抽象的
血管内皮生长因子(VEGF)是血管生成因子,其涉及哮喘严重程度。本研究的目的是确定VEGF单核苷酸多态性(SNPS)是否与哮喘,肺功能和气道反应性有关。
本文作者在儿童哮喘管理计划(CAMP)458个白人家庭分析10个SNP。使用PBAT软件(金喜公司博兹曼,MT,美国进行哮喘,肺功能和气道反应协会的测试,可在www.goldenhelix.com).气流阻塞的家庭和人口为基础的,revpeated措施分析进行的。复制研究在412名哮喘儿童和他们的父母来自哥斯达黎加进行。
在两个队列中观察到哮喘、肺功能和气道反应性的相关性。SNP rs833058在两个队列中都与哮喘相关。这种SNP也与两种人群气道反应性的增加有关。rs4711750及其单倍型与1秒用力呼气量(FEV)的关联1.)/强迫肺活量(FVC)比值。CAMP的纵向分析证实rs4711750与FEV相关1./FVC decline over ∼4.5 yrs of observation.
VEGF多态性与儿童哮喘,肺功能,并在两个人群气道反应性有关,这表明VEGF基因多态性影响哮喘易感性,气流阻塞和气道反应。
过度辅助性T细胞(Th)2型介导的炎症,产生气流阻塞,是哮喘的病理基础之一。虽然这种气流阻塞在使用支气管扩张剂时通常是可逆的,但在一些持续性哮喘患者中可能会出现进行性、不可逆的气流阻塞,导致长期残疾1..这种进行性梗阻通常与气道重塑的特征性组织病理学改变有关,包括上皮下纤维化、新生血管和平滑肌沉积增加,所有这些都导致小气道直径减小2..血管生成被认为是哮喘气道壁的重要病理特征。哮喘患者支气管活检显示增加的血管,在上皮下的血管表面积和整体容器尺寸都显着增加2..
血管内皮生长因子(VEGF)是一种重要的血管生成因子,在组织损伤和修复中与血管新生有关。一些证据表明,VEGF有助于哮喘、气道反应性和气道重塑的发展。动物模型已经证明了VEGF在哮喘中抗原诱导的th2介导的气道炎症中的重要性3..转基因小鼠模型还证明了VEGF的过度表达导致气道上皮,气道炎症和气道高反应性的血管性增加,所有这些都是由VEGF对抗的主要原因4..病理结果与哮喘患者相似。Simcock等等。5.最近发现的促血管生成因子,包括血管内皮生长因子水平,都在支气管肺泡灌洗(BAL)流体的轻度哮喘患者比非特健康对照组5.在人类中,哮喘患者BAL液中VEGF的表达明显高于健康对照组6..在哮喘学中,BAL流体中的VEGF表达与肺功能相反2..另一项最近在哮喘患者中进行的研究证实,气道上皮细胞中VEGF和VEGF受体(VEGFR)表达的增加与组织学标本中的气道重塑、肺活量测量中气流阻塞以及气道对methacholine反应性的增加相关7..在本研究中,布地奈德/福莫特罗治疗6个月可降低VEGF和VEGFR的表达,并减少气道重塑的组织学标本7..总之,这些数据表明,VEGF是哮喘易感性、气道重塑、气道反应性和进行性肺功能下降的一个可信的分子决定因素。
考虑到这些意见,本作者假设,VEGF基因序列变异的影响哮喘易感性,进行气流阻塞和气道反应性哮喘患儿。人VEGF基因(位于染色体6p21)港口至少140个已知的单核苷酸多态性(SNP),其中有几个已与临床表型相关联的8.–10.然而,迄今为止,还没有关于VEGF与哮喘、肺功能或气道反应性相关的研究报道。为了确定VEGF变异是否与哮喘易感性、气流阻塞和气道反应性有关,本文作者对两组儿童哮喘患者进行了基于家族的遗传关联研究。
方法
研究人群
儿童哮喘管理计划(CAMP)是一个多中心,随机,双盲,安慰剂对照试验研究吸入糖皮质激素和吸入性奈多罗米的长期影响。的1041名儿童临床试验的随机,968名儿童和他们的父母为1 518提供的DNA样本作为CAMP的遗传辅助研究的一部分。DNA是足够所有家庭成员的自我报告,非西班牙裔,白人血统的470个核心家庭谁是先前研究11.这些家庭中,32有一个以上的哮喘后代,从而可用于分析共503名哮喘患儿。
