenotype-specific改变在哮喘气道微生物。减少细菌多样性结合盛行的流感嗜血杆菌在中性粒细胞哮喘,而嗜酸性哮喘有丰富吗t . whipplei。这些变化可能调整当地的气道炎症和免疫反应。理解这些事件之间的关系将有助于更具体的治疗策略的发展。
确认
我们希望承认使研究小组收集和处理痰液样本,布里吉特和梅林达Tooze Ridewood(纽卡斯尔大学,卡拉汉,澳大利亚)进行了PCR证实。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:本研究支持的一个项目资助(569246)从NHMRC澳大利亚。为这篇文章一直存放在资助信息FundRef。
利益冲突:披露可以找到与本文的在线版本www.qdcxjkg.com
- 收到了2015年3月12日。
- 接受2015年10月27日。
- 版权©2016人队