抽象
吸烟有助于肺部慢性阻塞性肺疾病(COPD)重塑。作为这一改造的一部分,细支气管周围纤维化是COPD患者,有助于小气管观察气道阻塞。成纤维细胞至肌成纤维细胞转变为细支气管周纤维化形成中的关键步骤。
这个体外研究调查对支气管成纤维细胞至肌成纤维细胞转变香烟烟雾的效果,和阿地溴铵是否抑制这一过程。人支气管成纤维细胞用阿地溴铵孵育(10−9-10−7M)和暴露于香烟烟雾提取物。I型胶原蛋白和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达通过实时PCR和Western印迹法测量,如肌成纤维细胞的标记物。细胞内活性氧物种,环AMP(cAMP),细胞外信号调节激酶(ERK)1/2和胆碱乙酰转移酶测定作为细胞内信号传导介导物。
香烟烟雾诱导的I型胶原蛋白和α-SMA是由活性氧介导的,细胞内cAMP的消耗和ERK1 / 2的磷酸化和胆碱乙酰转移酶的增加。这些作用可以通过用抗胆碱阿地溴铵颠倒,由毒蕈碱受体M1,M2或M3的,或通过细胞外乙酰胆碱的通过用乙酰胆碱酯酶治疗耗尽沉默的mRNA。
非神经胆碱能系统涉及吸烟诱导的支气管成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变,这是被阿昔溴铵抑制的。
慢性阻塞性肺病(COPD)的特征在于,气流受限是渐进的和不完全可逆的。吸烟是COPD进展过程中的慢性阻塞性肺病,并有助于在气道结构改变的主要危险因素[1]。在COPD患者中的结构变化的特征是肺泡壁(肺气肿),肺动脉高压血管重构,粘液分泌过多或细支气管周纤维化的损失1]。如COPD纤维化改变的一部分,结构变化被认为主要是在小气道。该疾病的严重程度显示相关联引起的纤维化和炎症细胞浸润小气道的壁,这有助于气流阻塞的增厚[2]。积累和肌成纤维细胞的持续性被认为有助于小气道纤维化的发展。在这方面,慢性炎症条件下,固有的肺成纤维细胞被激活,并转化成一个更收缩,增殖和分泌活性成肌纤维细胞表型,其特征在于细胞外基质成分和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA),的表达增加,这有助于肺重塑级数的增加及气道反应性支气管收缩[3.]。
副交感神经活动是在COPD患者的气道而增加,对于使用抗胆碱治疗的基础[4]。抗胆碱能构成在COPD一个特别重要的支气管扩张剂治疗哮喘和某些形式的[5]。此外,在动物模型中,抗胆碱能药显示潜在抗炎和antiremodelling作用[6],其可以是另外的值,以他们的经典支气管扩张作用。
最近,有人提出,在气道乙酰胆碱可通过非神经元细胞类型被释放,如呼吸道上皮细胞和肺成纤维细胞。因此,一个非神经元胆碱能系统的功能障碍可能导致哮喘和COPD [的病理生理学7]。已有研究表明,抗胆碱能治疗可抑制吸烟引起的人支气管上皮细胞黏液素分泌增高[8],以及香烟烟雾诱导的肺成纤维细胞增殖[9]。此外,胆碱乙酰转移酶(聊天),负责乙酰胆碱生产胞内酶,在COPD患者和成纤维细胞两者肺成纤维细胞中被上调刺激与香烟烟雾[9]。但是,没有数据存在关于香烟烟雾对成纤维细胞的作用,肌成纤维细胞转变,以及抗胆碱能药物的潜在抑制作用。
阿地溴铵是一种新型的,吸入,长效毒蕈碱拮抗剂具有低全身活性化合物,其已完成对COPD治疗的III期临床发展[10]。在临床前研究中,阿地溴铵表现出有效的毒蕈碱拮抗剂活性,比得上异丙托溴铵和噻托溴铵,和长的作用持续时间[的11]。在临床试验中,阿昔溴铵提供了持续的支气管扩张,与噻托溴铵相似,具有良好的安全性和较低的抗胆碱能不良事件发生率[10]。
在这项研究中,我们调查阿地溴铵的在成肌纤维细胞标记物的增加的作用的I型胶原和α-SMA通过引起人支气管成纤维细胞慢性香烟烟雾暴露,以及涉及在该方法中,细胞内途径。
方法
