文摘
减少股四头肌耐力在慢性阻塞性肺疾病(COPD)与II型糖酵解纤维的优势在I型氧化纤维(纤维转移)和减少肌肉能量存储。负责这个的分子机制仍然不明。我们提出的表情知道监管机构I型纤维和能源生产的股四头肌肌肉会在慢性阻塞性肺病患者不同,没有纤维转变。
我们测量肺功能、身体活动、运动性能、股四头肌力量和耐力(nonvolitionally) 38全球倡议对慢性阻塞性肺疾病阶段I-IV COPD患者和23个健康的年龄组。参与者接受了股四头肌活检:I型和II型纤维比例确定使用免疫组织化学和纤维转变定义使用出版的参考范围。钙调磷酸酶,AMP激酶的磷酸化(phospho-AMPK) -α,蛋白激酶A-α催化亚基、钙调磷酸酶活性和钙调蛋白的调节器,14-3-3蛋白被西方墨点法测量,myocyte-enriched calcineurin-interacting蛋白1 mRNA衡量定量PCR。下游,核肌细胞增强因子2的DNA结合转录因子量化了ELISA。
意外,钙调磷酸酶的表达,而phospho-AMPK较低,在慢性阻塞性肺病患者纤维转移相比,慢性阻塞性肺病患者没有纤维转变。Phospho-AMPK水平与股四头肌耐力的病人。
减少phospho-AMPK可能有助于减少股四头肌氧化能力和耐力在慢性阻塞性肺病。
减少股四头肌耐力与运动限制在慢性阻塞性肺疾病(COPD) (1]。潜在损失的耐力是I型肌凝蛋白的减少和氧化酶(2),减少氧化类型的特点我糖酵解II型纤维比观察到在慢性阻塞性肺病患者的股四头肌,我们将将在本研究中称为纤维的存在转移(3]。I型纤维完全依赖氧化代谢产生ATP,类型IIx纤维依赖糖酵解和IIa纤维利用氧化和糖酵解代谢(4]。自氧化代谢生成ATP几次超过每分子的葡萄糖(糖酵解5)、I型纤维含量与II型纤维。慢性阻塞性肺病患者,减少氧化纤维,减少肌肉能量存储和展览从ATP耗竭静止代谢压力和较低的工作负载,与控制。能减少营业额可能加剧了减少胰岛素敏感性在慢性阻塞性肺病6];开车胰岛素细胞葡萄糖摄取通过GLUT-4受体(7]。这些变化可能导致理解机制治疗改善COPD患者的运动能力。
通路影响肌肉I型纤维分化在开发期间,肌肉氧化酶和能源生产/葡萄糖吸收动物模型中描述(图1)[8]。钙调磷酸酶是一种磷酸酶激活我fibre-specific基因表达类型在体外阻塞时,可以产生I型II型纤维转移的动物,例如[9]。钙调磷酸酶是激活钙与钙调蛋白在肌肉活动,和抑制了内源性蛋白抑制剂,特别是myocyte-enriched calcineurin-interacting蛋白1 (MCIP1) [10]。钙调磷酸酶刺激目标包括肌细胞增强因子(MEF) 2和核转录因子的激活t细胞(NFAT)转录因子。MEF2D和NFATc1激活I型纤维基因表达(11]。14-3-3蛋白影响钙调磷酸酶信号通过绑定MCIP1 [12),释放出钙调磷酸酶的抑制活动,通过抑制NFAT [13]。此外,钙调磷酸酶促进细胞葡萄糖摄取通过GLUT-4受体(9]。
腺苷酸激酶(AMPK)激活基因增强肌肉氧化代谢增加运动耐力的动物(14,诱发肌肉葡萄糖吸收通过通过MEF2-dependent GLUT-4受体转录机制(15]。它由磷酸化激活条件下代谢压力包括锻炼。蛋白激酶A (PKA)是一种酶,动员葡萄糖(如。由肝糖分解为肌肉提供ATP在运动(16]。
这是第一个研究调查钙调磷酸酶的表达,phospho-AMPK PKA, MEF2 DNA结合的股四头肌肌肉慢性阻塞性肺病患者和健康对照组。调查三个酶的基本原理是:1)他们都是对肌肉活动是减少慢性阻塞性肺病(17];2)影响肌肉能量生产和/或I型纤维规范;3)钙调磷酸酶和AMPK激活MEF2。我们提出,钙调磷酸酶和MEF2表达式将会减少,但是phospho-AMPK和PKA表达会增加代谢压力,在慢性阻塞性肺病患者的股四头肌肌肉纤维转移患者相比无纤维转变。