纳入营地的儿童基于使用PC的甲素对甲素的气道高反应性的示范进行了温和至中等的持久性哮喘20.(1)刺激性浓度导致用力呼气量下降20% s(FEV1.)) ≤12.5 mg·mL−1.,以及以下至少两项:每周至少2次哮喘症状,每周至少2次吸入性支气管扩张剂的使用,或筛查前一年>6个月每日使用哮喘药物12.Follow-up clinic visits with spirometry occurred at 2 and 4 months, and every 4 months thereafter. Spirometry performance was required to meet American Thoracic Society (ATS) criteria for acceptability and reproducibility. At least three spirometric manoeuvres were performed, with at least two reproducible manoeuvres required for each test. Post-bronchodilator spirometric values were obtained >15 min after the administration of two puffs of albuterol (90 μg·puff−1.).营地学习的完整试验设计,方法和主要结果已经发布13.
复制群体
在2001年2月至2005年3月期间,在哥斯达黎加哮喘遗传流行病学队列中招募了412名父母-孩子三组进行了重复研究。有关学科招募和研究方案的细节已在其他地方公布14.简而言之,如果他们患有哮喘(如医生对哮喘的诊断,前一年的至少两次呼吸症状或哮喘发作所示,则包括哮喘,并且在六个方面的呼吸症状或哮喘发作至少有两种呼吸系统症状或哮喘发作。great-grandparents born in the Central Valley of Costa Rica (as determined by the present study’s genealogist on the basis of the paternal and maternal last names of each of the child's parents). This requirement increased the likelihood that children would be descendants of the founder population of the Central Valley15.所有儿童都完成了问卷调查、肺功能测试(符合ATS的可接受性和再现性标准)、乙酰甲胆碱激发试验以及血清总免疫球蛋白E和外周血嗜酸性粒细胞的测量。
布里格姆和妇女医院(波士顿,马萨诸塞州,美国)、国家医院Niños(圣José,哥斯达黎加)和每个参加营地的机构审查委员会批准了该计划。参与研究的儿童的父母知情同意,并在参与研究前获得儿童的同意。
基因分型
从HapMap中选择snp16和dbSNP17数据库标记所有常用VEGF单倍型块,并达到~5 kb / snp的物理密度。使用Illumina Golden Gate Platform(Illumina Inc,San Diego,Ca,USA)进行SNP基因分型。对样品的〜5%进行重复基因分型,以评估基因分型的质量。评估谱系数据用于使用PEDCHERCK的母中后代基因型不相容的证据18.的Hardy-Weinberg平衡在父母在每个基因座上使用精确方法测试19.基因型数据质量通过基因型完成率评估,在数据中的重复基因分型和孟德利人的证据中不一致。
统计分析
按照GoldenHelix软件包(Golden Helix, Inc., Bozeman, MT, USA;可以在www.goldenhelix.com).进行哮喘关联分析,无调节20..肺功能表型(后支气管扩张(FEV的分析1.)和FEV的比率1./强迫肺活量(FVC)进行协变量(年龄、性别和身高)调整。气道反应性分析根据年龄、性别、身高和吸入类固醇的使用情况进行调整。标准表型残差是通过回归表型在非遗传协变量上获得的,这些协变量被认为是表型的强预测因子。其目标是消除由非遗传因素引起的表型变异性(上面列出了每一个被测试的表型)。然后使用标准表型残差作为数量性状分析的结果。考虑了加性遗传模型和显性遗传模型。为了解释多重比较,当类似关联(即相同的等位基因,相同的表型,给定相同的遗传模型的遗传效应相同的方向)在CAMP和哥斯达黎加种群具有<0.0008一个Fisher的组合p值都观察到。此阈值占八个有效独立标记测试(使用Nyholt SNPSpD法确定;在网上看到的补充数据S121,22,四个非独立的表型,在两种遗传模型)。