请参阅所使用的方法的详细信息网上补充材料。
分离和人成纤维细胞培养
人支气管成纤维细胞取自肺癌手术患者,患者给予知情同意,如前所述[12]。成纤维细胞的培养和鉴定已在其他地方进行了描述[12]。获得人体组织的方案经为人类研究(瓦伦西亚总医院,瓦伦西亚,西班牙)的当地伦理审查委员会。详细信息请参见在线补充材料。
香烟烟雾提取物的制备及孵育
如先前所述制备香烟烟雾提取物(CSE)解决方案[13]。简而言之,研究用香烟的烟雾(2R4F;美国肯塔基州列克星敦市肯塔基大学烟草健康研究中心的研究人员将烟草倒入装有25毫升预加热(37°C)杜尔贝克改良过的老鹰培养基的烧瓶中。最终的解决方案被定义为100%的CSE。据报道,10%的CSE相当于每天约1-2包烟的暴露量[14]。刺激前,亚会合细胞单层被剥夺血清24小时。人支气管成纤维细胞用CSE(0-10%)的时间(0-72 1H)不同的周期的刺激下,更换培养基和刺激,每24小时。不同的药物调节剂刺激之前加入30分钟。详细信息请参见在线补充材料。
实时RT-PCR
总RNA通过使用TriPure®(罗氏,印第安纳波利斯,IN,USA)从培养的人成纤维细胞支气管分离,和反转录并用特定引物扩增。这些不同的成绩单相对定量与2确定-ΔΔCt方法以磷酸甘油醛脱氢酶为内源性对照(美国加州福斯特市应用生物系统公司),归一化于对照组。详细信息请参见在线补充材料。
小干扰rna的转染
小干扰为M1,M2和M3受体和乱序的siRNA对照RNA(siRNA)的购自Ambion公司(剑桥,英国)购得。所使用的转染试剂是脂质体2000(Invitrogen公司,佩斯利,UK)在2μL·mL的终浓度−1。详细信息请参见在线补充材料。
Western印迹
用Western印迹分析以检测在I型胶原蛋白(138千道尔顿),α-SMA,磷酸化细胞外信号调节激酶(ERK)1/2(42-44 kDa的),M1(52 kDa)的,M2(70 kDa的变化),M3(75 kDa)的,P67PHOX(67 kDa)的,NADPH氧化酶(NOX)4(67 kDa)的和聊天(65 kDa)的支气管成纤维细胞裂解物。请参阅使用免疫印迹分析和抗体的细节在网上补充材料。
活性氧物质的Dichlorodihydrofluorescein荧光测量
2',7'-二氯二氢荧光二乙酸酯(H2DCF-DA;Molecular Probes公司,英国诺丁汉)是用来监测在支气管成纤维细胞中的胞内活性氧簇(ROS)。详细信息请参见在线补充材料。
环AMP分析
人肺成纤维细胞在96孔板中培养至约95%汇合。以下不同处理,将细胞裂解,并根据制造商的说明(Amersham公司,剑桥,英国)用cAMP Biotrak酶免疫分析法测定细胞内的环AMP(cAMP)含量。结果表示为每孔飞摩尔。
分析的结果
数据表示为平均值±SEMn次实验。通过ANOVA然后Bonferroni检验(格拉夫派得软件公司,圣地亚哥,CA,USA)进行数据的统计分析。当p值均<0.05的显着被接受。
结果
溴化阿昔丁可减弱cse诱导的人支气管成纤维细胞培养中的肌成纤维细胞标记物
CSE,在2.5%的浓度,上调I型胶原蛋白和α-SMA以时间依赖性方式,达到以下CSE 2.5%曝光48小时峰值(图。图1A和1B)。此外,CSE剂量依赖性地增加了胶原蛋白I型和α-SMA的mRNA和蛋白的表达,在暴露48小时达到在2.5%浓度统计学意义(图。图1C-F)。因此,我们选择了该CSE浓度在以后的实验中来评价肌成纤维细胞标志物表达。
在其他的实验中,溴化aclidinium添加30分钟前CSE 2.5%,进一步培养48 h。aclidinium溴化剂量依赖性降低了CSE-induced胶原蛋白I型α-SMA mRNA和蛋白表达,达到最大抑制值10−7M(图2 a - c)。类似的结果观察阿托品,达到显著的抑制1μM myofibroblast标记,表明胆碱能通路参与这个过程(图。2D-F)。阿利地铵和阿托品本身对肌成纤维细胞标记物没有任何影响(图S1和S2)。
