摘要
原发性纤毛运动障碍(PCD)的诊断有时需要反复鼻刷以排除继发性纤毛改变。我们的目的是评估使用一种新的鼻上皮细胞培养方法是否可以在可疑病例中加速PCD的诊断,并通过多层人工神经网络(ANN)来确定哪些是最具信息量的参数。
对疑似PCD患者进行了横断面研究。所有患者均采用鼻刷法进行纤毛运动分析、超微结构评估及人工神经网络评价纤毛形成后的纤毛功能。
研究对象有151人。在117次鼻刷中获得了诊断悬浮细胞培养。36例受试者(其中29例为儿童)被诊断为PCD。在36名患者中,有9名患者在第二次刷牙后才做出诊断,因为第一次检查时两项测试的结果不明确。在这些受试者中,PCD的诊断由细胞培养结果证实。
通过神经网络评估悬浮细胞培养可以在培养5天后将PCD从继发性睫状体运动障碍患者中分离出来,并在可疑病例中进行诊断,从而避免了再次取样的必要性。
原发性睫状体运动障碍(PCD)是一种罕见的遗传性疾病,其特征为上、下呼吸道慢性感染[1,2],通常通过结合临床特征、独特的透射电子显微镜(TEM)图像、鼻刷活检的搏动频率和睫状体运动分析(CMA)模式来诊断[3.].在相对较少的患者中,这些测试是模棱两可的,有其他可用的测试,包括纤毛培养,纤毛蛋白免疫荧光和基因检测[4].偶尔需要更复杂的检测与以下事实有关:由于继发于感染或炎症的呼吸道上皮损伤,PCD的诊断可能很困难。此外,尽管睫状体搏动模式的改变强烈提示原发疾病,但超微结构表现可能是正常的[5].在这些患者中,辅助检测可能特别有价值。如果怀疑继发性损伤,通常建议在一段时间的抗生素和抗炎治疗后进行第二次刷牙,但即使采用这种策略,在≥5%的病例中,第二次刷牙可能无法诊断[1].或者,当CMA和TEM提供不明确的结果时,可以通过培养纤毛细胞来诊断PCD,因为在培养中纤毛发生后几乎没有任何二次损伤。成功的培养与人类呼吸道上皮纤毛发生有关,它发生在培养24-48小时后,聚集的细胞以球形的形式漂浮在培养基中。它们由一层维持细胞极性的呼吸上皮细胞组成,在没有PCD的受试者中,在其外表面表现出正常的搏动纤毛(在线补充视频剪辑1)。
如果培养后睫状体运动明显异常,则诊断为PCD [6].过去,培养主要是在鼻钳活检获得的细胞上进行[6,这是痛苦的。最近,我们证明了细胞培养可以直接从刷过的鼻腔上皮细胞中进行,从而减少了第二次和更多创伤性采样的需要[7].在我们简化的培养系统中,只有在悬浮培养的第21天,当新的纤毛已经明确形成时,才能评估纤毛活性。然而,由于材料数量有限,我们无法进行电子显微镜,这是PCD的关键诊断测试之一,这是该技术的一个弱点。因此,我们假设,在我们的简化培养系统中使用功能参数的软计算分析,即使没有结构分析,我们也可以准确诊断PCD,这仅在我们的单位(比萨大学医院儿科,比萨,意大利)平均2个月后可用。基于软计算的模型[8]使用诸如多层人工神经网络(ANNs)等方法,这些方法试图模仿人类思维,指示计算机处理不精确、不确定性和部分真相,并将所有数据纳入能够以类似于人脑的方式平衡精度和不确定性的算术算法[8].他们可以分析复杂的医疗数据,利用有意义的关系来帮助医生诊断、治疗和预测临床结果。
因此,本研究的第一个目的是确定悬浮培养中纤毛活性的精确评估本身是否可以在较短时间内使用刷毛鼻上皮细胞确诊PCD。该研究的次要目的是确定睫状体活性评估的哪些参数对明确诊断最有用。我们每5天评估培养物中不同的睫状体活性参数,然后在软计算分析的帮助下,评估我们是否能够区分最终诊断为PCD的患者与未诊断为PCD的患者。
材料与方法
主题
所有有临床病史及PCD征象的患者[2],如复发性上呼吸道和下呼吸道感染和/或反位、鼻窦炎和/或支气管扩张,于2009年1月至2011年1月在比萨大学儿科学系连续评估。在所有受试者中,当受试者无呼吸道感染≥4周时,根据标准方法,对鼻刷样品培养中纤毛发生后的纤毛进行CMA、纤毛超微结构评估和纤毛功能评估[9].所有受试者都在第一时间进行睫状体培养。因此,研究的顺序是刷毛和CMA,样品同时进行透射电镜和培养(图1).PCD和继发性纤毛运动障碍(SCD)的鉴别诊断是在TEM可用之前,通过鼻刷CMA和培养纤毛发生(即。不使用人工神经网络数据)。当TEM可用时,它被用作鉴别PCD和SCD的验证性试验。
