文摘
特发性肺纤维化(IPF)是一种进行性疾病原因不明。两种药物,nintedanib和pirfenidone缓慢,但不能阻止疾病进展。肺动脉高压(PH)是一种常见的并发症在IPF患者和与不良预后相关。Macitentan是一个双重内皮素受体拮抗剂,批准用于肺动脉高血压治疗。我们提出使用macitentan治疗动物引起的肺纤维化adenoviral向量编码生物活性改变增长factor-β1 (AdTGF-β1)改善慢性肺疾病引起的PH值,将限制纤维化的进展。
老鼠(雄性sd)中收到AdTGF-β1被每日填喂法治疗macitentan (100 mg·公斤−1·天−1),pirfenidone(0.5%食物混合)或从14天、28天。肺动脉压(PAP)测定大鼠前被杀,和纤维化后来评价的形态学测量和羟脯氨酸的分析。
AdTGF-β1诱发肺纤维化相关重大博士Macitentan PAP的增加减少Macitentan和pirfenidone阻止纤维化进展天14至28天。从myofibroblast Macitentan保护内皮细胞分化和细胞凋亡而pirfenidone只有防止fibroblast-to-myofibroblast分化。这两种药物诱导细胞凋亡的分化myofibroblasts在体外和在活的有机体内。
我们的研究结果表明,双内皮素受体拮抗是有效的PH值和肺纤维化而pirfenidone只纤维化的影响。
文摘
Macitentan减少TGF-β1-induced肺纤维化的进展和肺动脉高压,而pirfenidone只有减缓肝纤维化进程http://ow.ly/4tt230kHQOn
介绍
特发性肺纤维化(IPF)的特点是进步的肺组织肺泡架构的疤痕和破坏。IPF的患病率是20-42每100人000年普通人群和245每100 000年龄> 70岁。IPF的预后差,死亡率与侵略性的癌症。IPF的确切原因仍难以捉摸和治疗选择是有限的,只有两个批准的药物,nintedanib pirfenidone,已证明能缓慢但不阻止疾病进展(1- - - - - -3]。IPF被视为异常的发病机制,涉及到不受控制的肺泡修复的分化和持久性myofibroblasts代表一个重要事件。Myofibroblasts聚集在成纤维细胞的疫源地负责异常的细胞外基质(ECM)的积累。改变增长factor-β1 IPF (TGF-β1)起着关键作用的诱导myofibroblast分化(4]。
肺动脉高压(PH)是一个公认的并发症IPF和预后不良的一个标志5]。PH值的特点是持续增加平均肺动脉压(PAP) > 25毫米汞柱(6]。组织学检查PH值呈现与内皮细胞(EC)损伤和血管平滑肌细胞(VSMC)增殖。Endothelin-1 (ET-1)是一种强有力的血管收缩剂,结合埃塔和ETB受体(ETRA和ETRB)出现在肺成纤维细胞,VSMCs和ECs (7]。ET-1表达在bleomycin-induced IPF肺和肺纤维化(8]。此外,ET-1支持myofibroblast分化、持久性和抗细胞凋亡9]。我们组证明活动TGF-β1的adenovector-mediated基因转移(AdTGF-β1)啮齿动物肺导致进步和严重纤维化加上PH值通过降低血管内皮生长因子(VEGF)的表达,增强EC凋亡,随后血管稀疏和TGF-β1-driven媒体增厚(10]。Macitentan双重ETRA / ETRB拮抗剂批准用于治疗肺动脉高血压(PAH) [6]。博来霉素的大鼠肺纤维化模型,macitentan证明疗效降低右心室肥大和肺改造(11]。尽管有前途的临床前数据,Macitentan使用在IPF(音乐)临床试验未能证明药物的好处对IPF患者(12]。然而,这种试验是在轻到中度IPF患者可能没有(还)有明显的肺血管的重塑和博士因此,还需要进一步的研究来理解真正的ET-1阻滞剂对先进的IPF的影响。
我们调查的疗效和机制双重ET受体拮抗肺纤维化和PH值影响AdTGF-β1 pirfenidone老鼠相比。我们首次展示,macitentan,除了回归TGF-β1-induced PH值,抑制TGF-β1-induced肺纤维化大鼠的进展。
材料和方法
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人类的样本
血浆和组织收集病人的同意和汉密尔顿综合研究伦理委员会的批准(HIREB # 00 - 1839)。控制肺组织接受手术的患者的癌症。肺纤维化组织是不清楚间质性肺病患者进行活检。这个研究揭示的切片分析了通常的间质性肺炎的模式。
抗体和试剂
