文摘
囊性纤维化(CF)是一种隐性遗传疾病,特点是气道粘液堵塞和减少粘液清除。目前替代假说,试图描述异常的粘性和弹性粘液CF呼吸道疾病的特征,包括:1)失去了CF跨膜调节器(雌性生殖道端依赖气道表面体积(水)分泌,产生粘液hyperconcentration-dependent粘度增加,和2)受损的碳酸氢盐分泌雌性生殖道,生产酸化气道表面和粘液粘度增加。
进行了一系列的实验来确定粘液浓度的贡献与pH值的流变特性气道粘液从纳米尺度到宏观长度。
长度尺度大于纳米,即。那些有关黏膜纤毛的清除,粘液浓度的影响主要在气道酸化的影响。
粘液的水合作用和化学还原二硫键连接粘蛋白单体比alkalisation更有前途的治疗方法。
文摘
超过长度尺度大于筛孔尺寸的粘蛋白聚合物网络的粘液,浓度、pH值,主导粘液的物理性质与囊性纤维化相关呼吸道疾病http://ow.ly/K92u30m2RDC
介绍
气道表面液体(ASL)保护肺从机载环境刺激和感染。的美国手语是由periciliary层(PCL)和黏液层。PCL是接枝聚合物刷的拴在黏蛋白和其他高分子量糖蛋白,它提供:1)润滑纤毛击败和黏液层运输,和2)尺寸排除障碍1]。黏液层粘弹性流体组成的超过1000种不同的蛋白质(2),包括两个分泌黏蛋白、MUC5B和MUC5AC [3),粘液其凝胶状特性(3]。美国手语的两层共同协调陷阱和清除肺吸入的病原体通过黏膜纤毛的运输(MCT)。
完善,囊性纤维化(CF)气道粘液异常的流变特性,包括粘度和弹性数量级高于正常粘液(1,4- - - - - -10]。目前替代假设描述病态粘弹性的起源在CF粘液。一个假设预测受损阴离子CF跨膜运输监管机构(雌性生殖道),耦合持续钠吸收,减少气道表面离子含量(5]。减少钠(Na+)和氯(Cl−)气道表面离子耦合减少水流气道腔,脱水的美国手语,黏液层,集中和生产异常粘液粘弹性性质和渗透压力(1,11]。竞争假说认为有缺陷的雌性生殖道未能传输重碳酸盐(HCO3−美国手语)气道表面,酸化。合成减少黏液层pH值预计扰乱黏液层的流变特性和损害间隙12- - - - - -14]。
粘液是一个柔软的水凝胶组成的高分子量聚合物粘蛋白等张溶剂。黏蛋白浓度和分子量的黏液层定义相邻之间的平均距离粘蛋白聚合物在溶液中,即。相关长度。证据表明浓度深刻影响气道粘液生物物理特性出现了从最近的粘液渗透压力和microbead流变学测量采用探针直径200纳米至2µm [1,8,11,15]。pH值的证据对CF黏液凝胶粘度的影响源自荧光光漂白后恢复(收紧)粘液使用探针直径小于10纳米的研究(13]。由于长度尺度粘液的流变特性16- - - - - -18),是不可能比较粘液粘度测量直接与不同大小的探测器。的5-nm纳米探针在收紧就业协议(13分散在溶剂粘蛋白分子之间的空间,而大颗粒用于microbead流变学检测探针聚合物粘蛋白网络。我们提出,粘液宏观流变特性与MCT比纳米相关措施。
因此,研究进行衡量粘液浓度的影响与pH值粘液性质在不同长度尺度和运输。研究缓冲容量的粘液浓度的函数首先表现(见补充材料)。接下来,pH值和粘液浓度粘液粘度测量收紧。生物物理测量长度尺度相关的黏液凝胶,如。传统microrheology microbead流变学和粒子比粘液相关长度,收紧的比较进行了测量。模型猪胃粘蛋白(PGM),牛颔下粘蛋白(BSM),和人类支气管上皮细胞(HBE)粘液从正常和CF文化都用于研究探索:1)pH值范围,超过了正常和CF气道粘液,和2)粘液浓度,正常与CF粘液。pH值变化的影响与浓度HBE MCT利率直接比较。测试的相关性在体外粘液疾病样本,浓度,小灵通和CF的粘弹性性质痰测量和相关性分析。最后,三个治疗策略旨在恢复的功效粘液粘弹性性质,如。粘液水化,alkalisation和化学还原(即。黏液溶解的),进行了比较。