如前所述,根据刷毛和培养的睫状体结构和/或功能异常来明确诊断PCD,其中考虑了搏动频率和模式[7].排除PCD并认为睫状体异常为获得性时,诊断为SCD。对于CMA和TEM首次评估结果不确定的受试者,在进行适当的抗生素和抗炎治疗后,约4个月后再次进行测试。从一开始,只有一名研究人员(F. Montemurro)在研究过程中没有参与任何临床决策,他知道细胞培养结果将用于神经网络检测。在研究结束和软计算评估之前,CMA也由首席研究员(M. Pifferi)进行。从每位成年患者和儿童的父母那里获得了对鼻刷的知情同意。当地医院伦理委员会(比萨大学医院)批准了该研究方案。
悬浮细胞培养
细胞培养按先前报道进行[7].简单地说,当聚集的细胞以球形的形式漂浮在介质中时,人类呼吸道上皮细胞纤毛发生。培养24-48小时后,用倒置显微镜(倒置显微镜TE2000-S;Nikon, Tokyo, Japan)在×60上进行观察,每5天对纤毛活性进行评估,直至培养第20天。诊断基于五个参数的观察,这些参数被认为是睫状体协调活性的表达,即。: 1)球体旋转(是或否);2)球体的迁移(是或否);3)纤毛清除碎片或红细胞的能力(是或否);4)正常运动型;(5)≥40%的观察区域为病理运动类型。正常的睫状体搏动模式或相反的病理模式,例如睫状体搏动频率降低,搏动幅度明显受限,睫状体运动模式僵硬[10],或异常的非柔韧搏动模式及多动搏动[11,可以很容易地识别。这些参数每5天评估一次,与最终诊断相关,作为一个二进制变量:0:缺席,1:存在,并通过ANN进行评估。
细胞培养结果的统计分析和软计算评价
基线变量以组均值±表示sd非正态分布时为中位数和四分位间距(IQR)。如前所述,在常规诊断途径的末端通过纤毛运动分析、TEM评价和培养中纤毛发生后的纤毛活性评价得到的诊断被接受为评估细胞培养悬液不同参数的金标准[7].
悬浮细胞培养睫状体活性评价参数及其阳性预测值(PPV和阴性预测值NPV)的敏感性和诊断PCD的特异性通过标准方程得到。所有统计计算均使用SPSS 18.0版本的Windows (SPSS, Chicago, IL, USA)个人电脑软件进行。
采用软计算建模方法对培养中纤毛发生期间的纤毛活性进行评估,以在TEM结果可用之前诊断PCD或SCD。在本研究中,采用多层神经网络对模型进行识别。这是一个生物大脑的数字化模型,可以检测到数据中因变量和自变量之间复杂的非线性关系,这是人类大脑可能无法检测到的[12].为了评估模型的时间依赖性诊断效率以预测最终诊断,在第5天、第10天、第15天和第20天应用了不同细胞培养特征(球体的旋转、球体的迁移、纤毛清除碎片的能力、正常纤毛搏动模式和病理纤毛搏动模式)的交互验证程序。关于细胞培养结果的软计算评估的进一步细节可在在线补充材料中获得。
结果
151名研究对象(图1).从117例鼻刷样本中获得了诊断有用的悬浮细胞培养(77.5%;男性65名,儿童91名,年龄1.5个月至57.0岁;151名受试者的中位年龄(IQR) 9.30(12.0)岁(所有详细信息见在线补充表S1)。23例(15.2%)患者的培养在前48小时内被感染,11例(7.3%)患者的培养不成功,要么是因为在刷牙的样本中缺乏细胞,要么是因为在整个培养期间在球体中没有发现纤毛。此外,由于只能获得少量样本,在117例患者中,9例(7.7%)和10例(8.5%)患者的悬浮细胞培养时间分别从通常的20天缩短为10天和15天。
