抽象的
在肺气肿患者中,研究报告了2-3%的严重α患者1π不足。本研究的目的是评价一种定量α的新方法的准确性1-PI通过从干血斑(DBS)中的表型并测试假设:在风险下筛查群体的筛查增加了严重α的检测率1π不足。
将DBS的表型结果的准确性与总共555个个体的常规方法进行比较。在一个前瞻性研究中,筛选慢性肺病患者的α1‐使用DBS的Pi缺陷。
来自DBS的表型方法的验证显示了100%的精度。在1,060名测试的患者中,没有患PIMS的PIMS和PIMZ的39(3.34%)鉴定为PIMS的杂合,只有3例PIZ缺乏症,并且只有3个患有PIMS和39(3.68%)的PIMZ。
无重症α患者1‐在该群体中可以检测到Pi缺陷,检测到pim或PiMZ的频率与正常群体相似。因此,对慢性阻塞性肺疾病和哮喘患者的筛查可能无法发现大量严重α患者1π不足。
该研究得到了拜耳公司的资助,拜耳公司位于美国北卡罗来纳州三角研究园。坎贝尔的工作得到了小灵通基金HL 46440的支持。
严重α的患者1-PI缺乏患有发病率和死亡率增加,主要是由于慢性阻塞性肺病(COPD)和肺气肿的发展1,2.已知的主要危险因素是主动吸烟和被动吸烟。戒烟的病人比不戒烟的病人预后更好3..因此,尽早发现α1-PI缺乏将使患者能够使生活方式改变,以防止或推迟功能障碍的发展。然而,在大多数欧洲国家和美国,鉴定了<10%的预期纯合子型PIZ个人4- - - - - -6.实施有效的筛查工作可以提高检出率,并能够采取早期预防措施。
多项研究发现,在COPD患者转诊组中,纯合子PiZ个体的比例为1.9-17.8%7- - - - - -9表明COPD患者的靶向筛查可以显着增加纯合PIZ个体的检测。在此基础上,世界卫生组织(世卫组织)建议所有患有COPD和成人和具有哮喘的青少年的患者在他们的生命中筛选α1‐使用定量测试的Pi缺陷10..
α的诊断1‐Pi不足是基于α的测量1-PI血清水平和等电聚焦(IEF)。到目前为止,α的大筛选努力1‐由于需要抽取静脉血液并将其送到检测实验室进行两种类型的实验室检测,Pi缺陷受到了阻碍。使用干血点(DBS)对α进行定量测量1-PI和测定表型会避免使用制冷和简化处理和运输的需求。但是,在大规模筛选计划中使用DBS尚未得到验证。因此,本研究的目的是:1)确定α的新DBS测试的准确性1‐Pi浓度和表型,并评估在医生办公室为筛查目的使用DBS的可行性;2)评估大量慢性肺病患者缺乏等位基因的基因频率;3)确定应用世卫组织推荐的COPD和哮喘患者筛查是否能提高严重α患者的检出率1-PI缺乏,是大规模筛选目标人群的重要前提。
方法
α检验的验证1-pi缺乏使用干血斑
关于敏感性和特异性,预先评估使用DBS的使用DBS的方法。用于检测α1-PI缺乏,427个样品的等分试样的乙二胺四乙酸(EDTA) - 典型的全血液被送到滤纸上。然后对EDTA-抗凝血液和干燥的血液进行α1-PI免疫测定如下所述。干血液样品产生α1-PI浓度<20μm和相应的等离子体样品进一步进行IEF。
现场试验
对于后续免疫分析和表型分析的直接验证,需要参加Alpha - 1协会全国教育会议(Boston, MA, USA)的个人(该人群预计包括许多α患者)1‐Pi缺陷)有机会同时捐献edta抗凝全血(通过静脉采血获得)和通过刺穿远端手指垫在滤纸上晾干获得的血液。共有128名受试者提供知情同意并参与研究。免疫分析对样品进行了如下分析。所有DBS样本和相应的全血样本均进行表型分析。
测试α1- 在德国的选定从业者办公室缺乏缺陷
共有7名医生的办事处参加了筛选。四是一般从业者,三名是肺部医生。其中一个人用α治疗单个患者1π不足。在1999年3月和6月之间,提供了COPD(慢性支气管炎,慢性阻塞性支气管炎和肺气肿),哮喘或支气管扩张的患者进行了测试1-PI浓度和表型。获得了书面知情同意,并在滤纸上收集血液样品进行进一步加工。附着在滤纸上是一个调查表,其中医生勾选与吸烟病史,临床症状和肺部诊断有关的盒子。
共收到1156个样本进行评价。在89例病例中,滤纸上的血液斑点差使两种α都无法检测到1-PI浓度和表型。在七种情况下,有足够的材料来确定α1-pi浓度。因此,可以进一步分析1,060例。
将血液涂在滤纸上,然后冲洗
发现了从带有柳叶叶的远端手指垫中获得的全血,从脉冲术获得的血液耳垂或EDTA-抗凝血液标本中获得。903纸(Schleicher&Scheull,Keene,NH,USA)将圆圈的圆圈完全饱和在纸上印迹。然后将纸张在室温下风干,并在4℃下储存单独的包络,以避免交叉污染。样品每周一次发货一次通过隔夜快递到实验室。为了进行后续分析,将1/8英寸直径的含有干血的滤纸用手打孔,或者使用德尔菲平板打孔机(Wallac Oy, Turku, Finland)将两份滤纸直接打孔到微量滴定板上。
免疫测定为α1-PI.