阿昔溴铵可降低人支气管成纤维细胞中CSE升高的细胞内ROS
在我们对人初级肺成纤维细胞的实验中,CSE(2.5-10%)剂量依赖性的细胞内ROS产生增加,达到一个值显著刺激2小时这是持续24小时(后图。3A)。与阿地溴铵支气管成纤维细胞的预处理剂量依赖性了近50%在10降低CSE引起的ROS−7CSE 2.5%刺激24小时后M(图3中)。在平行实验中,淬火的ROS apocynin(100μM)或N乙酰基l半胱氨酸(NAC)(1mM)的,以及与它的类似物丁酰cAMP的(dbcAMP)增加cAMP的,抑制CSE 2.5%-triggered细胞内ROS产生(图。3E)。
NADPH氧化酶复合物是由几个细胞溶质和质膜亚基[的15]。在分析的亚基中,我们发现胞质亚基p67PHOX和质膜亚基NOX4被最高度在基础条件下的成纤维细胞支气管表达(图。4A)。下列24小时暴露,CSE 2.5%上调P67的两个mRNA转录物和蛋白的表达PHOX和NOX4,这是剂量依赖性通过暴露恢复到接近控制值给阿地溴铵10−7M(图。图4b-d)。
非神经元胆碱能系统的CSE活化由阿地溴铵抑制
既往报道表明,CSE可激活肺成纤维细胞的非神经元胆碱能系统,但其作用机制尚不清楚。由于ChAT是胞内负责乙酰胆碱合成的酶,我们接下来探讨了CSE对ChAT表达的影响。在这方面,CSE增加2.5%聊天表情,由溴化aclidinium剂量依赖性抑制和抗氧化剂apocynin 100μM和南汽1毫米(图。5A)。
cAMP和ERK1磷酸化的细胞内水平/ 2已涉及到人类肺成纤维细胞的活化[12,16]。在这项工作中,我们观察到CSE 2.5%降低细胞内cAMP水平,并增加了ERK1 / 2的磷酸化在暴露24小时(图5罪犯)。阿地溴铵预处理剂量依赖性地降低了cAMP的下调以及减少ERK1 / 2磷酸化的增加(图。5B和c)。此外,夹竹桃麻素100μM或NAC 1mM的抗氧化处理也逆转CSE-诱导的cAMP下调和ERK1 / 2磷酸化(图5b和d)。由于CSE可能激活非神经元胆碱能系统,我们添加了乙酰胆碱酯酶(AChE) (10u·mL)+1)期间CSE 2.5%刺激的24小时内除去所有细胞外乙酰胆碱。胆碱酯酶部分逆转的cAMP下调和ERK1 / 2磷酸化的CSE(感应图5b和d)。
抗氧化剂NAC 1 mM和夹竹桃麻素100μM,以及内cAMP类似物dbcAMP和ERK1 / 2抑制剂PD98059 10μM,部分抑制的CSE诱导的I型胶原蛋白和α-SMA mRNA和蛋白表达(图。图6a和b)。而且,无论阿地溴铵10−7M和乙酰胆碱酯酶10 U·毫升−1还能够抑制CSE诱导的I型胶原蛋白和α-SMA mRNA和在人支气管成纤维细胞蛋白的表达,这暗示一个非神经元胆碱能系统在肌成纤维细胞标记物的上调(图。图6a和b)。为了进一步研究在成肌纤维细胞转化此非神经元胆碱能系统的作用,肺成纤维细胞用胆碱的摄取抑制剂转运hemicholinium-3在50μM或与乙酰胆碱酯酶抑制剂新斯的明10 2.5%CSE曝光之前μM孵育。Hemicholinium-3显著抑制CSE诱导的I型胶原蛋白和α-SMA的mRNA和蛋白表达,而新斯的明显著增加CSE诱导的I型胶原蛋白和α-SMA mRNA和蛋白表达(图。6c和d)。在缺少CSE,不同药物化验没有任何影响胶原蛋白类型的信使核糖核酸或蛋白表达我和α-SMA(无花果S3和S4)。
讨论