用Gabriel方法定义了单倍型块结构23使用Haploview(Broad研究所,剑桥,MA,USA;可在www.broad.mit.edu/mpg/haploview),并使用PBAT进行基于单倍型的关联测试(Golden Helix, Inc;可以在www.goldenhelix.com).使用截止频率为0.01的多晶单曲单倍型试验进行单倍型关联的全局测试。然后使用单倍型特异性测试进行评估单倍型嵌段关联。
鉴于营地儿童纵向数据的可用性,本文作者能够评估SNP rs4711750对进行性气流阻塞的影响。在营地进行FEV纵向分析1./ FVC使用SAS(版本9.1版本9.1版本9.1; SAS Institute,Cary,NC,USA)中的Proc混合过程中实现的混合模型。纵向分析调整为年龄,性别,治疗组和身高。基于系列的系列与重复振动度措施的关联测试使用了主要成分FBAT(FBAT-PC)24.
CAMP研究设计是一项随机、安慰剂对照的临床试验,能够测试吸入糖皮质激素治疗是否会改变VEGF多态性对纵向肺功能的影响。因此,本文作者使用FBAT相互作用(FBAT-I)对治疗组进行了基因相互作用试验在PBAT中实现25.在随机治疗作业的背景下没有研究哥斯达黎加人口,禁止在这队队列中的类似分析。
结果
表型和CAMP的遗传相似性和哥斯达黎加同伙
本研究中CAMP和哥斯达黎加三位一体基因分型指标病例的基线特征见表1⇓.尽管地理和祖传的差异,以及样本确定方法,但营地和哥斯达黎加证书的基线特征非常相似。两个队列中有更多的雄性,以伴随着雄性儿童哮喘的患病率增加。
在营地学习的470家白人家庭中,由于孟德尔的不一致,13分析来自此分析,并且10个证据具有不足的基因分型。在参与哥斯达黎加研究中参与哮喘遗传流行病学的426种TRIOS中,由于孟德尔的不一致(n = 9)或VEGF的基因型数据不足(n = 5)。因此,在VEGF中的17个SNP在458名非西班牙裔家庭(493个奖项)在营地和412朵哥斯达黎加三人组织中进行了基因分型。基因型数据的质量对于分析中包括的研究群体高,平均完成率为99%,初始基因分型和5%的样品之间没有差异的差异。所有群体中的父母基因型都在所有基因座的Hardy-Weinberg平衡中。
Figure 1⇓呈现在这两个哮喘队列连锁不平衡(LD)和单倍型块结构的图形。尽管不同祖先的历史,围绕所述VEGF基因区域LD是相似的,在本分析中使用的组织为四个离散的单倍型区段在两个群体中的10个SNP。块结构是群组之间几乎相同,在该块的边界,并且每个块内的单倍型是相似的。However, notable differences in the distribution of haplotype frequencies were found (table 2⇓).例如,在两个队列中,block 4由三个相邻的SNPs定义,并拥有相同的四种常见单倍型,但CAMP受试者中最常见的单倍型(TCG,频率0.517)在哥斯达黎加队列中要少得多(0.122)。在其他区块,特别是第2区块,也发现了类似但不那么极端的单倍型分布差异。因此,虽然LD和单倍型结构在这些队列中几乎相同,但单倍型频率有所不同。
CAMP和哥斯达黎加受试者中VEGF与哮喘和肺功能表型的关系
接着,将VEGF基因变异与哮喘,气流阻塞和气道反应性的关联进行测试。为了减少统计比较的次数,本作者限定协会测试,以通过排除7个SNP与次要等位基因频率<10%的基因分型的SNP 17 10(由于有限的统计功率)。
在显性遗传模型下,两个人群中10个VEGF多态性与哮喘发病状态的FBAT关联结果如表3所示⇓.There was evidence of association of rs833058 with asthma in CAMP (p = 0.004). Notably, this association was replicated in the Costa Rican trios (p = 0.01). In both populations, the T allele was overtransmitted to individuals with asthma (Fisher's combined p = 0.0004), which was statistically significant after correction for multiple comparisons26,27.另一种VEGF变异在CAMP中显示了与哮喘相关的证据(rs7748962, p = 0.02),但这种关联在哥斯达黎加队列中未被复制。