方法
粘液样本准备如前所述[19,20.),与缓冲容量测量执行所述其他地方(21- - - - - -23]。自发的痰样本收集详细之前(11,24]。详细方法池的痰样本给出补充材料。粘液nanorheology与收紧化验了24),microrheology化验进行1-µm COOH-modified珠子直径的粒子追踪microrheology (8)和锥板宏观流变学进行了如前所述[7,25),确保在线性粘弹性测量制度(补充材料)。渗透压,PCL高度和其特定的测量进行了如前所述[1,26]。HBE细胞培养和粘液从HBE细胞培养被认为非人类受试者在北卡罗来纳州的生物医学研究伦理制度审查委员会办公室协议03 - 1396;痰液样本收集协议下15 - 2431。看到补充材料的详细方法。
结果
生物物理测量
荧光光漂白后恢复
生物物理测量复杂的液体如粘液必须根据有关(见生物问题补充材料更多的细节)。收紧测量使用∼5-nm葡聚糖分子HBE粘液和不同浓度来确定纳米的CF痰,间质粘液的流变学(图1一个)。在这两个示例类型,小分子的扩散是线性依赖于黏液凝胶的浓度以恒定的pH值7.2 (图1 b)。为τANCOVA回归行上执行粘液/τ生理盐水(相当于样品的粘度的比率除以盐水粘度)与%固体HBE粘液和CF痰透露,每个样本类型表现出显著(p < 0.01)和类似的相关性(p = 0.4,无意义的)粘液浓度(n = 3 /浓度)。这些数据表明,HBE粘液是一个可靠的代理研究浓度FRAP-measured CF痰液的粘度。
第二组实验研究了pH值对FRAP-measured HBE粘液粘度和CF痰以恒定浓度。几乎没有证据表明二氧化碳(有限公司2在HBE) tension-dependent FRAP-measured粘度影响观察粘液(n = 14) (图1 c)。在原始CF痰(9%固体),收紧恢复时间的增加的趋势(代理的粘度增加纳米长度尺度)观察与酸化产生的15%的股份有限公司2(p = 0.19;n = 7) (图1 d)。区分是否pH值对收紧的影响反映了影响溶剂或粘蛋白聚合物基质中,痰是过滤去除粘蛋白聚合物矩阵(补充材料)。过滤后的痰液上层清液表现出显著(p = 0.012;n = 9)收紧增加恢复时间有限公司15%2相似的模式,整个痰(图1 e)。因此,5-nm收紧调查报道粘液粘度的溶剂的组成部分,不是高分子凝胶。比较的HBE粘液的构成和CF痰,我们的研究结果表明,炎症蛋白质生成的在活的有机体内CF学科,缺席HBE粘液(2),可能是负责观察pH-dependent粘度的变化。
Microbead流变学
Microbead流变学是一种行之有效的技术能够探测长度尺度聚合物网络的黏液凝胶(18]。在PGM研究,增加2.5倍粘蛋白浓度产生珠平均平方位移减少5倍(MSD)在每个指定的pH值(1图2一个)。相比之下,pH值的变化范围在100倍(pH值6 - 8)仅温和(1.5倍)影响并在1 s (图2一个)在粘蛋白浓度。BSM的平行流变学的研究显示出类似的结果(图2 b)。值得注意的是,HBE粘液展出最依赖浓度和pH值最小(图2 c)。MSD 1-μm珠子镶嵌在正常HBE粘液减少10倍MSD展出在回答1.5倍2.5倍浓度的增加而减少MSD的质子浓度100倍增加。一个几乎相同的结果在CF HBE粘液(图2 d)。双向方差分析的分析并在1 s显示非常重要microbead流变学之间的关系对浓度(p < 0.01为所有样本;n = 3 /粘液类型),而统计学意义缺席在pH值范围内调查(p > 0.05)。
