简介

慢性阻塞性肺疾病(COPD)，一种以不可逆气流限制为特征的慢性炎症性肺疾病，目前是美国第三大死亡原因。在工业化国家，吸烟是慢性阻塞性肺病的主要原因，但在大量接触烟草的成年人中，只有大约20%发展为临床显著的慢性阻塞性肺病。一些晚期COPD患者容易加重，其特征是呼吸困难、喘息、咳嗽和痰液产生加重[1]．因此，COPD在疾病易感性和进展方面仍然是一种异质性疾病。COPD的发病机制可能涉及许多尚未描述的炎症介质，其中细菌感染或定植可能发挥作用[２]．

传统的微生物培养技术已经证明，大约50%的COPD加重与病原体有关，如链球菌引起的肺炎，流感嗜血杆菌,而且莫拉克斯氏菌属复活．在急性加重期，这些微生物经常在COPD患者的气道中发现[3]．术语肺微生物组已被用来描述居住在肺部的生物群落。由于许多这些细菌持续存在于COPD患者的气道中，它们的存在可能促进慢性炎症状态，从而驱动COPD发病机制。

在过去，微生物组的研究依赖于培养系统。使用16S rRNA焦磷酸测序描述微生物组的新技术使我们能够对人类微生物组进行分类和描述，而不存在微生物培养技术固有的偏见[4]- - - - - -［6］．Charlsonet al。证实了健康志愿者支气管肺泡灌洗液(BALF)中存在16S rDNA序列。作者指出，每个受试者的口咽和肺部微生物组之间存在显著相关性，但在受试者之间没有发现一致的肺部特异性微生物组。作者得出结论，正常的肺部微生物群由通过微吸或支气管镜携带进入下呼吸道的微生物组成[7]．

对微生物组的准确描述使我们能够研究微生物组与宿主免疫系统之间的相互作用。儿童早期的微生物群可能在哮喘的发展中发挥作用[8]而微生物组的特定成分与成年期的慢性哮喘有关[9]．正如哮喘发病机制的“卫生假说”所描述的那样，暴露于正常的共生微生物组可能会促进免疫耐受，这对于正常的免疫系统成熟和炎症控制是必要的[10]．类似的过程可能在其他肺部疾病的发病机制中起作用，涉及微生物组、免疫耐受和感染之间的相互作用。例如，Herbstet al。是否证明正常的小鼠微生物组对正常的成熟、招募和控制过敏性气道炎症是必要的[11]而一野et al。表明老鼠的微生物组有助于调节免疫功能，以应对甲型流感病毒感染[12]．

健康吸烟者和慢性阻塞性肺病患者的肺部微生物群已被描述和审查[２]，[13]．黄et al。显示需要呼吸机支持和广谱抗生素的COPD加重患者保持了不同的肺部微生物群[14]．Erb-Downwardet al。2例中度或重度COPD患者的微生物群落的细菌多样性评分低于健康吸烟者和健康非吸烟者。他们描述了核心COPD肺部微生物组，包括假单胞菌、链球菌、普雷沃氏菌、梭杆菌、嗜血杆菌、细孔菌、而且Porphyromonas．此外，在移植时对极重度COPD患者的肺部微生物群落进行了密集采样。他们注意到相邻肺部位的微生物群存在显著差异，这是由细菌的主导作用引起的假单胞菌、嗜血杆菌,Stenotrophomonas在每个样本中[15]．苏等．评价8例极重度COPD患者肺移植时肺组织微生物群。他们注意到，与对照组相比，COPD患者的细菌多样性增加了。COPD患者厚壁菌门数量增加，原因是乳酸菌[16]．

我们假设COPD肺微生物组的改变和/或其与宿主免疫系统的相互作用可能导致免疫耐受紊乱和炎症状态的发展，从而加速COPD的进展。我们进行了这项研究，以评估大量中度或重度COPD患者的肺部微生物群落，并将其与对照组患者的微生物群落进行比较。我们选择使用近期没有加重的COPD患者，以确定在疾病进展期间微生物组是否变得更加多样化，并限制类固醇和抗生素改变微生物组的影响。