方法
伦理批准
伦理批准收到了来自皇家主管布朗普顿和Harefield NHS信托(06 / Q0404/35)地铁站和伊灵西伦敦心理健康信托伦理委员会(06 / Q0410/54)。病人给书面知情同意。
参与者
38例慢性阻塞性肺病患者招募从诊所皇家主管布朗普顿医院地铁站,伦敦,英国。23名健康对照组被广告招募。排除标准:诊断心脏、肾或肝功能衰竭;系统性炎症、代谢或神经肌肉疾病(独立与骨骼肌异常);华法林治疗出血风险从活组织检查);或中度/重度恶化(即。前4周内需要干预)。这些参与者已经使用以前的标本18,19]。
生理测量
Post-bronchodilator肺量测定法,肺容积(体积描记法)和扩散能力测量根据欧洲呼吸学会/美国胸科学会(ATS)指南188bet官网地址20.- - - - - -22],arterialised毛细管耳垂血气记录的紧张关系。无脂质量指数(FFMI)计算了生物电阻抗测量(Bodystat 1500;Bodystat,道格拉斯,使用针对疾病的回归方程(英国)23]。身体活动测量/ 12 h 2天(Dynaport加速度计;mc - rorberts,海牙,荷兰)对慢性阻塞性肺病(验证24]。股四头肌力量是评估仰卧的等距最大随意收缩(25]。股四头肌耐力是评估时机力下降到80%的最初反应在火车磁股神经刺激(如前所述2]。6分钟步行试验的测试(运动性能评估26)和symptom-limited增量循环肌力测试最大摄氧量的测定(27]。
股四头肌抽样
经皮活检的股外侧肌进行了使用B的技术ergstrom(28受试者休息20分钟后,一天没有艰苦的体力活动。组织学和信使rna /蛋白质分析样品在融化的异戊烷和液态氮冷冻,之前分别存储在-80°C(在线补充材料)。
测量股四头肌的纤维类型比例和纤维横截面积
免疫组织化学使用抗体类型我和花絮肌凝蛋白和层粘连蛋白进行横向计算I型,肌肉部分花絮(纯花絮和混合花絮/ IIx纤维,不能有区别),IIx I /花絮和混合纤维比例和平均截面积(CSA)每个纤维类型,从≥100纤维(在线补充材料)29日]。纤维转变是由I型纤维比例低于和/或类型IIx纤维比例下降高于截止取自健康60 - 70岁(3]。
测量的钙调磷酸酶,phospho-AMPK-α,PKA-α单元、钙调蛋白和14-3-3蛋白质
西方墨点法进行了20 - 50μg蛋白质来自38个患者和23控制(34患者和19控制钙调磷酸酶,24患者和23 phospho-AMPK控制)和免疫印迹结果正常化的α-tubulin(在线补充材料)。表达式的子单元钙调磷酸酶催化地活跃,phospho-AMPK-α和主要肌肉同种型PKA-α量化。
测量MEF2肌核提取物结合DNA的能力
MEF2(所有子类)dna结合使用转录因子量化ELISA(美国Panomics,圣克拉拉,CA)一式两份/样本(在线补充材料)。数量是成正比的相对光单元发出荧光。
测量MCIP1和肌凝蛋白重链我信使rna
我MCIP1和肌凝蛋白重链基因(MyH7)是钙调磷酸酶的目标基因。MyH7记录显示当前转录支持I型纤维,而I型纤维比例反映了转录前几周;因此测量。信使rna定量PCR (q)是用SYBR绿色和正常化酸性核糖体磷蛋白质PO (30.)并使用geNormβ-2-microglobulin成绩单(在线补充材料)31日]。
统计数据
组态分布的差异,非正态分布和分类数据进行了t检验,Mann-Whitney u测验和确切概率法,分别。斯皮尔曼等级(ρ)相关性计算评估的相关性。≤0.05的小动物——一张长有假定值设置为定义统计学意义。