宏观流变学
或散装,宏观流变特性相关的粘液通常从肺部清除粘液(27- - - - - -29日]。浓度和pH值已经被证明能够影响粘液的流变性质在这些最大长度尺度(20.,30.- - - - - -32]。图3显示粘液浓度的相对影响与pH值的复杂的粘度的PGM, BSM HBE粘液。在50毫克的PGM·毫升−1展出的粘度> 10倍高于20 mg·毫升−1。相比之下,在20毫克的PGM·毫升−1表现出一个复杂的粘度,并没有改变系统之间的pH值6和8 (图3一)。BSM也表现出较大的浓度粘度,如。20.与50 mg·毫升−1,pH值的依赖(图3 b)。对气道粘液,复杂的4%固体HBE粘液粘度是6 - 10倍高于2%固体HBE粘液又小系统pH值依赖(图3 c)。类似的模式也被发现在CF HBE粘液(图3 d)。双向方差分析显示,浓度显著改变宏观流变学的粘液类型(p < 0.05),而pH值显示没有影响(p > > 0.05;n = 3 /粘液类型、浓度和pH值)。因此,所有粘液样本的结果是,不同浓度的粘液粘度显著改变了复杂,而pH值没有变化。值得注意的是只有在pH < 5,重要的粘度变化20 mg·毫升−1PGM粘液观察,与以前的结果一致埃利-et al。(20.)(补充材料)。
渗透压和PCL高度
气道表面被两排添凝胶层:1)包含分泌的黏液层MUC5AC和MUC5B黏蛋白,和2)我们PCL包含拴在粘蛋白(如。MUC1 MUC4和MUC16)和其他glycoconjugates [1]。我们以前报道HBE粘液浓度/ PCL高度和减少渗透与压力有关的MCT (24]。我们选择研究产生的粘液浓度减少PCL高度测试减少粘液渗透压和PCL高度是否修改博士改变粘液酸度范围从8 - 6没有改变渗透压的集中(6.5%固体)黏液层(p≥0.14每个pH值之间的配对t检验)(图4一)。符合缺乏pH值对渗透压的影响,PCL的高度也不受不同pH值超过这个范围(p≥0.11之间pH值配对t检验)(图4一)。注意,PCL高度与正常∼7µm粘液浓度。
黏膜纤毛的运输
特定措施的综合活动纤毛击败和粘液性质。测量MCT HBE文化中识别特定的基准利率在这些文化的初始部分实验∼60µm·s−1。一个代表性的实验表明,增加CO的浓度2从5%到15%在腔的环境中生产减少黏液层从7.2到6.6的pH值超过5分钟(图4 b)。然而,这种降低pH值没有产生显著改变粘液运输速度。相比之下,当粘液的浓度从2.8%提高到12.6%,去除环境室的湿度,MCT停止。平均值的pH值的影响与在特定浓度(图4 c)表明,微macrorheology测量,粘液浓度(p < < 0.05),而不是pH值(p > > 0.05;n = 4 - 12),主导其特定利率。
测试治疗策略正常化CF痰粘弹性性质
产生足够的材料系统的治疗药物的研究,四个痰样本汇集和单一化钝蛋白质水解蛋白酶抑制剂的存在。这池股票相似浓度、pH值、流变学样本组作为一个整体(补充材料)。混合样品的浓度(5.2%)模仿所有CF痰样品的平均浓度(5.6%)。整除汇集痰的水分2.6%模仿粘液的影响水化器(33,34),然后整除痰在2.6%和5.2%浓度的调整pH值6,7,8 - CF痰上测试调节pH值的影响。