抗体是α-smooth肌肉肌动蛋白(α-SMA) (ab7817;Abcam,剑桥,英国),pSmad3 (ab51451;Abcam), Smad3 (ab40854;Abcam), VEGF (ab1316;Abcam)、裂解caspase-3 (# 9661;细胞信号技术,丹弗斯,妈,美国),ET-1 (ab117757;Abcam)、CD31 (sc - 1506;圣克鲁斯生物技术、圣克鲁斯、钙、美国),ETRA (ab117521;Abcam), ETRB (ab117529;Abcam)、GAPDH (# 5174; Cell Signaling Technology), anti-rabbit HRP-linked IgG (#7074; Cell Signalling Technology) and anti-mouse IgG HRP-linked antibody (#7076; Cell Signaling Technology). For fluorescence microscopy, we used goat or donkey secondary antibody conjugated with Alexa Fluor-488 and Alexa Fluor-555 (Abcam). Human rET-1 (100-21; PerproTech, London, UK) and human rTGF-β1 (240-B; R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) were used在体外治疗细胞。
细胞培养
来自人体的正常主肺动脉平滑肌细胞(pc - 100 - 023;写明ATCC马纳萨斯,弗吉尼亚州,美国)和主肺动脉ECs (pc - 100 - 022;根据制造商的建议写明ATCC)增长。成纤维细胞是来自人类在手术活检(控制和IPF)和生长在RPMI介质(30 - 2001;写明ATCC)补充10%胎牛血清。所有的细胞都在37°C 5%孵化有限公司2。
动物实验
动物工作委员会是在加拿大的指导下进行的动物保健和动物研究伦理委员会批准的麦克马斯特大学(# 13-12-48)。肺纤维化是AdTGF-β1诱导的。雌性的雄性sd大鼠中(225 - 250克;查尔斯河实验室,美国马威尔明顿)收到5.0×108AdTGF-β1的点状单位(PFU)气管内的滴剂在第0天异氟烷麻醉下(D0)。老鼠收到macitentan(100毫克每日填喂法·公斤−1·天−1;Actelion股价制药有限公司、Allschwil、瑞士),pirfenidone(0.5%的食物混合随意;Chemcia科学、圣地亚哥、钙、美国)或两者的结合每组(n = 6) D14 D28。之前被杀,老鼠anesthetised和导管(PE管材,SP0109;ADInstruments Inc .)、美国科罗拉多斯普林斯,有限公司)引入到颈静脉,推迟到更远的肺动脉读人民行动党压力传感器(MLT844;ADInstruments Inc .)。肺是收获事后剖析和固定在10%的福尔马林组织学或瞬间冷冻在液态氮对蛋白质和RNA分析。
计算机断层扫描成像
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西方墨点法
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阿什克罗夫特得分
肺纤维化的马森trichrome-stained肺部分的等级从0(正常)8(完全纤维化肺),使用修改后的阿什克罗夫特得分(14]。
隔离mRNA和基因表达
冰冻的肺组织的总RNA提取与试剂盒®试剂(15596026;美国马热费希尔科学、沃尔瑟姆)。qScript cDNA SuperMix (95048 - 025;美国量子生物科学,马里兰州)用于反向转录2μg总RNA。互补脱氧核糖核酸是使用一个快速放大7500实时PCR系统(美国应用生物系统公司,培育城市,CA)使用TaqMan®普遍PCR主和预先设计引物对混合(4304437;生命技术、伯灵顿,加拿大)Collagen1A (Hs00164004_m1) TGFβR1 (Hs00610320_m1) ACTA2 (Hs00426835_g1)和18岁(Hs03003631_g1)。
组织学和免疫组织化学
肺幻灯片马森沾色或Picrosirius红色。图像采集是使用一个自动执行滑动扫描显微镜(奥林巴斯VS 120 - l,奥林巴斯美国公司,中心山谷,PA,美国)。内皮直径(ED)被定义为外部弹性薄片之间的距离;船只被归类为小如果ED是< 50μm和大型如果ED > 50μm。内侧壁厚(MWT)被确定为外部和内部弹性薄层之间的距离,计算使用以下公式:比例MWT = (2×MT / ED)×100。
免疫荧光
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ELISA