完全自动化的免疫测定为α1‐如前所述,在多孔板中检测edta抗凝血中的Pi11..对于将血液的免疫测定干燥到滤纸上,α1使用Tecan RSP 8051 ID机器人样品处理器(Tecan US,Durham,NC,USA)从滤纸等分试样洗脱PI,使用0.01M磷酸盐,0.9M NaCl,0.05%吐温,0.1mg·ml−12.5%甘油,pH 7.4,牛血清白蛋白60分钟,然后以1:17稀释到96孔荧光板(IDEXX, Inc., Westbrook, ME, USA)。最终的多孔板包括以下材料,每一份一份:1)参考样品,2)正常对照样品,3)已知具有α的个体的样品1-pi缺陷(piz)和4)空白孔和四个已知α标准1- 钛素浓度。
然后在筛选机(IDEXX)中进行完全自动化的颗粒浓度免疫分析,基本如前面所述11..将数字荧光数据转移到微型计算机,这将未知样本引用到标准和结果的结果。
等电点聚焦
用于确定α1‐Pi表型,edta抗凝全血样本经聚丙烯酰胺凝胶(LKB Multiphor II和LKB Macrodrive 5 Constant Power Supply, Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, USA) IEF处理,基本如前面所述12..
的α1‐通过在洗脱后的血液中加入二硫苏糖醇至最终浓度为0.5 M,然后对样品进行IEF,测定干燥血液样品的Pi表型。IEF后,将蛋白被动转移到硝酸纤维素纸上,与兔α共孵育1‐Pi,然后用山羊抗人免疫球蛋白(Ig)G (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA)。的α1‐然后用硝基蓝四唑啉染色显示Pi13..
统计方法
数据显示为平均值±SD。为了比较组之间的差异,使用了一种方案分析(ANOVA)。Friedman测试用于通常不分布的变量。对两个不相关的样品进行比较进行Mann-Whitney试验。在分析不同表型对α的影响1-PI浓度,使用非参数Kruskal-Wallis H试验。为了评估两个分类变量的关系,使用了CHI方向。培养梨系数被计算为分析两个变量的线性相关性。
结果
用干血斑验证测试
427份DBS样本的免疫分析结果与各自的血浆样本的比较见表1⇓.从这两个样品获得的免疫测定结果之间的协议是优异的。临床显着的α1‐Pi缺陷的特征是α1‐Pi血清浓度<11µM。所有样品都含有α1‐Pi浓度<11 μ M的血浆免疫分析也有α1‐Pi浓度<11 μ M,从相应的干燥血液样本进行免疫分析。
当DBS样品中含有α1-PI浓度<20μmol是表型化的,所有29个具有水平<11μm的个体,但没有其他物质具有缺陷的表型piz。因此,在滤纸上干燥的样品不会产生α的假阳性或假阴性1‐Pi缺陷,从干血中检测到的所有表型与从液体血中检测到的表型相同。
血浆与DBS α之间的相关系数1-PI浓度为0.951(P <0.0001)。所有DBS样本都具有α1-PI级别<11μm,但没有其他级别,有α1-PI浓度<11μm液体静脉血液的标准免疫测定(表1⇑).