稀释2倍(保湿)粘液从5.2%到2.6%复粘度降低了8倍。相比之下,100倍的pH值范围的影响很小,即。∼2倍的变化复杂的粘度(图5 c)。重要的是,增加酸度5.2%的CF痰从6到8导致复杂的粘度大于酸性最强的痰样本浓度2.6% (图5 c)。因此,针对水化疗法可能会产生更有利的CF痰粘度比调制的pH值的变化。
最后,减少粘蛋白二硫键的效果进行了测试。我们选择减少粘液与二硫苏糖醇(德勤)而不是DNase因为它曾被证明有更大影响痰液流变学(35]。正常HBE粘液准备5%固体模仿CF痰和减少1到10毫米德勤与PBS的控制。这些数据(图5 d)表明,减少链接粘蛋白的二硫键的单体在聚合物大分子有粘液的流变特性的影响大于pH值,即。表现出类似于减少浓度产生影响。这个结果被减少5%模仿汇集CF痰与10毫米德勤(图5 e)。
讨论
CF呼吸道疾病的特点是高度粘性气道黏液导致粘液瘀,炎症、慢性感染和损伤气道壁。测试当前的假设可能占CF粘液粘度的增加,即。粘液酸化(13]与浓度(1,8,11,15),每个变量测量模型的相对影响粘液系统(PGM和BSM)、正常和CF HBE粘液,CF痰。
pH值范围内观察到的人类呼吸道粘液(36,37)比在其他器官的粘液窄得多,通常研究pH值来描述影响粘液性质,如。子宫颈内膜(32)或胃(20.]。正常的人类呼吸道粘液的pH值范围是pH值7.0∼-7.2。目前尚不清楚有多少降低粘液的pH值在CF航空。CF气道上皮文化和CF动物模型展览可能0.4∼pH值低于正常的气道粘液,即。∼pH值6.8 [36,38]。pH值最低的CF气道粘液是从研究报道的pH值黏脓性的材料包含在肺切除CF和pH值6.637]。然而,最近在活的有机体内数据描述了小差异大气道CF的pH值与正常新生儿(39]。我们的策略来解决所有可能的CF粘液pH值与浓度张成的场景是开发协议:1)pH值范围相关的CF (pH值6 - 8)和粘液从其他器官(pH值4 - 8),和2)粘液浓度从正常(2%固体)和CF科目固体(> 5%)(11]。
黏液凝胶是由高分子量粘蛋白聚合物溶解在一种手语溶剂。集中报道的正常和病变的粘液,粘液素聚合物在“重叠”的浓度,即粘蛋白聚合物渗透。粘蛋白聚合物在重叠条件下通常表现出粘弹性属性(如。粘度、弹性(40)这种规模的几何与浓度。相关长度ξ,即。网格大小由穿插的黏蛋白,也扩展到高阶的力量浓度(ξ∼kT/(浓度)3),据报道在正常∼100 - 500 nm粘液(15,41]。美国手语溶剂对气道黏液凝胶表面作为一个为特征的等渗液体(42,43]。
规模最小的纳米流变长度尺度的粘液的溶剂,可以探索收紧。最近收紧研究T盎et al。(13),采用FITC-labelled 70 kda右旋糖酐(回转半径6.6海里(44]),证明了适度pH-dependent变化在粘液的这些小分子的扩散。我们的实验与CF痰,但不是HBE粘液,在赞同收紧数据获得的T盎et al。(13在孤立的CF小猪粘液(图3和5)。我们解释这些数据表明所得到的低分子量蛋白质溶解在等张粘液(可能炎症)溶剂生成pH-dependent超出水的粘度的变化。在这项研究中值得注意的是,收紧粘度测量值(0.001 - -0.003 Pa·s)和T盎et al。(13)数量级低于粘液的粘度值(0.1 -10 Pa·s)以macrorheology(见以下段落和图3)。收紧的差距与macrorheology测量,加上粘蛋白matrix-solvent分离研究图2 b),表明小分子FITC-labelled右旋糖酐收紧研究利用测量的pH-sensitive属性低粘度粘液溶剂而不是粘蛋白结构/功能主导粘液清除。