纤毛运动分析(异常运动模式,包括不动纤毛和/或非常低的纤毛搏动频率)和对纤毛的透射电镜评估(中央对的改变和动力臂的缺陷,与一小部分膨胀的纤毛和复合纤毛相关)最终确定了36例(30.8%)受试者(29名儿童)的PCD。在36例患者中,有9例患者在第二次刷牙后才得到诊断,原因是1例患者的结果不明确,或8例患者在第一次检查时睫状体超微结构正常,但睫状体运动模式不灵活且多动(所有细节见在线补充表S2)。在这9名受试者中,在细胞培养结果获得任何TEM结果之前,强烈建议诊断PCD (表1)(网上补充视频剪辑2)。
其余81例(69.2%)患者(68例儿童)的纤毛运动分析显示,小部分纤毛异常,纤毛粗大,纤毛搏动频率低,与SCD一致(1例患者在经过强化和长时间抗生素治疗后第二次刷牙后发现继发性变化,但从培养中正确识别出SCD)。在这81例受试者中,TEM评估清楚地显示非特异性异常与慢性炎症(普遍存在肿胀纤毛和复合纤毛)。在所有这些患者中,先前的细胞培养结果都有力地提示了SCD的诊断。
此外,从…中可以看出表1在整个20天的悬浮细胞培养期间,睫状体活性评估显示,81例最终诊断为SCD的受试者中有64例(79%)的睫状体旋转,而36例PCD患者中只有1例(2.8%)的睫状体旋转(细胞培养开始10天后旋转一个球体)。在这个病人中,诊断由DNAH11复合杂合突变[11].81例SCD患者中有14例(17.3%)发现球体有迁移,但在无PCD患者中有,81例SCD患者中有6例(7.4%)发现纤毛有清除碎片的能力,而在无PCD患者中有。当检测到纤毛的持续运动,但没有观察到具有纤毛清除碎片能力的球体的移动或旋转时,81例SCD患者中有52例(64.2%)在CMA中观察到正常的纤毛搏动模式,但没有PCD患者。相比之下,36例PCD患者中有12例(33.3%)观察到病理性睫状体模式,但没有一例SCD患者(表1).特别是,在4名和8名受试者中分别检测到睫状体搏动频率降低,搏动幅度明显受限,睫状体运动模式僵硬或异常不灵活的搏动模式伴多动性搏动。
报道了PCD不同诊断参数的敏感性、特异性、ppv和npv表2.
考虑到5-20天范围内小球的旋转、小球的迁移、纤毛清除碎片的能力和纤毛运动的类型,基于ann的模型几乎能够在所有病例中确定最终诊断(PCD 99.5±0.3%;SCD 98.8±1.2%)。
此外,由于灵敏度和特异性的最佳组合是由球体的旋转证明的,因此分析了基于ann的模型正确区分PCD和SCD的能力,同时考虑了这一参数和其他三个参数。
正如在表3,当考虑到球体的旋转和睫状体运动类型时,该模型几乎在所有病例中都能正确识别PCD或SCD。从细胞培养的第5天开始就是这样。其他的组合则不那么准确。
讨论
该研究的主要发现是,通过鼻刷获得的细胞悬浮培养在大约80%的样本中是可能的,在我们手中,使用ann,这使得PCD从SCD分化在1周内,并且远早于TEM结果可用。
该研究的优势包括使用ann对数据进行客观分析,即。由计算机生成的数学算法。通过这种方法,我们已经能够识别两个参数,当结合在一起时,最准确的诊断(球体的旋转和睫状体运动类型)。仅在培养5天后,这些方法就被用于准确识别近95%的PCD患者。人工神经网络从标准数据中学习,并捕获数据中包含的知识。进一步的优点包括与钳活检相比,刷牙的相对无创伤性。起初,用于培养的细胞是通过创伤性更强的方法获得的,例如穿孔活检,这可能会引起疼痛和出血。穿孔活检也有缺点,与涂刷收集的细胞相比,需要更长的时间来建立细胞培养[7,13,14].然而,这种技术的优点是培养结果的产量高。穿孔活检和刷子活检的纤毛气液培养[14]的结果是培养出足够的纤毛组织,以便对纤毛进行电子显微镜观察,这在我们的简化技术中是不可能实现的,但该技术的成功率仅为54% [14不是这里的80%。然而,使用气液技术,在继发病变更严重的患者中,即在假阳性诊断风险更大的组中,培养成功率下降到26%,并且之前必须培养21天,增加了失败的风险[7].这种情况由于起始材料的缺乏而加剧,而起始材料往往在随后的段落中进一步减少。然而,目前的研究清楚地表明,长时间培养并不是诊断PCD的必要条件。