结果
慢性阻塞性肺病患者的特点相比,控制
年龄和性别之间没有显著不同的病人和控制。患者肺功能显著降低,arterialised氧气紧张局势,FFMI,股四头肌力量和耐力、身体活动和运动性能与控制(表1)。1(3%),9(23%)、14(37%)和14名(37%)患者有慢性阻塞性肺疾病的全球倡议阶段我,II, III和IV疾病,分别。作为一个群体,慢性阻塞性肺病患者显著降低I型和高IIa IIx纤维比例,和降低IIx纤维CSA型与控制相比,与以前的观测一致(表2)[3,32]。13例(34%)患者纤维转变。所有控制纤维比例在正常范围内。
慢性阻塞性肺病患者纤维转变的特点与慢性阻塞性肺病患者相比无纤维转变
患者纤维转移的转移系数明显降低肺的一氧化碳,但不是在1 s用力呼气量较低,相比之下,患者没有纤维转变。此外,患者纤维转变有一个贫穷的运动增量循环测力学性能和降低趋势6分钟步行距离比那些没有纤维转变,账户没有FFMI组差异和股四头肌力量。身体活动水平这些组之间没有显著差异(表1)。
所有患者纤维转变完成的标准纤维转移通过I型纤维比例较低,人口增加IIa没有IIx纤维类型比例超过正常范围。I型和II型纤维CSA患者没有差异,没有纤维转移(表2和图1),符合在FFMI组(没有区别表1)。
钙调磷酸酶和钙调磷酸酶的表达调节器,phospho-AMPK PKA COPD患者和控制
钙调磷酸酶在慢性阻塞性肺病患者的股四头肌表达高于控制,此外,纤维转移患者明显高于病人没有纤维转移(表3,无花果2和3)。然而,患者有显著降低MyH7比控制和记录有降低的趋势MyH7记录患者的纤维比没有转变。钙调蛋白的表达没有明显差异,14-3-3蛋白,或MCIP1信使rna。
Phospho-AMPK COPD病人和对照组之间没有明显不同,但平均高出三倍数量的COPD患者没有纤维转变与纤维转移(p = 0.005) (表3,无花果2 b和3 b)。
PKA-α的表达没有明显不同的COPD患者和控制,或患者和没有纤维之间转移(表3,无花果2摄氏度和3 c)。α-tubulin水平没有显著不同病人和对照组(54.9±17.4天文单位与48.2±20.7 AU, p = 0.21),确认报告,α-tubulin是一个有效的加载控制在慢性阻塞性肺病30.,33]。
介质之间的相关性,股四头肌氧化纤维比例和股四头肌耐力在慢性阻塞性肺病
钙调磷酸酶之间没有相关性和股四头肌I型纤维比例(ρ= -0.17,p = 0.33) (图4)或四头肌耐力(ρ= -0.05,p = 0.80)的病人或病人和控制相结合(ρ= -0.18,p = 0.21和ρ= -0.05,p = 0.75)。钙调磷酸酶活动的调节器,PKA和MEF2肌肉耐力和肌肉组织学或没有联系。然而,Phospho-AMPK强烈与股四头肌I型纤维比例(ρ= 0.54,p = 0.006) (图4 b)和股四头肌耐力(ρ= 0.47,p = 0.029) (图4摄氏度)的病人。
当病人和控制相结合,MEF2明显与股四头肌力量(ρ= 0.43,p < 0.0001), FFMI(ρ= 0.27,p = 0.033)和运动性能(6分钟步行距离ρ= 0.34,p = 0.008和峰值摄氧量周期肌力测试(ρ= 0.32,p = 0.012))(图E1)。
讨论
这是第一个研究调查潜在的分子机制降低股四头肌肌肉氧化纤维和能源存储导致肌肉耐力和运动表现不佳在慢性阻塞性肺病。我们证明了phospho-AMPK降低COPD患者的股四头肌肌肉纤维转移患者比没有纤维转变。此外,与患者股四头肌耐力水平相关。因此,减少肌肉AMPK表达可能有助于减少股四头肌耐力在慢性阻塞性肺病。意外,钙调磷酸酶表达在慢性阻塞性肺病患者增加纤维转移相比,病人没有纤维转变和健康对照组。尽管这种适应,下游核MEF2能够绑定到DNA和肌凝蛋白重链我转录是减少的病人相比,控制。