具有α的个人1-Pi <11μm,但没有其他人发现具有表型Piz。总共有52米,7毫秒,36Mz,2分,26个个体。四个受试者在表型测试中具有M等位基因和可疑的罕见等位基因的组合。一名患者用α静脉注射治疗1-PI,因此没有尝试表型这一个人。DBS的所有表型结果与相应的静脉血样都是一致的。
德国筛选人口的人口统计
筛查了患有肺病的1,060名患有肺病的肺病被筛选为α1π不足。77%的患者(819例)经过肺科医生的筛查;其余241人由全科医生诊治。
其中男性498例(47%),女性548例(51.7%)。14人(1.2%)没有提供有关性的信息。研究组的平均年龄为52.5±18.9岁(中位年龄56.4岁,范围5-91岁)。87例<18岁,217例70岁。自我报告的吸烟史显示22.5%的吸烟者,33.0%的戒烟者和38.1%的不吸烟者。其余68例患者(6.4%)信息缺失。与不吸烟者和吸烟者相比,戒烟者的平均年龄更高(60.7±14.7岁)与47.6和49.8 YRS分别,P <0.0001)。
运动时呼吸困难是最常见的主诉(69.3%),其次是咳嗽(61.9%)、痰(50%)、哮喘(43.3%)和喘鸣(42.1%)。只有五分之一的患者出现了单一的症状,22.4%有两种症状,17.4%有三种,12.6%有四种,27.1%有所有五种症状。
哮喘是这些患者治疗的医生最常见的诊断,并存在于419名患者中(表2⇓).89.9%的人没有伴发其他疾病。正如预期的那样,哮喘是青少年中最常见的诊断,在接受检测的人群中患病率为78%。390名患者被诊断为慢性阻塞性肺病,在几乎一半的病例中,这种诊断与其他肺部疾病有关。301例患者出现肺气肿,70.1%的患者同时伴有其他肺部疾病。仅17例确诊为支气管扩张。在>70岁的患者中,伴有或不伴有肺气肿的COPD患病率为80%。在158例患者中,存在其他诊断,主要是慢性支气管炎而无阻塞性肺病,或信息缺失。
肺部疾病患者干血点的检测结果
表型和相应的α1‐表3显示了1060个受测个体的Pi浓度⇓.
表型是对α有统计学意义的预测因子1-PI浓度(P <0.0001)。PIM表型患者中发现了最高的。它们显着高于PIMS或PIMZ个体(P <0.0001,两个比较),这些再次比PISZ显着高(P <0.05,都是比较)。没有发现纯合的Piz,只发现了三个PISZ个人。对于COPD,三种最常见诊断肺病的PIMZ百分比分别为3.9%,分别为肺气肿为2.9%,哮喘为2.9%。急性或慢性支气管炎的患者从分析中省略了唯一的诊断。用于诊断的基因频率如表4所示⇓.
α相关等位基因的基因频率差异无统计学意义1-PI缺乏S或Z用于任何给定的诊断。报告吸烟地位的基因频率之间也没有统计学上显着差异。
讨论
量化α的新测试方法1与常规方法相比,DBS的PI浓度证明是非常可靠的。另外,通过IEF和免疫印迹的组合从DBS的组合的表型样品显示为100%的精度。在慢性肺病患者的前瞻性筛查中,基因频率与正常志愿者的基因频率相似14.- - - - - -16..在这项研究的基础上,2-3%患有肺气肿的2-3%的假设必须在寻求COPD和哮喘的初级保健的未参考人口中驳斥。
DBS已被用于新生儿筛查,以发现多种疾病。它们可以很容易地应用于大量的个人,不需要静脉采血,样品的储存和运输不需要特殊的容器或预防措施。在劳雷尔和斯维格的经典研究中17.,108,000名瑞典婴儿被筛选为α1‐使用DBS的Pi缺陷。但是,当时他们仍然无法量化α1‐Pi在干血中的浓度,并使用转铁蛋白峰的高度作为相对参考。一种类似于本研究中描述的酶联免疫吸附试验(ELISA)方法首次用于比利时> 39000新生儿的筛查18.证明该方法是一种可靠的定量方法1-PI。的α1‐DBS收集的Pi蛋白和脱氧核糖核酸在室温下稳定1个月18..该方法简单且易于自动化,因此非常适合筛选大量样品。最近,西班牙小组使用了DBS的eluates来量化α1‐Pi和确定表型。在这项研究中,α的相关性1‐DBS之间的Pi浓度与血清样本很好,表型结果完全一致19..
