抽象的
诊断原发性睫状体(PCD)有时需要重复的鼻刷以排除二次睫状体改变。我们的目的是评估使用一种新的鼻上皮细胞培养方法是否可以在怀疑的情况下速度速度诊断并通过多层人工神经网络(ANN)来确定哪个是最佳的参数。
涉嫌PCD患者进行横截面研究。所有患者均接受鼻刷的睫状运动分析,超微结构评估和筛选后综合函数的评价。
研究了151名受试者。在117个鼻胶凝中获得诊断悬浮细胞培养物。PCD的诊断是在36个科目中进行的(其中29名儿童)。在36例患者中,仅在第二次刷牙后诊断,因为在第一次检查时两种测试的结果也是如此。在这些受试者中,通过细胞培养结果证实了PCD的诊断。
通过ANN评估悬浮液中的细胞培养物允许在仅5天的培养后从继发性患者中分离PCD,并允许在可疑的情况下达到诊断,从而避免了第二个样本的必要性。
原发性睫状体运动障碍(PCD),一种罕见的遗传性疾病,以上、下气道慢性感染为特征[1那2]通常通过临床特征的组合诊断出与鼻刷活组织检查的独特透射电子显微镜(TEM)图像和睫状运动分析(CMA)的频率和模式的频率和模式[3.].在相对较少的患者中,这些试验的患者等离异性,还有其他测试,包括睫状培养,睫状蛋白免疫荧光和遗传检测[4.].偶尔需要更复杂的测试是有关的,因为由于感染或炎症的呼吸上皮损伤,PCD的诊断可能是困难的。此外,尽管睫状搏动模式的改变强烈暗示着原发性疾病,超微结构发现可能是正常的。5.].在这些患者中,辅助测试可能特别有价值。如果怀疑次要损害,通常建议在抗生素和抗炎治疗期后推荐第二个样品,但即使通过这种策略,第二次刷牙可能不会诊断≥5%的病例[1].或者,当CMA和TEM提供等焦发现时,可以随着纤毛细胞的培养而达到PCD诊断,因为在培养物中含有纤西发生后几乎不存在。成功的培养物与人呼吸上皮的纤西发生有关,当聚集的细胞浮过球状体形式的培养基时,在培养的24-48小时后发生。这些由一层呼吸上皮细胞组成,其维持细胞极性,并且在没有PCD的受试者中,在其外表面上表现出正常的击打纤毛(在线补充视频剪辑1)。
如果在培养后坦率地区的睫状运动模式仍然存在诊断是PCD [6.].在过去,培养物主要对鼻钳活检获得的细胞进行[6.,这很痛苦。最近,我们已经证明了直接从刷状鼻上皮细胞中培养细胞是可能的,从而减少了第二次和更创伤性取样的需要[7.].通过我们的简化文化系统,当新的纤毛形成肯定发生时,才能在第21天的悬浮培养物中进行评估。然而,由于材料的数量有限,我们无法进行电子显微镜,PCD中的一个关键诊断测试之一,这是该技术的弱点。因此,我们假设,使用我们的简化文化系统中功能参数的软计算分析,我们可以准确诊断PCD,即使没有结构分析,才能在我们的单位(PISA大学,比萨斯,意大利大学医院的Dept of Pisa,Pisa,意大利)平均时间为2个月。基于软计算的模型[8.]使用多层人工神经网络(ANN)等方法,该方法试图模仿人类的思想,指示计算机处理不确定,不确定性和部分真理,并包括能够平衡精度和不确定性的算术算法中的所有数据以类似于人脑的方式[8.].他们可以分析复杂的医疗数据,利用有意义的关系来帮助医生诊断、治疗和预测临床结果。
因此,本研究的首次目的是确定悬浮培养中睫状体活性的精确评价本身可以通过刷牙鼻上皮细胞在较短的时间内能够在较短的时间内坚定地诊断PCD。该研究的二次目的是鉴定睫状体活性评估的参数对于最终诊断最有用。我们评估,每5天,不同睫状体活性参数在培养物中,随后,在软计算分析的帮助下,我们评估了我们是否可以将患者区分患者在没有PCD的情况下从受试者那里诊断PCD。
材料和方法
主题
所有有PCD临床病史和体征的患者[2]例如,在比萨大学的儿科部门的2009年1月和2011年1月间,连续评估诸如复发性上呼吸道感染和/或存在的体内逆血,鼻窦炎和/或支气管入学。在所有受试者中,根据标准方法进行患有鼻腔刷样样品培养后的纤毛菌和睫状体函数的超微结构评估,当受试者没有呼吸道感染≥4周[9.].睫状体培养物在第一场所的所有受试者中进行。因此,研究的序列是刷涂和CMA,以及TEM和培养的样品(无花果。1)。PCD和次级睫状体缺陷(SCD)之间的差异诊断是在TEM通过CMA获得的鼻胶带和文化中的纤西发生之前进行的(IE。不使用ANN数据)。当TEM变得可用时,它被用作识别测试,以区分PCD和SCD。