我们没有发现慢性阻塞性肺病患者纤维转移活性显著低于那些没有纤维转移(表1),这表明其他因素在推动纤维转变必须是重要的。纤维转移患者有更大程度的肺气肿,但不是大气流阻塞或休息时,低氧血,患者比没有纤维转变,虽然我们的数据不排除短暂缺氧,也许睡眠或运动诱导,刺激纤维转变。当然动物慢性缺氧可减少肌肉氧化纤维(34]。另外,肺气肿和纤维转变可以通过一个共同的发展机制,通过肌肉缺氧,不得有关联。
这些发现的意义
我们合并之前的数据突显肌肉氧化表型锻炼耐力的重要性在慢性阻塞性肺病35和健康36),证明患者纤维转变贫困运动性能比没有纤维转移的病人,独立的肌肉或股四头肌力量的差异(表1)。股四头肌在运动中疲劳已报道在COPD患者很大一部分,是谁不响应在运动中支气管扩张剂(1大概因为性能受到肌肉耐力而不是通气的限制。我们发现phospho-AMPK水平不仅与相关股四头肌I型纤维比例,但也与慢性阻塞性肺病患者的股四头肌耐力(图4),因此重要的是,增加这些级别使用药理剂如二甲双胍(37)或营养补充剂,如白藜芦醇(38),例如,可能会提高患者的运动性能纤维转变,在他肌肉疲劳可能会构成限制。
我们预期的一种自适应phospho-AMPK增加肌肉的病人,作为一个适当的代谢和氧化应激反应发生在慢性阻塞性肺病(39,40]。没有纤维转变,这是观察到病人phospho-AMPK水平会增加三倍与控制相比,但不是患者纤维转移(表3)。此外,我们曾表明,下游AMPK过氧物酶体proliferator-activated受体(PPAR) -δ,促进动物的I型纤维分化转录因子(41中表达下调,股四头肌在慢性阻塞性肺病42]。
矛盾的增加钙调磷酸酶表达在慢性阻塞性肺病患者,特别是那些与纤维转移(表3),有许多可能的解释。可能的结果反馈响应减少钙调磷酸酶活动,从减少肌肉活动8(虽然我们没有发现身体活动之间的关联和钙调磷酸酶)或抗钙调磷酸酶活动下游。这个发现增加的磷酸化AKT在慢性阻塞性肺病肌肉Doucet等。(30.]支持抗钙调磷酸酶活动,因为一种蛋白激酶被激活脱去磷酸磷酸酶(43]。或者,增加钙调磷酸酶的表达可能是代偿反应生成纤维转变由于破坏另一个信号通路。增强的表达式也可以应对肌肉萎缩的钙调磷酸酶是可能的,但是辩论,角色在骨骼肌再生和肥大44,45]。有趣的是,钙调磷酸酶可能有不同的效果取决于疾病背景:mdx杜氏肌萎缩症的小鼠模型,钙调磷酸酶激活有保护作用[46),而在肢带肌萎缩症模型钙调磷酸酶中断是有益的47]。钙调磷酸酶肌肉表型的影响显然是复杂和进一步的工作在病人肌肉可能表明下游信号是否增强这一途径可能是治疗慢性阻塞性肺病患者受益。
MEF2阳性基因表达调控的重要元素,并由PPAR-γco-activated co-activator 1-α当参与类型我fibre-specific基因表达(48]。虽然dna结合蛋白是转录活动的先决条件,额外的因素影响MEF2活动如sumoylation和乙酰化作用[49)(增加活动)和交互类II组蛋白去乙酰酶抑制剂,HDAC4和HDAC550),激活肌肉的活动,减少MEF2活动。我们以前所示增加HDAC4相比,慢性阻塞性肺病患者的股四头肌肌肉控制(18),这里MEF2 dna结合蛋白较低的病人比控制和股四头肌的力量,肌肉和运动性能(表3和图E1)。这些发现可能是患者的体力活动的结果低于控制;我们无法与这些团体活动以来减少体育活动固有的疾病,即使在发生轻微的慢性阻塞性肺病(17],我们不仅中度到严重的组织进行了研究。缺乏患者的差异和没有纤维转变,没有身体活动水平不同,表明任何信号干扰导致纤维转变发生的独立核MEF2能够结合DNA的减少。