鉴于VEGF在小鼠气道重塑模型中的作用,接下来研究VEGF多态性是否影响FEV1.在儿童时期的哮喘。营地的暗示协会包括一个带有fev的snp1.(rs4711750, p = 0.01) but this association did not replicate in the Costa Rican trios. In the Costa Rican trios, the present authors also found suggestive evidence of association of SNP rs2146323 with post-bronchodilator FEV1.(p = 0.02)。
由于气道重塑已采用逐行气流阻塞相关联,本作者下一个试图确定VEGF变化是否影响气流阻塞,如通过测量FEV1./ FVC在临床试验中随机化时。值得注意的是,位于VEGF的3'-Unsransated地区的SNP RS4711750与FEV相关联1./FVC (p = 0.01) in CAMP, with the major A allele being overtransmitted to individuals with higher FEV1./ FVC比率。SNP RS4711750与FEV的关联1./在哥斯达黎加队列中也发现了营地FVC(p = 0.02),尽管方向相反(小A等位基因对FEV较高的个体传播不足)1./ fvc)。
VEGF的表达已经在普通人群与气道反应性有关28. 因此,作者研究了VEGF多态性是否影响儿童哮喘的气道反应性。哮喘相关SNP rs8833058也与两个人群的气道反应性增加相关,T等位基因携带者在两个CAMP中均表现出气道反应性增加(p = 0.01)和哥斯达黎加受试者(p = 0.03,费舍尔综合p = 0.003;表 3.⇑).观察与气道反应性无其他SNP关联。
CAMP和哥斯达黎加受试者单倍型阻滞与哮喘和肺功能表型的相关性
基于单SNP分析的证明与哮喘,FEV关联复制发现1./ FVC和在两个人群的气道反应,将含有这些SNP单倍型块随后测试用于与这些表型的关联。使用已建立的在Haploview块结构,块1被用于与哮喘的感情状态和在两个群体气道反应性的关联进行测试。The association with asthma was confirmed, with the AT haplotype being overtransmitted in both CAMP and Costa Rican subjects (p = 0.02 and p = 0.005, respectively, Fisher's combined p = 0.001). The AT haplotype in block 1 was also associated with increased airways responsiveness, albeit with weaker affect (in CAMP, p = 0.03, and in Costa Rican subjects, p = 0.03 and Fisher's combined p = 0.007). Furthermore, block 4, which is the terminal 3-SNP haplotype block containing rs4711750, was tested for association with FEV1./ FVC。ACA的单倍型与FEV相关1./ FVC在两个群体。ACA的单倍型overtransmitted个人具有较高的FEV1./FVC values in CAMP and undertransmitted in the Costa Rican cohort (p = 0.01 and 0.003, respectively).