在刷牙和文化的结构和/或功能性睫状体异常的基础上进行PCD的确定诊断,这是刷新和培养的,这考虑了拍频和模式,如前所述[7.].当PCD被排除并被排除并且睫状体异常被视为获得时,制造了SCD的诊断。在具有CMA和TEM的第一次评估的具有不确定结果的受试者中,在适当的抗生素和抗炎治疗之后,在4个月后重复测试。从一开始,在任何临床决策中,只有一个没有参与的一个调查员(F. Montemurro),意识到细胞培养结果,这将用于ANN确定。在研究结束时以及软计算评估前,CMA也由主要调查员(M. PIFFERI)进行。鼻刷的知情同意是从每个成年患者和儿童父母获得的。地方医院道德委员会(比萨大学医院)批准了研究方案。
细胞悬浮培养
如前所述进行细胞培养物[7.].简而言之,当聚集的细胞漂浮通过球状体形式的介质时,发生人呼吸上皮的纤西发生。使用逆显微镜(倒置显微镜TE2000-S; in = 60的培养物(倒置显微镜TE2000-S; X 60)的培养物后鉴定了球状体并每5天进行睫状体活性的评估,直至培养的第20天。诊断基于对五个参数的观察,被认为是协调睫状体活性的表达,IE。:1)旋转球体(是或否);2)迁移球状体(是或否);3)纤毛去除碎片或红细胞的能力(是或否);4)正常运动类型;5)如果发现≥40%的观察领域,则病理运动类型。通过对比度,普通睫状拍图案,或者,通过对比,例如减少的睫毛搏动频率,具有明显受限的节拍幅度和僵硬的纤毛运动模式[10.,或一种异常的、不灵活的跳动模式,伴有多动性跳动[11.],可以很容易地识别。这些参数每5天评估每5天,与最终诊断为二元变量:0:缺席,1:由ANN的存在和评估。
细胞培养结果的统计分析和软计算评价
基线变量表示为群体±SD.或在变量非正态分布时作为中位数和四分位范围(IQR)。通过睫状运动分析、TEM评估和培养中纤毛发生后的纤毛活动评估,在通常诊断路径的末端获得的诊断被接受为评价细胞培养悬液不同参数的金标准[7.].
使用标准方程产生对悬浮细胞培养的睫状活性评价的睫状活性评价的参数PCD的敏感性和特异性。使用标准方程产生悬浮细胞培养物的阳性和阴性预测值(PPV和NPV)。所有统计计算都是使用SPSS版本18.0软件进行个人计算机的Windows(SPSS,Chicago,IL,USA)进行。
在TEM可用的结果之前,将软计算模拟方法应用于培养中的纤西发生期间的纤毛组合,以进行PCD或SCD的诊断。在该研究中,通过多层ANN识别模型。这是生物脑的数字化模型,可以检测受抚养人之间的复杂非线性关系以及数据中的独立变量,人类大脑可能无法检测到[12.].为了评估的时间诊断效率模型来预测最后的诊断,交叉验证过程的不同细胞培养特性(球状体的旋转,球状体的迁移,纤毛的清除能力碎片,正常的纤毛击败模式和病理纤毛击败模式)在天5,10,15和20。关于细胞培养结果的软计算评估的进一步细节可在在线补充材料中找到。
结果
151名研究对象(无花果。1)。从117中的鼻刷样品获得诊断上有用的悬浮细胞培养物(77.5%; 65名男性,91名儿童,年龄范围1.5个月至57.0岁;中位年龄(IQR)9.30(12.0)年(12.0)年)中有151名科目(所有细节显示在线补充表S1)。在23例(15.2%)患者中,培养物在前48小时内感染,11(7.3%)受试者培养不成功,无论是缺乏刷子样品中的细胞,还是因为在球状体中没有发现纤毛在整个文化时期。此外,由于只能获得一个小样品,所以悬浮液中细胞培养的持续时间通常为20天,分别在117名患者中分别降低至10和15天(7.7%)和10(8.5%)。