该研究的主要缺点是该技术无法进行透射电镜检查,但不同睫状体运动模式的ppv的准确率为98.5%,因此几乎可以对所有患者进行诊断。当然,TEM在诊断时(例如外动力蛋白臂缺陷)是一项重要的测试,但它不是金标准,因为PCD的病例具有正常的超微结构[5,11].我们的8名患者就是这种情况,他们从一开始就通过研究培养中的纤毛发生被正确地识别出来。尽管我们不能对用我们的简化技术培养的细胞进行电子显微镜检查,但软计算使我们能够在第二次刷牙前诊断PCD,并且在第一次刷牙后不到一周的时间内,在没有TEM检查的情况下,另外22%的患者无需第二次刷牙。考虑到悬浮培养中的球形上皮细胞在第一周失去纤毛,仅在1-2周后才发育出新的纤毛,结果令人惊讶[15].我们推测,在没有先天性缺陷的情况下,正常纤毛活性的恢复不需要形成完整的新纤毛,但可能是由于细胞基体和纤毛尖端之间蛋白质复合物的正常运输恢复正常的结果,这是纤毛组装、维持和功能所必需的[16].在这种情况下,值得注意的是,第二睫状体基因突变独联体可纠正由第一种引起的异常表型,奇怪的是有时并没有明显恢复缺失的子结构[17- - - - - -20.].我们建议将光学采集和软计算算法集成到一个专用系统中,将允许快速获得随时间变化的细胞培养结果的评估,从而节省成本。因此,瞬变电磁法将成为一种确认工具,因为获得结果的时间很长。
理想情况下,我们将在第二组患者中验证这些发现,但需要相当长的时间才能产生足够多的新患者。然而,该网络是根据n倍交叉验证方法验证的。交叉验证是估计模型在未见数据上的性能的几种方法之一。在n次交叉验证中,原始数据集被随机划分(分裂)为n个子集。对于每个交叉验证步骤,保留一个子集作为验证集(或测试集),即。验证队列),其余n-1个子子集作为训练集。然后,交叉验证过程重复n次,n个子集中的每一个都只使用一次作为测试集。然后,折叠的n个结果可以被平均(或以其他方式组合)以产生单个估计。在我们的工作中,应用了5次交叉验证过程,对第5、10、15和20天的不同细胞培养特征进行了验证;每个折叠由随机选择的数据组成,每个折叠中至少包含一个类别指数。我们认为这种交叉验证是非常稳健的;这比仅仅将队列分成两半,其中一半作为发现队列,另一半用于验证队列要好得多。
我们的研究表明PCD是罕见且难以诊断的,在可疑病例中可能需要重复检测[21,22].问题包括,首先,TEM变化可能是继发于环境粘膜损伤,如炎症和细菌或病毒感染、过敏和吸烟[23],或因标本的处理不当而产生[24];第二,在少数不动纤毛患者中,纤毛超微结构可能正常或接近正常[25- - - - - -28].在这方面,最近讨论了确定金标准诊断的复杂性[4].我们相信这项新技术将使可疑病例的诊断大大容易。
如果诊断存在疑问,确定致病基因突变将是理想的,就像我们的非常非典型PCD患者的球体旋转一样,但PCD是一种遗传异质性疾病,超过250个潜在的候选基因已被确定[29].此外,遗传学研究存在区分致病突变和无害多态性的问题。其他调查,如鼻腔一氧化氮是诊断过程的一部分[30.],但在罕见的PCD患者中可能是正常的,而在患有其他疾病(如上呼吸道感染和囊性纤维化)的患者中则较低[31].在这些具有挑战性的环境下,纤毛细胞的培养是非常有用的,因为在培养中纤毛上皮细胞再生后几乎没有继发性变化,而原发性缺陷保持不变[32,33].
综上所述,使用简单的培养技术和ann的使用[34]为PCD与继发性纤毛运动障碍的可靠鉴别提供了新的机会。
致谢
我们要感谢P. Macchia(意大利比萨大学医院儿科),感谢他在睫体运动障碍患者研究方面的不断鼓励和支持,以及他在组织这种疾病的门诊和住院诊所方面所做的努力。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.www.qdcxjkg.com
支持声明
这个项目是由国家卫生研究院呼吸疾病生物医学研究组在皇家布朗普顿和Harefield NHS基金会信托而且伦敦帝国理工学院(伦敦,英国)和由卡洛·拉维奥萨基金会.
权益声明书
没有宣布。
- 收到了2012年3月4日。
- 接受2012年8月2日。
- ©2013人队