和新颖的这项研究的结果主要有:1)CSE myofibroblast标记增加胶原蛋白I型和人类支气管α-SMA纤维母细胞通过一种机制由细胞内活性氧的增加,损耗的营地和ERK1/2磷酸化;2) CSE通过超表达ChAT激活非神经元胆碱能系统,介导肌成纤维细胞标志物的增加;3)抗胆碱能溴化阿昔丁可以通过抑制CSE诱导的ROS生成、cAMP耗竭、ERK1/2磷酸化和ChAT过表达等作用来减弱CSE诱导的肌成纤维细胞标志物。这些新发现提供了体外的阿地溴铵的对可能有助于与COPD的吸烟者中观察到的细支气管周纤维化的改善那些香烟烟雾照射情况人支气管成纤维细胞antiremodelling效应的证据。
已知的是,在COPD患者气流受限于视为noncartilaginous传导气道中具有内径<2毫米远端气道发生。在这项工作中,我们仔细解剖的〜2毫米小支气管,以获得支气管成纤维细胞,其可以表示的地方的细支气管周纤维化发生[17]。支气管成纤维细胞转化为成肌纤维被认为是在增加小气道的厚度,减少气道半径和提高气流受限的过程中的关键步骤。肌成纤维细胞共享成纤维细胞和气道平滑肌细胞表型特征。在这方面,肌成纤维细胞的特征在于细胞外基质组分的分泌(例如I型胶原蛋白),即但不与平滑肌细胞,和通过形成收缩装置的与成纤维细胞共享的特性(例如α-SMA),是与气道平滑肌细胞,但不与成纤维细胞[共享的特性3.]。因此,我们选择这两种分子标记来分析肌成纤维细胞样表型。一些生长因子和炎性介质,如转化生长因子(TGF) -β1 interleukin-13和结缔组织生长因子被认为是诱发myofibroblast过渡的18];然而,没有关于吸烟的数据,吸烟是慢性阻塞性肺病的主要危险因素。在这项工作中,我们准备了CSE,正如我们和其他人之前所描述的那样[13,14],其大致对应于分别略微每天少于0.5包吸烟每香烟天略少于2包为CSE 2.5%和10%,相关联的曝光。目前,几个体外研究集中对肺成纤维细胞CSE的效果;但是,没有数据可用上对支气管成纤维细胞,以肌成纤维细胞转变CSE的效果。在这项工作中,我们观察到CSE促进肌成纤维细胞标志物表达,这与肌成纤维细胞样表型兼容[3.]。此外,肌成纤维细胞标记物的CSE诱导的表达通过细胞内ROS的产生,这曝光的2小时后,显著增加,并且一直持续到至少24小时介导的。所述ROS增加先于I型胶原和α-SMA表达(48小时后),表明细胞内ROS作为第二信使的作用。ROS产生的类似时间 - 响应先前已报道在人原发性肺成纤维细胞[19]。细胞内ROS产生响应CSE由NADPH氧化酶复合物[直接激活介导20]。NADPH氧化酶复合物是由几个细胞溶质和质膜单元,其变化依赖于细胞类型。因此,在人类肺成纤维细胞,NADPH氧化酶成分P47PHOX,p67PHOX,P22PHOX并观察到NOX4 [21]。在这项工作中,我们发现,NADPH氧化酶P67PHOX和NOX4是支气管成纤维细胞中最高度表达。胞浆P67PHOX亚基在一定条件下被激活,激活质膜等离子体亚基NOX1、NOX2或NOX3,产生超氧化物和/或过氧化氢。相比之下,质膜单元NOX4不需要细胞内调节亚基的相互作用和激活,其激活与表达直接相关[15]。在这方面,我们发现CSE诱导P67两者的上调PHOX和后NOX4刺激24小时,这是根据细胞内ROS的增加。
最近的研究报道了NOX4作为成纤维细胞进展和成纤维细胞向肌成纤维细胞转变的关键因子的相关表达[22]。因此,治疗减少NOX4,并反过来,细胞内ROS,可以防止肌成纤维细胞的过渡。我们发现,24小时曝光向抗氧化剂NAC或NADPH氧化酶抑制剂夹竹桃抑制CSE诱导P67PHOX和NOX4上调。这些抗氧化剂调制器还能够减少CSE诱导肌成纤维细胞标志物,建立氧化应激和肌成纤维细胞转变之间的联系。由CSE和这个作用诱导的抗胆碱能药阿地溴铵的减毒成肌纤维细胞标记物是由P67的抑制部分介导PHOX和NOX4表达,以及由随之减少由CSE产生细胞内ROS的。这些结果表明,CSE激活非神经胆碱能系统。