活跃的水平TGF-β1、VEGF和ET-1在老鼠和人类支气管肺泡灌洗液(BALF)上层清液和血清测定使用老鼠TGF-β1-specific酶联免疫试剂盒(MB100B;研发系统),一只老鼠VEGF酶联免疫试剂盒(ab100786;Abcam),一只老鼠ET-1酶联免疫试剂盒(E-EL-R0167;美国Elabscience,休斯顿,德克萨斯州)和人类ET-1酶联免疫试剂盒(DET100;研发系统),分别根据制造商的建议。
收缩试验
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统计分析
所有的数据表示为中位数和四分位范围。使用非参数统计分析两组之间进行Mann-Whitney测试。统计分析多个组与对照组之间利用克鲁斯卡尔-沃利斯检验,执行的事后邓恩的比较。分析6.0 GraphPad棱镜(GraphPad软件公司,拉霍亚,CA,美国)。一个假定值< 0.05被认为是显著的。
结果
Macitentan防止PH TGF-β1诱导的大鼠
意味着人民行动党显著增加从D14 D28 AdTGF-β1老鼠相比,控制(图2一个)。D28,动物收到D14 pirfenidone D28显示非重大的下降意味着PAP而macitentan正常化的增加意味着PAP AdTGF-β1引起的(图2一个)。动物收到macitentan和pirfenidone提出类似的意思是人民行动党减少动物接收macitentan独自一人(图2一个)。
的增加意味着PAP AdTGF-β1老鼠与增加ET-1 AdTGF-β1老鼠相比,控制在血清BALF但不是从D14 D28 (图2 bc)。而对ET-1 pirfenidone没有影响,macitentan显著降低BALF中ET-1当单独或者联合管理(图2 c)。
计算机断层扫描(CT)图像允许血管体积和密度的量化大型船只(> 75µm)和证明AdTGF-β1诱导肺血管密度和血管体积,减少由macitentan抑制单独或结合;pirfenidone没有效果(图2 d- f)。此外,小的数量(ED < 50μm)和大型(ED > 50μm)肺血管在AdTGF-β1 D28动物显著降低(补充图S1A)。Macitentan,但不是pirfenidone,恢复这两个小型和大型船只的数量与控制水平可比。血管重塑、评估MWT后增加了D28 AdTGF-β1在小型和大型船只(补充图印地C)。参与者的增加显著降低macitentan和联合治疗(补充图印地C)。
Macitentan调节VEGF表达AdTGF-β1-treated老鼠
AdTGF-β1诱导增加VEGF在D28 BALF但不是血清(图3一b)。Macitentan显著抑制VEGF诱导增加AdTGF-β1 BALF但诱导血清VEGF的增加(图3一b)。Pirfenidone没有影响VEGF (图3一b), TGF-β1对VEGF的影响增加了D28从AdTGF-β1大鼠肺组织(图3 cd);macitentan和联合治疗降低VEGF表达,而pirfenidone没有效果(图3 cd)。AdTGF-β1诱导VEGF表达的一个戏剧性的upregulation在实质D28虽然没有发现VEGF-positive ECs (图3 e和补充图S2)。Macitentan单独或结合减少薄壁组织中VEGF的表达,同时增加VEGF在ECs (图3 e和补充图S2)。Pirfenidone造成类似的表达VEGF AdTGF-β1 (图3 e和补充图S2)。这些结果被证实在肺组织co-staining CD31和VEGF免疫荧光(补充图S3A, B)。
Macitentan pirfenidone防止AdTGF-β1-induced肺纤维化的进展
羟脯氨酸含量AdTGF-β1老鼠相比,增加动物接收控制腺病毒(AdDL) D14 D28 (图4一)。Macitentan, pirfenidone及其组合D28(羟脯氨酸含量显著降低图4一)。阿什克罗夫特AdTGF-β1动物显示更高的分数(图4 b比控制)。阿什克罗夫特得分从动物收到macitentan pirfenidone和联合治疗是减少AdTGF-β1相比(图4 b)。AdTGF-β1老鼠增加fibrotic-area /整个区域比从D14 D28相比控制(使用ImageJ定量评估;图4 cd), Macitentan pirfenidone及其组合的比例降低纤维化面积比AdTGF-β1 (图4 cd)。Picrosirius红染色增加了AdTGF-β1和被macitentan预防,在D28 pirfenidone和联合治疗(图4 ef)。压力-容积循环测量在D28证明pirfenidone和macitentan诱导肺功能的改善与AdTGF-β1-treated老鼠(补充图S4A)。此外,CT扫描允许的面积肺纤维化在三维重建量化和证明macitentan pirfenidone显著降低肺纤维化引起TGF-β1 (补充图S4b)。