CAMP中气流阻塞的纵向分析
为了评估rs4711750随时间变化对气流阻塞的影响,一项基于人群的支气管扩张剂后FEV纵向分析1./ FVC在CAMP临床试验期间以4.5 YR观察进行。为了排除人口分层的潜在效果,使用反复措施使用FEV的验证家庭基于基础的关联测试1./ FVC使用FBAT-PC进行。RS4711750基因型和FEV之间的重要关系1./FVC (p = 0.03)。如图2所示⇓而TT Homozygotes与AT或AA受试者相比,随着时间的推移产生更严重的气流阻塞。感兴趣的是,吸入的皮质类固醇没有改变临床试验时间过程中逐步气流阻塞的发展(P = 0.11)。在Costa Rican Cohort中不可用的纵向数据,排除评估该发现的复制。
CAMP中吸入糖皮质激素治疗VEGF SNPs对纵向肺功能的影响
鉴于以前的证据通过用吸入的皮质类固醇治疗6个月来修改VEGF对呼吸道重塑的效果7.,SNP-通过治疗组分配的相互作用使用FBAT-I测试25.这些分析揭示了SNP rs2146323与支气管扩张剂后FEV治疗组之间相互作用的证据1./FVC(交互作用的p值0.02):吸入皮质激素的个体携带至少一个A等位基因副本的平均FEV更高1./ FVC在吸入皮质类固醇治疗4岁后,与未吸入皮质类固醇未治疗的受试者(85.1±5.6相对82.5±7.3)。相比之下,没有携带等位基因的受试者展示了类似的FEV1./FVC比率(83.3±7.5)相对84.2±6.7)。有用于其他VEGF单核苷酸多态性SNP处理相互作用没有其他证据。
讨论
持续性哮喘(包括那些与轻微的疾病)的儿童有相当比例的具有降低的肺功能与非哮喘,健康,年龄匹配的对照相比,并不能达到它们的最大预测肺生长29.虽然气道重塑特征的病理变化通常归因于持续的过敏性炎症,但在常规剂量下具有吸入皮质类固醇的儿童哮喘的持续治疗不会影响长期肺功能12.因此,识别哮喘和气道重塑发展背后的分子决定因素是非常重要的,因为理解导致气道功能障碍的新途径可能最终具有深远的治疗意义。
在这项基于家族的关联研究中,发现在两个独立确定和种族不同的人群中,VEGF多态性(rs833058)与哮喘相关。在对多个比较进行全研究校正后,这种重复关联是显著的(详情见在线补充材料S1)。值得注意的是,SNP也与儿童哮喘人群气道反应性增加有关。目前的作者已经证明,VEGF变异也影响气流阻塞:rs4711750与FEV有关1./FVC in both populations and was also associated with progressive airflow obstruction over >4 yrs of follow-up in the CAMP study, suggesting that this variant (or others in linkage disequilibrium with it) may contribute to airway remodelling. Furthermore, it was demonstrated that 4 yrs of treatment with inhaled corticosteroids in the CAMP clinical trial modified the effect of SNP rs2146323 on FEV1./ FVC观察后4岁。
大量证据表明VEGF在气道反应性的发展中发挥作用。最近,王等等。7.证实气道反应性的与哮喘支气管上皮细胞的VEGF和VEGFR表达的相关性(如通过乙酰甲胆碱响应测量)。与在普通人群中的气道反应VEGFR多态性的遗传协会已报告28.据目前的知识中,这里提出的结果是第一个建议VEGF多态性与哮喘症中的气道反应性的关联。