获得严重α的频率的结果1‐在寻求内科治疗的COPD或哮喘的目标人群中,目前的作者检测了两者的α1‐Pi浓度和表型。该方法对群体杂合子率及M、S、Z等位基因频率进行了分析。对于仅鉴定严重缺陷的个体,两步法更合适,即在20µM α的临界值以下就足够了1-pi只在血清中。在这种情况下,不会检测到高百分比的杂合MZ和MS。在这项研究中,所有样品均为定量和表型。截止为20μm,将鉴定出pimo,s和sz表型的所有个体。对于一种缺乏等位基因的载体,已经确定了11%的PIMS和56%的PIMZ。因此,20μm的截止被证明是一种安全的方法,可以识别具有严重缺陷的所有人。
20世纪70年代的几项调查报告患有严重α的患者患者高患病率1-PI缺乏COPD和/或肺气肿的患者的缺乏。1969年,利伯曼和大学7,20.研究了66名患者患有肺肺气肿的退伍军人医院的66人血清胰蛋白酶抑制力(TIC)。仅在单独的Tic的基础上,它们鉴定了10.6%的纯合蛋白和15.2%的杂合子;没有表型结果可用。要学习可能对α特别感兴趣的偏见的可能选择偏见1-PI缺乏,调查人员研究了240例COPD和/或肺气肿的表型,并将其与由尤其感兴趣的医院获得的那些1-PI缺乏9.两个纯合子的百分比(2.5与5.4%Piz个体)和杂合身(8.3与专业诊所的13.8%PIMZ显着高,确认了α专业化诱导的大量选择偏差1π不足。考克斯et al。8调查了163名患有大型城市医院肺部服务的COPD患者,并在整个组中发现了4.9%的PIZ患者,肺气肿患者患者患有4.9%的PIZ患者。1986年,利伯曼et al。7在965名严重COPD患者的人群中发现了1.9%的纯合子蛋白。没有关于所测试的人口的细节。但是,有证据表明明显的选择偏差。患者严重受损,并在绝望地试图缓解呼吸困难时提及双侧颈动脉体手术。
基于这些报告,世卫组织10.2-3%的肺气肿患者为PiZ纯合子,推荐筛查α1‐COPD和肺气肿患者的Pi缺乏。
这项研究的一个目的是测试WHO建议筛查风险的人们的有效性。目前作者的假设是通过筛查肺病患者,主要是COPD和肺气肿,可以识别大量严重α的患者1π不足。在本研究中,使用目标人群中1-2%的纯合子PiZ更保守的估计,将导致在1000名筛查患者中识别出10-20个严重缺陷个体。在1060例筛查患者中没有发现PiZ个体,这一事实导致纯合子PiZ的频率小于0.1%,而不是最初预期的1-2%。除哮喘患者外,有691例COPD和/或肺气肿患者导致纯合子PiZ频率<0.2%。
尽管上述历史研究和本文的调查在患者选择方面存在明显差异,但缺乏严重的α1-PI在测试中的人口中的个体是出乎意料的。与其他研究相比,患者提到了一家医院,其中α特别感兴趣1‐未研究Pi缺陷。被诊断为慢性阻塞性肺病并寻求初级保健的患者的病情可能比因慢性阻塞性肺病住院的患者轻。此外,先前研究的人口年龄较大,男性比例较高。在本研究中,肺功能标准未用于COPD的定义。尽管本研究中的大多数患者在检查时都进行了肺功能测试,但慢性阻塞性肺病的诊断标准可能存在差异。此外,单独使用TIC或使用酸淀粉电泳均可能导致高估Z等位基因的频率。这些因素表明,在调查肺气肿患者中PiZ个体百分比的历史研究中存在显著的选择偏倚。这项研究表明,这些结果不能对初级保健环境中的COPD患者人群进行推断,对该患者群体进行大规模筛查不会产生1-2%的纯合子PiZ检出率。按照世卫组织的建议进行的有针对性的筛查目前还不足以提高α的检出率1π不足。对于高产量检测方案,必须确定和评估额外的选择标准。
对于中间体α患者的肺气肿的风险增加,有相当大的争议1π不足。一些研究发现,PIMZ的个人在个人中发育的风险增加8,9,21.,而其他人没有22.,23..在德国几项使用IEF确定表型的基于人群的研究中,PiMZ的百分比为2.4-3.8%,与本次调查中发现的3.7%没有显著差异14.- - - - - -16..虽然这意味着杂合PIMZ的频率在患有COPD患者的群体中没有增加,但该研究并非设计用于测试这一假设。通过相同的实验室方法测试的同一地理区域中的正常对照组将需要进一步调查这个问题。
综上所述,本文所述的干血斑法准确,适用于大人群的筛查。与以前发表的研究相反,中间α的频率增加1- 没有发现慢性阻塞性肺病患者的pi缺乏。由于没有严重α的人1-PI缺乏症被发现,哮喘或慢性阻塞性肺病患者未选择的患者PIZ患者的百分比<0.1%。
致谢
作者想要感谢以下德国的参与医生和他们的工作人员对这项研究的宝贵贡献:G. Wichtmann(肺部专家),Recklinghausen;P. Gussmann(全科医生),盖尔森基兴;G. Hammelmann(肺病专家),埃森;A. Marx(全科医生),盖尔森基兴;M. Emmerich(全科医生),盖尔森基兴;W. Marx(全科医生),Oberhausen;J. Roghmann(全科医生),Bottrop。
- 已收到2001年10月27日。
- 接受2002年3月11日。
- ©ers Journals Ltd