Macitentan和pirfenidone抑制pro-fibrotic通路在活的有机体内在AdTGF-β1老鼠
在D28内源性总和主动TGF-β1调节与控制(图5一个b)。治疗与macitentan pirfenidone及其组合抑制TGF-β1 upregulation。AdTGF-β1诱导的TGF-β1 upregulation D28,与增加α-SMA (图5 cf), Smad3磷酸化TGF-β1的主要途径,是调节在D28 AdTGF-β1动物(图5 cd)。Macitentan,在较小程度上,pirfenidone减少AdTGF-β1-inducedα-SMA和p-Smad3 upregulation (图5 cd f)。macitentan和pirfenidone独自macitentan有可比性的影响(图5 c- h)。虽然ETRB AdTGF-β1没有影响,但显著调节ETRA和ET-1表达式(图5 c,e, g, h), macitentan, pirfenidone及其组合抑制ETRA和ET-1 upregulation (图5 c、g h)。
机制和anti-fibrotic anti-PH macitentan的影响
Macitentan阻塞ETRA和ETRB,调解ET-1影响VSMCs和ECs。在体外,macitentan废除了VSMC重组引起的收缩和EC死亡ET-1 (rET-1) (补充图S5A, B)。Macitentan但不是pirfenidone抑制肺成纤维细胞的收缩引起rET-1和重组TGF-β1 (rTGF-β1)(图6,b;补充图S5a, b)。
正如所料,rTGF-β1诱导fibroblast-to-myofibroblast分化,如图所示的upregulation collagen1,α-SMA和TGF-β1 mRNA (图6 c- g)。有趣的是,macitentan或独自pirfenidone抑制这个upregulation (图6 c- g)。macitentan和pirfenidone collagen1表现出更低水平的信使rna,α-SMA和TGF-β1 (图6 c- g)。信使rna研究结果证实了在蛋白质水平(图6 c- g)。VEGF和TGF-β1表达被rTGF-β1增强在成纤维细胞,抑制由macitentan和pirfenidone (图6 c- g)。此外,活跃caspase-3表达减少成纤维细胞收到rTGF-β1和主动caspase-3水平被macitentan恢复和pirfenidone (图6 c- g)。Collagen1A蛋白表达强烈降低macitentan但不是pirfenidone。
同样,rTGF-β1诱导mRNA upregulation collagen1A,α-SMA TGF-β1 ECs,表明分化的EC myofibroblast-like细胞(图6 h- l)。Macitentan独自,结合pirfenidone抑制collagen1A,α-SMA和TGF-β1 mRNA upregulation而独自pirfenidone没有效果(图6 h- l)。有趣的是,VEGF mRNA表达强烈调节macitentan但不是pirfenidone (图6 h- l)。在蛋白质水平,α-SMA表达ECs被rTGF-β1调节和抑制macitentan,程度较轻,pirfenidone (图6 h- l)。VEGF和活跃caspase-3监管ECs相反,在成纤维细胞。在EC, rTGF-β1诱导caspase-3增加和降低VEGF (图6 h而macitentan - l),但不是pirfenidone,恢复了VEGF和抑制caspase-3表达式由rTGF-β1 (图6 h- l)。我们的结果表明,随着EC凋亡,ET-1诱导的分泌潜伏TGF-β1及其激活(补充图S5C)。Macitentan独自,结合pirfenidone抑制TGF-β1分泌和激活而独自pirfenidone没有影响(补充图S5C)。
在活的有机体内,AdTGF-β1诱导只有少数caspase-3-positive薄壁组织细胞(成纤维细胞),但明显EC细胞凋亡(补充图S6)。Pirfenidone-treated老鼠大量caspase-3-positive实质和内皮细胞。相比之下,macitentan单独和联合治疗增加caspase-3-positive细胞只在细胞凋亡的实质,同时保护ECs (补充图S6)。双重荧光染色证实,macitentan pirfenidone及其组合增加caspase-3-positive /α-SMA-positive细胞,表明增加myofibroblast凋亡相比AdTGF-β1 (图7)。相比之下,AdTGF-β1诱导增加caspase-3-positive / CD31-positive细胞,表明EC细胞凋亡增加。Macitentan单独和联合治疗但不是pirfenidone减少AdTGF-β1-induced EC细胞凋亡(图7 b)。