肺发育的动物模型已经证明了VEGF通路在肺形态发生中的重要性,特别是对气道发育的贡献子宫内30..来自小鼠发展模型的实质证据表明,早期肺部肺部肺部血管的上皮表达调节上皮分支形态发生。本研究表明,VEGF多态性在两个哮喘群体中对肺功能和气道反应性的关联,这可能与VEGF在气道发展背景下的影响有关。
与其他中间哮喘表型一样,气道重塑可能是一种复杂的过程,由遗传和环境因素的相互作用导致。一个重要的环境因素是卷烟烟雾暴露(既积极和无源),但成年哮喘学肺功能的纵向研究表明,在哮喘学中经常观察到的加速下降不能单独吸烟31.支持这一进程遗传贡献的证据是相当可观的。除了众多研究证明肺功能的遗传其他健康人群,在人群哮喘肺功能的遗传率还支持重要的遗传贡献。例如,支气管扩张剂后的FEV遗传1./FVC在哥斯达黎加人中估计为15.4±6.6% (p = 0.001),随后对来自该人群的扩展家系的肺功能进行全基因组连锁分析,确定了支气管扩张剂后FEV的适度连锁1./非吸烟者6p染色体上的FVC32.在第二哮喘群体中也检测到包括VEGF基因座的该区域的连接。33可以想象,VEGF基因座的遗传变异促成了这些连锁结果。
哮喘患者的支气管活检标本显示增加的基底膜增厚,并且当与健康对照组增加血管34几项研究表明,吸入糖皮质激素治疗后,这些病理变化减轻7.,34根据这些观察结果,本研究作者测试了吸入糖皮质激素对4周后肺功能的相互作用 吸入糖皮质激素治疗的年数。研究表明,吸入糖皮质激素治疗可在4岁时提高肺功能 以前的研究支持至少有一个SNP rs2146323等位基因拷贝的患者中的yrs。然而,本作者警告说,进行了药物遗传学分析后HOC在哥斯达黎加的队列研究中,这个结果是不适用的。因此,尚不清楚这些发现是否可以推广到其他人群。
与哮喘患者的关联不同,在群组中,在群组中注意到类似的遗传效应,RS4711750与FEV的关联1./在营地和哥斯达黎加部队中,植被覆盖处于相反的方向。在文献中还记载了其他一些“人字拖”的关联35–38.虽然可能代表两个假阳性关联,但是当遗传架构存在细微差异时,偶尔会注意这种触发器,这表明类型标记和非续签功能SNP之间的LD差异可以解释冲突的协会39.此触发器关联的其他可能的解释包括在两个群组之间上位相互作用基因 - 环境相互作用(在目前的分析未建模)在环境暴露的差异,或。
总之,就目前作者所知,这是两组轻度至中度持续性哮喘儿童中VEGF多态性基因的遗传变异首次与哮喘和气道反应性相关,提示VEGF多态性在哮喘发展中的作用研究还表明,在CAMP和哥斯达黎加队列中,VEGF多态性变异与肺功能的初步关联,尽管需要对该区域进行额外的精细定位,以及在其他人群中进行额外的复制研究,以解决注意到的方向性问题。如果肺功能的变化在未来的研究中得到证实,功能标记物可能作为潜在的生物标记物,用于识别易感个体,这些易感个体可能受益于针对VEGF通路的新疗法。
支持声明
儿童哮喘管理计划(CAMP)遗传学附属研究是由国家心脏,肺和血液研究所(NHLBI),美国国立卫生研究院(NIH资助U01 HL075419,U01 HL65899,P01 HL083069,R01 HL 086601,和T32 HL07427支持).B.A.芮捷锐是由NIH / NHLBI指导式一个临床科学家开发奖(K08 HL074193)的获得者。哮喘的哥斯达黎加研究遗传学是由美国国立卫生研究院支持/ NHLBI授予HL04370和HL66289。
利益陈述书
没有宣布。
致谢
目前的作者感谢所有受试者持续参与本研究。他们感谢由国家心肺血液研究所支持的CAMP研究人员和研究团队收集了CAMP遗传辅助研究数据。所有从CAMP遗传辅助研究中收集的数据都是在布里格姆和妇女医院的钱宁实验室在适当的CAMP政策和人体受试者保护下进行的。
脚注
本文可以使用补充材料www.www.qdcxjkg.com
- 已收到2008年7月23日。
- 认可的2009年1月5日。
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