以前的报道表明,香烟烟雾可以激活在不同的细胞类型,包括气道和人肺成纤维细胞的非神经元胆碱能系统。例如,我们最近表明,CSE通过乙酰胆碱的释放介导的机制促进合成和分化的支气管上皮细胞粘蛋白MUC5AC的释放,并且可以通过阿地溴铵可以抑制[8]。此外,来自COPD患者的人肺成纤维细胞已经显示增加毒蕈碱受体,以及ChAT的表达,这是CSE曝光后模仿健康肺成纤维细胞的效果[9]。在我们的实验中,乙酰胆碱酯酶抑制肌成纤维细胞标记物的CSE诱导的表达,这与一个非神经元胆碱能系统的存在一致。其它证据支持由香烟烟雾的非神经元胆碱能系统的活化包括聊天,负责乙酰胆碱合成的胞内酶的上调。我们观察到,CSE上调ChAT的表达,这是防止由于抗氧化剂NAC和夹竹桃麻素,以及由阿地溴铵,表明细胞内ROS的参与。非神经元胆碱能系统的参与的进一步证据由肌成纤维细胞转变的抑制阻断与hemicholinium胆碱摄取和增加成肌纤维细胞标记物抑制的AChE与新斯的明的支持。
如今,它被认为是香烟的烟雾中含有> 6000种化合物,可能的话,这个名单将按照发展新的分析技术可[23]。考虑到这种说法,我们知道,CSE有一个包含所有吸烟者吸入的化合物的优势。然而,由于CSE的非常复杂,这是难以识别的具体试剂介导,因为发现特定的浓度和CSE的给定药剂的暴露持续时间的差异的精确作用。为此,可以执行剂量 - 反应和时间过程的分析,并提出一些粗糙的计算表明,暴露在模拟体内会发生什么事情。上肺成纤维细胞。因此,例如,低浓度的CSE(<5%)的显示增殖作用[24- - - - - -26],而较高(> 10%)的浓度显示对肺成纤维细胞增殖的抑制效果[27],因此表明香烟烟雾的~6,000物质中,有可能根据它们的最终余额充当一些增殖和其他抗增殖化合物。
在目前的工作中,我们已经用2.5%CSE,这是在协议与低剂量的CSE的证明在以往的研究增殖作用[24- - - - - -26],其支持成纤维细胞活化在肌成纤维细胞转变的过程[28]。
从我们的实验室的初步数据表明,CSE在2.5%浓度时有暴露48小时后成纤维细胞增殖的略有增加(基于一溴脱氧尿苷掺入测定;数据未示出)。然而,这种增长是不够的,与阿地溴铵进行抑制实验。这是放弃这些实验的主要原因,因为成熟的肌成纤维细胞标志物Ⅰ型胶原和α-SMA在机理研究[更可靠3.]。
然而,即使能计算出曝光,实验与CSE可以进行微环境中存在的生命系统的组件不模仿所有的(例如细胞 - 细胞相互作用)。因此,尽管局限性,从这些研究结果让CSE的影响细胞功能的能力的决心,同时消除其他变量。
胞内cAMP是介导大量抗炎过程中的第二信使。除了它的抗炎作用,cAMP的也控制成纤维细胞活化的抑制,以及肌成纤维细胞转变[29]。因此,cAMP水平的降低可以促进成纤维细胞向肌成纤维细胞的转变。TGF-β1这是证明了这一点,增加磷酸二酯酶的表达和活性,酶降解阵营,促进myofibroblast过渡(三十]。香烟烟雾中的情况下,它已经表明,过氧化氢,烟草烟雾的组成部分,迅速提升磷酸二酯酶4D3的活性归因于磷酸肌醇3-激酶和ERK依赖的磷酸化[31]。在这方面,我们先前已经观察到,CSE降低人磷酸二酯酶4B上调的手段分化支气管上皮细胞的细胞内cAMP水平(数据未显示)。在这项工作中,我们观察到CSE减少cAMP和,这种影响部分被抗氧化剂NAC和阿地溴铵逆转,表明细胞内ROS的作用,细胞内水平。此外,乙酰胆碱酯酶也减弱了CSE-降低的cAMP,这表明非神经元胆碱能系统的参与。这可以通过以下事实:肺成纤维细胞中表达的主要的毒蕈碱受体为M2 [解释32],它被耦合至G我因此,通过非神经元胆碱能系统刺激M2也可以促进腺苷酸环化酶/cAMP途径的抑制,从而促进肌成纤维细胞的转变。