与1-µm珠子Microrheology协议进行,调查粘液粘蛋白网相关长度尺度。我们microrheology BSM的PGM和粘液的研究显示出强烈的粘液(几何)依赖复杂的粘度粘液浓度。相比之下,pH值对PGM复杂粘度的影响小得多,只有重要的pH < 5 (补充材料)。这些发现与W的数据一致盎et al。(32在MUC5B-dominated子宫粘液。重要的是,酸度在复杂HBE粘液粘度的影响范围跨气道粘液的健康或疾病(即。pH值6 - 8)与浓度的影响最小粘液收获从正常和CF的文化。
传统的锥板研究调查粘液流变学宏观长度尺度。使用这种方法,相似的定向和定量数据观察至于microrheology (图3),即。pH值对复杂的粘度影响很小在气道pH-relevant范围。相比之下,强大的浓度关系观察,与G的数据一致eorgiadeset al。(31日]。虽然它通常很难调和的发现探索粘液流变特性在不同长度尺度,我们发现长度尺度是一致的粘液浓度、pH值,控制粘液mesh-dependent流变特性与特定轴有关。
CF痰液的研究与我们的粘液模型系统进行了比较。在原始的CF患者痰液,像我们的模型系统,强大的粘液浓度之间的相关性(p < 0.05),但不是pH值(p > 0.3),观察和流变学(图5一个和b)。
聚合物凝胶的取水能力描述的渗透压。与流变特性,聚合物凝胶渗透压力扩展到高阶的聚合物(粘液)浓度。在正常情况下,PCL更集中凝胶和完全水化,允许这些纤毛的润滑的PCL的环境。然而,我们的数据显示,即使是很小的渗透压缩PCL的温和内向黏液层(即。4 - 5%固体)产生足够的压缩的纤毛粘液运输缓慢。数据在图4一表明在酸性pH值改变与碱性范围并不影响集中黏液层的渗透性能。相反,适度的粘液hyperconcentration产生预测的温和PCL压缩(图4一)。
直接比较pH值的影响与集中在特定利率,粘液pH值的影响与浓度在MCT测量HBE文化(图4 b和c)。符合微观,macrorheology MCT由粘液浓度和没有博士这些发现与先前的报道是一致的,表明其特定依赖于粘液浓度,与MCT放缓在4 - 5%固体和停止固体[8 - 10%24,45]。
治疗策略正常化CF粘液生物物理属性集中在浓度(水)、pH值和二硫键还原。研究CF痰样品暴露于2倍浓度的变化与100倍的变化表明浓度、pH值不是pH值,正常化痰复杂的粘度。化学还原的粘液裂开二硫键与德勤相似褶皱复杂的粘液粘度的下降值作为水化在HBE粘液(图5 d)和联合CF痰(图5 e)。这些数据表明,水化和化学还原可能比alkalisation muco-corrective更有效的治疗方法。
浓度的生物物理属性的重要性粘液植根于的粘蛋白大分子的聚合物性质的关键gel-forming分子粘液。增加粘液的浓度和黏蛋白在疾病状态(8,11,24]几何改变粘液的粘弹性和渗透性能(40),导致倒塌的PCL (1),降低黏膜纤毛的清除(24),中性粒细胞减少渗透和细菌杀死45,生物膜的形成15,降低肺功能(24,41,46]。集体,粘液浓度增加可以生成的muco-obstructive病理生理学的典型CF (8,11,24,41]。
pH值的作用在呼吸道疾病是不太清楚,研究不同的大小变化在鼻模型pH值(47),新生仔猪(13),人类细胞培养(36,38,39和早期的CF患者在活的有机体内(39]。我们的数据强烈认为,pH值几乎没有影响的生物物理性质粘液与基底黏液运输有关。可能有一个角色的酸化细菌杀死(48),可能会增加失败的粘液清除CF疾病发病机理。我们推测,病理生理相关CF气道pH调节缺陷可能在胃愿望更重要。愿望后,呼吸道表面的pH值严重酸化和花费的时间回到基线在CF比普通文化38]。以前的宏观和微观流变学研究发现,降低pH值1 - 3被要求产生粘液流变异常的大小由CF-relevant增加粘液浓度(20.,30.- - - - - -32]。因此,胃愿望可能结合粘液浓度增加触发早期CF事件和/或CF肺部疾病的传播。