纤毛运动分析(异常的运动模式,包括不动纤毛和/或非常低的纤毛跳动频率)和纤毛的TEM评估(中央对的改变和动力蛋白臂的缺陷,36例(30.8%)受试者(29例儿童)最终确诊为PCD。在九36例,诊断后才获得了第二个刷因为模棱两可的结果在一个主题或正常的纤毛超微结构的存在和刚性的运动机能亢进的纤毛运动模式在八个科目在第一次考试(所有细节在线补充表S2)所示。在这九名受试者中,PCD的诊断在细胞培养结果获得TEM结果之前被强烈建议(表格1)(在线补充视频剪辑2)。
在剩下的81例(69.2%)患者(68名儿童)中,睫状体运动分析表现出含有小比例的异常模式,厚纤毛的患病率和低睫状搏动频率,与SCD相容(仅在一个患者中发现二次变化之后用抗生素密集和长时间治疗后的第二种刷牙,但是从培养物中正确鉴定了SCD)。在这些81个受试者中,TEM评估清楚地显示出与慢性炎症相容的非特异性异常(肿胀的纤毛和复合纤毛的患病率)。在所有这些患者中,通过细胞培养物的先前结果强大地提出了SCD的诊断。
而且,可以看出表格1,在整个20天的悬浮细胞培养期间,睫状活性评价,在81个(79%)受试者中的64个止血剂中旋转了64个受试者,最终诊断SCD,只有36个(2.8%)PCD患者(在细胞培养物开始后10天旋转一个球形)。在这个患者中,诊断得到了确认dnah11复合杂合突变[11.].在81名受试者中,24(17.3%)中发现了球状体的迁移,但在没有PCD患者,玉米患者能够用SCD和PCD的81名受试者中的六(7.4%)除去葡萄酒。当检测到纤毛的连续运动但没有观察到具有纤毛以除去碎片的纤毛的球体的迁移或旋转,在81个受试者中,在CMA中观察到正常的睫状体搏动模式,其中81个受试者的SCD,但没有PCD的病人。相比之下,在这些PCD患者中的36例中有12名(33.3%),但在没有SCD中,观察到病理睫状体图案(表格1)。特别地,在四个和八个受试者中,检测到具有明显限制的节拍幅度和具有较硬的睫状体运动模式或具有高kkinetic搏动的异常非弯曲的纤维运动模式的减少的纤毛搏动频率。
报道了PCD诊断的不同参数的敏感性,特异性,PPV和NPV表2.。
考虑到球状体的旋转,割光球体的迁移,纤毛的能力除去5-20天的碎屑和睫状运动的类型,基于安基尔的模型能够识别几乎所有病例的最终诊断(PCD 99.5±0.3%; SCD 98.8±1.2%)。
此外,由于旋转球状体的旋转来证明最佳敏感性和特异性的最佳组合,分析了通过基于ANN的模型正确地区分PCD的能力,同时考虑到该参数与其他三个的每个参数。
在报道表3,该模型能够在考虑球状体的旋转和睫状运动的类型时,在几乎所有情况下正确识别PCD或SCD。这是细胞培养的第5天真实。其他组合的准确性不太准确。
讨论
该研究的主要发现是,在鼻刷悬浮细胞中的培养是可以在约80%的样品中获得的,并且在我们手中使用ANNS,这允许在1周内将PCD的分化为SCD,并且以前均匀TEM结果可用。
研究的优势包括使用ANN的目标分析数据,IE。通过计算机生成的数学算法。通过这种方法,我们已经能够识别两个参数,该参数在组合时是最具诊断性准确的(球状体与睫状运动的类型旋转)。这些已被用于在仅5天的文化之后准确地识别近95%的PCD患者。ANNS从标准数据中学习并捕获数据中包含的知识。与钳子活组织检查相比,进一步的强度包括刷子的相对无创伤性质。最初,用更多的创伤方法获得培养细胞,例如冲头活检,这可能导致疼痛和出血。冲头活检还具有需要更长的时间建立细胞培养的缺点与通过刷涂收集的细胞[7.那13.那14.].然而,该技术具有高产培养结果的优点。来自冲床和刷子活组织检查的纤毛的空气液体培养物[14.]的结果是培养足够的纤毛组织,以允许纤毛的电子显微镜观察,这在我们的简化技术中是不可能的,但该技术的成功率只有54% [14.]没有80%,在这里。然而,随着空气液体技术,患者的培养成功率降至26%,患者患者更严重的次要变化,即在伪阳性诊断的风险更有可能和之前的细胞中必须培养21天,增加失败的风险[7.].这是通过起始材料的缺乏加剧,这在随后的通道中倾向于进一步减少。然而,本研究清楚地表明,长期的文化是不需要进行PCD的诊断。