在与我们的结果相一致,最近,它已经发现,前列腺素(PG)电子2作为一种有效的cAMP增强,可能会抑制成纤维细胞的活化和它们转化为成肌纤维细胞[33,34]。因此,我们不能否认阿昔溴铵介导cAMP增加,从而抑制肌成纤维细胞转化的机制之一可能是PGE的增加2释放。
我们研究的另一个途径是ERK1 / 2信号。以前的研究已经表明,ERK1 / 2参与成纤维细胞中对肌成纤维细胞转变[35]和CSE直接磷酸化ERK1 / 2 [9]。因此,CSE诱导的肌成纤维细胞转变可以部分地通过ERK1 / 2介导的。在这项工作中,我们观察到CSE诱导ERK1 / 2的磷酸化,这减少了阿地溴铵,并通过抗氧化处理。此外,乙酰胆碱酯酶也衰减CSE诱导的ERK1 / 2的磷酸化,这表明毒蕈碱受体的活化也牵连。以前的结果支持这一概念毒蕈碱受体活化的增加通过ERK1 / 2激活的手段[胶原在人肺成纤维细胞的表达12]。因此,一个非神经元胆碱能系统也可以参与CSE诱导的ERK1 / 2磷酸化的过程。因此,ERK1 / 2的在CSE诱导的肌成纤维细胞标记物的作用是由ERK1 / 2拮抗剂PD98059的抑制效果的证实。
基于这些结果,我们可以得出结论,CSE由非神经元胆碱能系统激活人支气管成纤维细胞毒蕈碱受体,并且该机制涉及在成肌纤维细胞标记物的上调。然而,毒蕈碱受体亚型的在扮演这一机制显著作用尚不清楚。已经显示的是,G的抑制我以百日咳毒素蛋白减少响应于毒蕈碱激动剂所观察到的成纤维细胞增殖和胶原表达12],这对于M2受体的关键作用。然而,对于M1,M2和M3拮抗剂均有效地抑制由乙酰胆碱诱导的成纤维细胞增殖[9],尽管可使用的特定毒蕈碱拮抗剂不完全选择性[36]。为了解决这个问题,我们选择沉默使用siRNA的M1,M2和M3的基因。我们的研究结果表明,所有M1,M2和M3受体参与肌成纤维细胞标志物的CSE诱导表达。
总之,我们已经证明,香烟烟雾,这是慢性阻塞性肺病和肺参与重塑的主要危险因素,可以增加成肌纤维细胞标记物的表达胶原通过非神经元胆碱能系统的活化I型和α-SMA,其由抗胆碱能阿地溴铵衰减。因此,导致这项工作支持,阿地溴铵可调节COPD的细支气管周纤维化重塑除经典的支气管扩张活动中发挥作用观察。
脚注
这篇文章有提供补充材料www.www.qdcxjkg.com
支持声明
这个work was supported by Almirall S.A. (Barcelona, Spain) and, in part, by grants SAF2011-26443 (to J. Cortijo), SAF2009-08913 (to E.J. Morcillo), FIS (Miguel Servet CP11/00293 (to J. Milara)), CIBERES (CB06/06/0027) and research grants from Regional Government (Prometeo/2008/045, “Generalitat Valenciana”; research grants from “Generalitat Valencia” AP-178/11 (to J. Milara)). T. Peiró received a research grant from Conselleria de Educacion, Generalitat Valenciana ACIF/2010/114. We thank C. Bryant from Complete Medical Communications (Macclesfield, UK) who provided copy-editing support funded by Almirall S.A.
感兴趣的语句
利益冲突的信息可以一起这篇文章在网络版中找到www.www.qdcxjkg.com
- 收到2012年1月28日。
- 接受2012年8月27日。
- ©ERS 2013