结论
在微米到毫米长度尺度,探针微macrorheological粘蛋白结构的性质,粘液浓度、pH值,治理的生物物理性质从肺粘液重要的间隙。相比之下,收紧研究探测器的溶剂性能粘液网状凝胶不相关。更大的长度尺度生物物理分析的数据,但不是收紧,与数据一致HBE MCT化验,还演示了浓度在控制特定的统治地位。粘液pH值可能影响抗菌杀CF肺。然而,我们的研究结果表明,旨在恢复的症状的治疗粘液的运输特性应该把重点放在减少粘液浓度和/或黏液溶解的降低而不是提高pH。
补充材料
确认
作者要感谢埃里克Perou,马修·库姆斯和杰西卡Malachowski(所有在北卡罗莱纳大学教堂山分校,教堂山,数控、美国)的实验工作在这个项目上。作者还要感谢Scott Randell和UNC组织核心(北卡罗莱纳大学教堂山分校)HBE细胞,和埃里克•罗伊(北卡罗莱纳大学教堂山分校)的社论援助。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
作者的贡献:D.B. cooper希尔和b按钮构思实验。抓山,水长,r . Tarran M.G.森林和b按钮设计的实验,这是由D.B. cooper山,水长,e . Atieh智能卡Garbarine, m . Habibpour北卡罗来纳州丰塔纳,j•Kissner, m·克里斯蒂和b按钮。资料解释是由D.B. cooper山,水长,核磁共振Markovetz,直鲍彻M.G.森林,和b按钮。手稿所写的主要是抓山,鲍彻司令部和b按钮。所有作者提供了重要的反馈,帮助塑造了手稿。
利益冲突:抓山报告从囊性纤维化基金会资助,国家科学基金会和国家健康研究所的,在进行这项研究的。
利益冲突:水长没有披露。
利益冲突:j•Kissner报告从NIH资助国家糖尿病、消化,和肾脏疾病(联邦),国家科学基金会(联邦),知道生物,LLC(商业和工业)、国家卫生研究院的国家心脏,肺和血液研究所(联邦),囊性纤维化基金会(基金会)和囊性纤维化基金会疗法(基础),在进行这项研究的。
利益冲突:大肠Atieh没有披露。
利益冲突:智能卡Garbarine报告从囊性纤维化基金会赠款,在进行这项研究的。
利益冲突:核磁共振Markovetz没有披露。
利益冲突:北卡罗来纳州丰塔纳没有披露。
利益冲突:m·克里斯蒂没有披露。
利益冲突:m . Habibpour没有披露。
利益冲突:r . Tarran没有披露。
利益冲突:M.G.森林没有披露。
利益冲突:Parion科学鲍彻司令部是董事会主席,一个专注于发展私营UNC子公司治疗CF,和公司的股本和接收货币补偿董事会主席一职。
利益冲突:b按钮没有披露。
支持声明:这项工作是由美国国家科学基金会的资助(DMS 1462992),美国国立卫生研究院(R01HL125280 5 p30dk065988和4 p50hl120100)和囊性纤维化基金会(Hill16XX0、Ramsey16I0 Bouche15R0和Button07XX0)。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2018年7月25日。
- 接受2018年9月25日。
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