结果

来自3组的32个样本(10个对照组，14个中度COPD样本，8个重度COPD样本)进行454次焦磷酸测序。得到超过46万条序列，每个样本经过修剪和质量控制滤波后平均14,451条序列(表1)．在97%同一性下观察到的操作分类单位(OTUs)数量在3-119之间。从对照组和COPD组获得的序列数量有统计学上的差异p-value为0.0326。用Bonferroni方法求事后我们发现，与中度COPD组相比，严重COPD组的序列数量较少。各组间每个样本获得的OTUs数量无差异(p= 0.36)。Shannon和Simpson (1-D)多样性指数显示，重度COPD组多样性最高，其次为中度COPD组;对照组的差异最小。这些多样性指数的差异在对照组和COPD组之间有显著性差异(Shannonp= 0.0082，辛普森pKruskal Wallace检验= 0.0167)事后使用Bonferroni方法进行比较时，我们发现这些差异是由控制组和重度COPD组之间的差异引起的(对于Simpson指数，控制组和重度COPD组之间的差异刚刚超过临界值)。然而，当我们在统计上控制年龄的影响时，我们发现各组之间没有显著差异(香农指数)p -控制性和中度COPD患者和控制性和重度COPD患者的数值为p= 0.49和p= 0.73，而p -辛普森指数的值为p= 0.30和p= 0.89)，但年龄与多样性相关(p香农指数= 0.0163p辛普森指数= 0.0062)。中度COPD患者年龄大于重度COPD患者(pWilcoxon检验= 0.0241)。

计算了所有样本的稀疏曲线，结果显示，除了极少数例外，额外的采样不会提供额外的OTUs (图S1)．一个维恩图被创建来说明每组之间的相似性(图S2)．每个研究对象组的所有序列进行合并，对照组观察到285个OTUs，中度COPD组观察到412个OTUs，重度COPD组观察到253个OTUs。重度COPD组和中度COPD组之间有显著的重叠，两者的OTUs分别为56%和34%。相比之下，控制组和中度COPD组之间仅共享17%的OTUs，控制组和严重COPD组之间仅共享23%的OTUs。在所有3组中，只有6.3%的OTUs是相同的。

序列提交给RDP分类器进行分类鉴定，自举截止值为50%。每种样品的门级分类载于图1．所有样本中最常见的门是放线菌门，其次是厚壁菌门、变形菌门、硝化螺旋门和拟杆菌门。大多数对照样品含有放线菌门、厚壁菌门和变形菌门的混合物。两个样本(对照4和对照7)的多样性指数较低，OTUs数量适中，出人意料地分别以Deinococcus-Thermus门和Nitrospira门为主。对应属耐放射而且硝化螺菌属已从许多环境地点中分离出来，但尚未从人类中分离出来。中度COPD组以放线菌门和变形菌门为主。2个样品(Moderate 43和184)多样性指数较低，以变形菌门为主。重度COPD组以放线菌门和厚壁菌门为主。其中一个样本(Severe 166)多样性指数较低，以厚壁菌门为主。与中度COPD样本相比，重度COPD样本含有更多的厚壁菌门，较少的放线菌门和变形菌门;然而，统计分析并没有显示出显著的相关性。

为了评估样本之间的相似性，使用Fast UniFrac进行主坐标分析(PCoA)。该分析揭示了对照和COPD样本的聚类。未观察到中度COPD和重度COPD样本之间的区别(图2一个)．我们确定了7个COPD样本，这些样本与对照样本聚类最明显，并将它们标记为“左下象限”样本(LLQ，圈出)。这7个样本几乎平均分为中度和重度样本，包括COPD 55、73、85、93、138、146和153。

利用这些受试者的临床信息，我们还根据其他临床参数对数据进行了聚类分析。我们特别感兴趣的是烟草暴露或免疫抑制药物(如类固醇)对肺部微生物群的潜在影响。所有COPD受试者在支气管镜检查前至少6个月不吸烟，但我们的对照组有4名吸烟者。PCoA在支气管镜检查时活跃吸烟的4名对照组受试者中未显示出任何聚类(图2 b)．然后，我们将注意力转向使用类固醇对微生物群的潜在影响。COPD患者在支气管镜检查前2个月内均未使用过全身类固醇。然而，22例COPD患者中有14例使用吸入性皮质类固醇(ICS)，而对照组没有使用ICS或全身类固醇。PCoA演示了ICS用户的聚类(图2 c)．我们还对其他肺部药物的影响感兴趣，包括吸入支气管扩张剂(IBD)。在16例使用IBD的COPD患者中，14例同时使用ICS。PCoA确实证明了IBD用户的聚类(图2 d)，但考虑到ICS-和ibd使用人群之间的高度重叠，我们无法确定是哪种药物导致了这种关联。我们还分析了基于年龄、性别、肺气肿肺组织百分比(基于CT扫描确定)和茶碱使用的PCoA数据进行聚类。没有观察到基于这些临床参数的聚类(图S3A- d)。

为了确定PCoA分析中观察到的负责聚类的分类群，我们使用Metastats检测样本之间的差异丰度特征。我们比较了COPD与对照样本、ICS使用者与非使用者、IBD使用者与非使用者，以及左下象限的样本(LLQ，圈内)图2一个) vs.所有其他(表2)．在每次比较中，分别在每个分类水平上进行分析。为了将错误发现率控制在10%，我们只报告了q值<0.10的分类群p-values小于0.05)。我们的讨论主要集中在我们的4个分析中的3个或更多的差异丰度的生物体，以及在多个相应的分类水平上差异丰度的生物体。