该研究的主要弱点是TEM是不可能的这种技术,但不同睫状体运动模式的PPV导致> 98.5%的精度,从而允许几乎所有患者的诊断。当然,TEM,当诊断(例如,外部Dynein Arm缺陷)是一个重要的测试,但它不是金标准,因为具有正常超微结构的PCD的病例良好描述了[5.那11.].这是我们八个患者中的案子,从培养中的纤西生成的研究中被正确识别。尽管我们不能对通过我们简化技术培养的细胞进行电子显微镜,但软计算允许我们在第二次刷牙之前诊断PCD,并且在额外22%的患者中没有TEM在第一个鼻刷的一周内较少,没有诉诸第二次刷牙。结果令人惊讶,因为在第一周悬浮培养中的上皮细胞的球体失去纤毛,并且仅在1-2周进一步发育新的纤毛[15.].我们推测恢复正常睫状体活性,在没有先天性缺陷的情况下,不需要形成完整的新纤毛,但可能由于细胞基体与纤毛之间的正常贩运蛋白质复合物的正常流动而发生提示根据纤毛的装配,维护和功能所需[16.].在这种情况下,值得注意的是,第二睫状基因突变CIS.可以纠正第一个,好奇地造成的异常表型,有时有时候,没有明显恢复缺失的子结构[17.-20.].我们建议光学获取和软计算算法的专用系统中的集成将允许评估时间依赖的细胞培养结果迅速获得,从而节省成本。因此,在获得结果的延迟延迟时,TEM将成为一个确认工具。
理想情况下,我们将在第二次患者队列中验证这些调查结果,但它会产生足够多的新患者需要相当长的时间。但是,根据n倍交叉验证方法验证网络。交叉验证是用于估算未经证明数据模型的性能的几种方法之一。在N倍交叉验证中,原始数据集随机分区(拆分)进入N个子集。对于每个交叉验证步骤,将单个子集保留为验证集(或测试集,IE。验证队列),剩余的N-1子子集用作训练集。然后重复交叉验证过程n次,每个N子集合用一旦作为测试集使用一次。然后,折叠的N结果可以平均(或以其他方式组合)以产生单个估计。在我们的作品中,应用了在第5,10,15和20天的不同细胞培养特征的五倍的交叉验证过程;每个折叠由随机选择的数据组成,并且每个类别索引至少一个包含在每个折索引中。我们认为这种交叉验证非常强大;比仅仅使用一半作为发现队列和一个用于验证的一半仅将队列分成一半。
我们研究的含义是PCD很少且难以诊断,并且可能需要重复测试在令人怀疑的情况下[21.那22.].首先,问题包括,TEM变化可能是次要的环境粘膜损伤,例如炎症和细菌或病毒感染,过敏和吸烟[23.],或者可能是不恰当的标本制备[24.];其次,在少数患有Immotile纤毛的患者中,睫状体超微结构可能是正常的或接近正常的[25.-28.].在这方面,确定金标准诊断的复杂性最近被讨论[4.].我们认为这种新技术将在令人怀疑的情况下诊断显着更容易。
如果有诊断疑问,鉴定致病性遗传突变将是理想的,如我们非常非典型的PCD患者在具有旋转球状体的旋转,但PCD是遗传异质疾病,已经确定了超过250个潜在的候选基因[29.].此外,遗传学研究具有区分疾病产生免受无害多态性的问题。诸如鼻氮氧化氮的其他研究是诊断过程的一部分[30.],但在罕见的患者中可能是正常的PCD和低受试者的患者,如上呼吸道感染和囊性纤维化的其他疾病[31.].在这些挑战性的情况下,纤毛细胞的培养非常有帮助,因为在培养的纤毛上皮的再生后几乎不存在二次变化,而原发性缺陷保持不变[32.那33.].
总之,使用简单的培养技术与ANNS的使用一起[34.为PCD与继发性睫状运动障碍的可靠鉴别提供了新的机会。
致谢
我们要感谢P. Macchia(Pisa大学,意大利PISA,意大利大学医院),以便在睫状体障碍患者研究中的持续鼓励和支持,并在组织外关诊所的努力这种疾病。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.www.qdcxjkg.com.
支持声明
该项目得到了支持的支持NIHR呼吸疾病生物医学研究单位在皇家布朗普顿和哈菲尔德国民保健服务基金会信托和伦敦帝国理工学院(伦敦,英国)和由此Fondazione Carlo Laviosa.。
兴趣表
没有宣布。
- 收到了2012年3月4日。
- 公认2012年8月2日。
- ©2013人队