稳定的慢性阻塞性肺病患者在休息,PKA表达式不是长期改变(表3)。然而,这并不排除PKA活性的差异或PKA转录/翻译修饰在运动过程中由于病人经验代谢压力大于控制(39]。
批判的方法
是常见的与人类工作,这项研究是描述性和观察;因果关系不能证实没有选择性操纵病人的每个信号的因素。我们也报告表达的各种酶和调节器,不活动,影响的因素除了表达,我们已经提到。我们试图衡量钙调磷酸酶活动使用磷酸酶测试套件(Promega Profluor工具包5日,麦迪逊,WI,美国),发现它不可能孤立钙调磷酸酶的影响从磷酸酶2 a和2 c,甚至利用抑制剂如冈田酸。据我们所知,人类骨骼肌钙调磷酸酶活动以前没有报道。
有限制大多数接受技术测量转录因子的活动。转录因子elisa和电泳迁移率改变分析一样,衡量转录因子转移到细胞核的数量在一个适当的配置和DNA结合亲和力,但不是绑定到DNA量在活的有机体内当时的活检。染色质免疫沉淀反应的技术,而不是以前在人类肌肉,可以量化转录因子与DNA在活的有机体内但仍然没有量化转录活性,这可能是由代数余子式的改变,等。
它可以认为患者钙调磷酸酶和phospho-AMPK水平之间的差异,没有纤维转变只是微分表达式的结果之间的I型和II型纤维。出现这样的情况,我们会发现显著差异在phospho-AMPK病人和控制,phospho-AMPK之间的相关性和钙调磷酸酶I型纤维比例控制,我们没有。此外,据我们所知,没有公布的数据纤维类型不同的钙调磷酸酶和AMPK蛋白表达在人类肌肉,虽然在人类骨骼肌,mRNA水平的抑制AMPK-γ亚基(51)高糖分解的纤维。
总之,phospho-AMPK减少稳定的慢性阻塞性肺病患者的股四头肌氧化糖酵解纤维类型转变,减少肌肉耐力和减少运动性能。因此,在慢性阻塞性肺病患者的骨骼肌纤维增加phospho-AMPK转变可能是一个可行的治疗方法。相反,钙调磷酸酶表达增加纤维转移患者股四头肌,我们建议是抗钙调磷酸酶信号的结果,在这种情况下,进一步增加表达可能不是一个合适的治疗策略。MEF2 dna结合患者没有出现分化,没有纤维转变,但与肌肉和力量有关,因此最好探索患者股四头肌浪费和弱点。
确认
我们要感谢温斯顿·班,在皇家统计部门主管布朗普顿医院地铁站(英国伦敦),他的帮助与统计分析,德里克·克莱默马克Unstead和肺功能部门在皇家主管布朗普顿医院,地铁站伦敦,进行肺功能测试,和凯萨琳Daenen马斯特里赫特大学医院cryosectioning(马斯特里赫特、荷兰)。
脚注
可以从本文的补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明
S.A. Natanek由Wellcome临床奖学金资助(批准号079686)。H.R. Gosker是由a荷兰哮喘基金会格兰特(批准号氟化钠3.4.05.038)。9沼泽是由一个奖项从葛兰素史克到帝国理工学院。含硝酸钠霍普金森是英格兰高等教育拨款委员会(HEFCE)临床高级讲师。这项研究是国家健康研究所内进行呼吸生物医学研究单位在皇家主管布朗普顿医院和地铁站(英国伦敦),帝国理工学院哪一部分基金M.I. Polkey的工资。
感兴趣的语句
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- 收到了2012年6月22日。
- 接受2012年8月24日。
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