在门一级，注意到若干变化。厌氧革兰氏阴性梭杆菌门在COPD样本中增加，这种增加反映在所有分类水平上，直至属纤毛菌属而且梭菌属在口腔菌群中发现了两种细菌[17]．在IBD/ICS和COPD分析中，候选门SR1和TM7及其相关属分别增加。

在类级别，注意到两个变化。Epsilonproteobacteria在COPD分析中增加，并扩展到属弯曲杆菌．虽然通常被认为是胃肠道病原体，肺部感染已报道由于吸入食物[18]．弯曲杆菌最近在香烟的宏基因组中也发现了吗[19]．LLQ分析中，类协同性和阶协同性增加。这些分类单元包含该属Jonquetella,一种与牙周病和伤口感染有关的革兰氏阴性厌氧菌[20]．

在订单级别，注意到多个更改。在COPD和LLQ分析中，革兰氏阳性放线菌门的成员科里氏菌(coribacterales)增加。这种增加延伸到属水平:Atopobium,阴道共生菌，口腔菌群的一员[21]而且Cryptobacterium,牙脓肿的原因[22]．革兰氏阳性门厚壁菌门中有两个目差异丰富。乳酸菌在COPD和LLQ分析中增加，并且这种增加扩展到属链球菌而且Abiotrophia口腔菌群中的知名成员。在COPD分析中，丹毒三hales也增加。这种增加也反映在包括属在内的多个分类水平上Bulleidia（Solobacterium)，这是一种与牙周病和牙脓肿有关的有机体[23]．Aeromonadales是革兰氏阴性类γ -变形杆菌的一个目，在COPD、ICS、IBD和严重(相对于中度)COPD分析中增加。这种增加延伸到属气单胞菌属它存在于淡水和半咸水中，会导致腹泻和伤口感染，尤其是对免疫功能低下的患者[24]．在COPD、ICS、IBD和重度(相对于中度)COPD分析中，革兰氏阴性德尔塔变形菌门中的脱硫菌目增加。这种增加延伸到属Desulfobulbus这与牙周炎有关[25]．

来自4个不同门的另外8个属在我们的4个分析中至少3个具有差异丰度。在放线菌门，我们注意到减少Humicoccus增加了Nocardioides这两种物质都在环境样本中被发现。在厚壁菌门中，我们注意到高温放线菌属这是过敏性肺炎的潜在病因[26]，[27]．在变形菌门中，我们看到Balneimonas(在环境中发现)，以及Kingella,口腔菌群的一种，也是菌血症和心内膜炎的原因之一[26]，[27]．枸橼酸杆菌属这是一种胃肠道病原体。在厌氧门拟杆菌门中，我们注意到胃肠道病原体的增加Dysgonomonas[28]而且Phocaeicola,脑脓肿的原因[29]．

我们还对中度和重度COPD样本进行了转移瘤分析(补充表1)．该分析确定了9个差异丰度属，其中3个在对照和COPD样本的转移瘤分析中也被确定为差异丰度。

讨论

本文对22例中度或重度COPD患者与10例对照组患者的肺微生物组进行了分析。这是迄今为止发表的对COPD微生物组的最大分析，也是唯一主要包括中度或重度疾病的流动患者的分析。我们的结果表明，COPD受试者的微生物多样性水平较高，但这是由中度和重度COPD组之间的年龄差异所驱动的。这与erb -向下的研究结果相反et al。[15]在早期对COPD微生物组的研究中，他们发现中度和重度COPD患者的细菌多样性很少。我们注意到，尽管每个样本获得了超过5000个序列，并且稀疏曲线表明对微生物组进行了彻底的采样，但我们每个组中都有一些患者表现出非常低的多样性评分。似乎有少数COPD患者和对照组表现出较低的微生物多样性，这些样本可能会歪曲小样本量的研究结果。我们的结果与Sze一致等他的研究表明，极重度COPD患者的微生物多样性高于对照组[16]．我们的数据显示，与微生物多样性增加相关的是年龄，而不是COPD的严重程度。该分析排除了与COPD患者年龄不匹配的对照组患者。在我们的研究中，中度COPD患者比重度COPD患者大约年长7岁。目前尚不清楚患者年龄在多大程度上反映了COPD诊断后的年龄，因为我们的临床数据不包括受试者诊断时的年龄。

我们的数据与Charlson最初提出的假设一致et al。[7]这表明肺部微生物组似乎反映了口腔菌群的微吸入。我们注意到对照组和COPD样本类群之间存在显著重叠，尽管我们的PCoA能够分别聚类对照组和COPD样本，但不能分别聚类中度和重度COPD样本。对可能导致肺部微生物组改变的临床因素的详细分析表明，吸入性皮质类固醇或吸入性支气管扩张剂的使用可能是我们观察到的一些聚类的原因。类固醇暴露的免疫调节作用可能抑制了对肺部微生物组的免疫反应。这可能会导致肺部微生物群的持续或扩张。我们没有观察到基于烟草暴露的聚类，尽管我们的研究受到了相对较少的受试者的阻碍，他们在进行支气管镜检查时积极吸烟，平均烟草暴露为17.5包年。根据我们的数据，微生物群似乎并没有因为烟草暴露而发生显著变化。需要进一步对吸烟者发生COPD前后的微生物组进行纵向研究，以解决烟草暴露是否会改变微生物组，从而使吸烟者易于发生COPD的问题。

本研究的一个潜在弱点是鼻或口腔支气管镜的污染，因此BALF样本可能导致了观察结果。Charlson广泛地讨论了这个问题et al。[7]他们注意到BALF中的细菌来自上呼吸道细菌，可能是通过采样过程中微量吸入和支气管镜携带的结合。确定结转和微吸对肺微生物组组成的相对贡献将需要肺组织微生物组测定，如Sze所做的et al。[16]．不幸的是，这种技术仅限于接受肺移植或肺叶切除术的患者，这通常不用于相对稳定的COPD患者。

我们检测到COPD、吸入性皮质类固醇、吸入性支气管扩张剂和“LLQ”微生物群中存在差异丰富的多个类群。我们的发现强化了口腔菌群的微吸入是肺部微生物群的来源这一观点。我们发现了几种常见或罕见的肺部病原体(罗氏菌，滋养菌，放线菌，链球菌，消化性链球菌，沙雷菌，嗜碳细胞菌)，以及引起菌血症或心内膜炎的已知原因(罗氏菌，滋养菌，链球菌，消化性链球菌，纤毛菌，金氏菌，dysgononomonas)在我们的分析中确定的生物体中。还观察到几种厌氧菌，包括梭杆菌门、拟杆菌门和属的成员梭状芽胞杆菌属于厚壁菌门。虽然这在假定的肺需氧环境中是一个令人惊讶的发现，但这些厌氧菌可能会以类似于受囊性纤维化影响的肺的方式持续存在于COPD肺的异常微环境中。

虽然其他作者描述了“核心”肺微生物组，但我们不愿以这种方式解释我们的数据。我们的对照组和COPD样本都包括“异常值”样本，它们的多样性指数非常低，尽管进行了稳健的测序，但很少发现OTUs。来自健康对照组的数据表明，与其他受试者的肺部微生物组相比，肺部微生物组的组成与同一受试者的口腔微生物组更相似[7]．我们的数据不支持存在一个在多个受试者中稳定的“核心”微生物组，我们认为口腔微生物组严重影响肺部微生物组含量。

两个Erb-Downwardet al。和苏et al。[16]发表了非常严重COPD患者肺移植时的COPD微生物组。肺移植患者可能经历频繁的COPD加重，需要频繁的全身类固醇和/或广谱抗生素。由于长期肺部疾病，他们也可能有非常异常的肺解剖。他们异常的解剖结构和可能改变微生物群的药物使用，使得这些结果很难推断到不太严重的COPD患者。我们的研究首次描述了一大组COPD患者的微生物群，这些患者的病情相对稳定，在过去2个月内没有使用系统性类固醇或抗生素。他们代表了研究微生物组、免疫系统和COPD发病机制之间相互作用的最佳环境，因为他们的疾病仍在进化中。

我们的结果以及其他关于肺部微生物组的研究表明，口腔菌群的微吸入可能是肺部微生物组的来源。慢性阻塞性肺病微生物组中的多种细菌也在龋齿、牙脓肿或牙周病中发现。流行病学研究表明，口腔健康状况不佳与COPD进展之间存在关联。良好的口腔健康和定期的专业口腔清洁改善了患者的呼吸状况，特别是那些生活在养老院的患者。最近的一项荟萃分析表明，牙周病可能与慢性阻塞性肺病有关[30]．由于吸入药物的很大一部分滞留在口腔内，它们还可能干扰口腔生理和口腔微生物群。长期使用ibd会增加龋齿和胃食管反流，而使用ICSs会增加牙龈炎和口腔鹅口疮[31]．正在进行的关于口腔健康对COPD疾病进展和恶化的影响的研究可能会进一步加深我们对口腔微生物组、肺部微生物组和COPD进展之间相互作用的理解。

方法

支持信息

致谢

我们感谢Klaudyna Borewicz在主要坐标分析方面的协助。我们感谢明尼苏达大学生物医学基因组学中心和伊利诺伊大学香槟分校W. M. Keck中心在测序方面的帮助，以及明尼苏达超级计算研究所的技术支持。我们感谢John Connett博士和Robert Wise医学博士，以及FORTE研究提供的样本和临床数据。