讨论
IPF是一种进步的疾病预后差和有限的治疗选择。到目前为止只有两种药物,nintedanib和pirfenidone1,2),影响疾病进展;这些都是最近批准的IPF的治疗。IPF的PH值是一个频繁的并发症的发生率[32 - 73%15]。PH值的发展IPF与不良预后相关,增加住院。IPF的PH值通常在晚期发展;因此,PH值管理成为一个有效的选项来改善病人的结果。
在当前的研究中,我们表明,肺纤维化的过度活跃的TGF-β1诱发重大博士连同ECM沉积增加,观察血管重塑与稀疏AdTGF-β1老鼠的血管,血管壁厚度增加,EC凋亡,导致增加意味着PAP。Macitentan,双重内皮素受体拮抗剂治疗PAH的批准,防止血管重塑和多环芳烃在各种动物模型(11,16,17]。正如预期的那样,在我们的模型中,macitentan中和PH值的发展引起的减少意味着PAP AdTGF-β1如图所示。这个进步是与血管密度的增加有关。Macitentan阻止EC细胞凋亡促进VEGF的生产,这可能是参与血管稀疏。相比之下,pirfenidone显示只有温和的对PH值的影响,表明一个特定的影响macitentan脉管系统。
此外,我们在这个研究证明macitentan在肺纤维化的治疗管理防止肝纤维化进程。Pirfenidone是anti-fibrotic药物抑制实验性肺纤维化(18- - - - - -20.]。的anti-fibrotic疗效macitentan pirfenidone是相同的在我们的模型中。D28,胶原沉积的老鼠接受macitentan或者pirfenidone相比,在减少老鼠接受AdTGF-β1和没有药物。胶原蛋白水平AdTGF-β1 + macitentan或AdTGF-β1 + pirfenidone老鼠在D28比得上D14 AdTGF-β1老鼠的水平,建议macitentan和pirfenidone阻止进一步的胶原蛋白沉积D14 D28而不是减少现有的纤维化。pirfenidone和macitentan没有提供任何额外的有益影响肝纤维化进展相比,单药治疗。
当前范式的IPF病理学表明上皮36例原因不明导致pro-fibrotic介质的增加,活性TGF-β1等创建一个pro-fibrotic肺微环境。成纤维细胞的分化与纤维母细胞的形成myofibroblasts焦点是中央的一步促进ECM的生产负责破坏肺泡结构(21]。与上皮/内皮细胞,IPF myofibroblasts抗细胞凋亡(22]。Pirfenidone抑制fibroblast-to-myofibroblast分化和ECM生产,减少myofibroblast扩散在体外和在活的有机体内(23,24]。我们的研究结果证实了pirfenidone施加anti-fibrotic效应,包括抑制α-SMA myofibroblasts表达式,TGF-β1 TGF-β1引起的表达和胶原沉积在体外在成纤维细胞和通过减少myofibroblasts的池在活的有机体内通过促进细胞凋亡。
它已经表明,ET受体拮抗剂改善bleomycin-induced肺纤维化(8]。此外,在一个模型的系统性硬化症(SSc), macitentan抑制了pro-fibrotic myofibroblast ET-1引起的表型在人类皮肤成纤维细胞25]。循环或组织ET-1水平调节在IPF患者和SSc和博来霉素的肺纤维化模型(26- - - - - -28]。我们证明macitentan pirfenidone一样,防止TGF-β1-induced myofibroblast分化在体外和细胞凋亡myofibroblast在活的有机体内。在我们的模型中,直到D28 TGF-β1和ET-1调节。而macitentan TGF-β1和ET-1水平降低,只TGF-β1 pirfenidone抑制,表明一个特定操作的macitentan ET-1系统。这就解释了这两种药物的组合的好处抑制成纤维细胞分化在体外。Ciprianiet al。(29日]证明ET-1 / TGF-β受体的形成复杂的成纤维细胞SSc病人,这强调了潜在ET受体和TGF-β信号之间的干扰。因此,难怪macitentan,通过阻断ET-1信号,还能抑制TGF-β1。
ECs的分化myofibroblasts名为endothelial-to-mesenchymal过渡(endoMT),是一种公认的来源myofibroblasts纤维化(30.]。我们已经证明了,除了其对成纤维细胞分化的影响,macitentan但不是pirfenidone抑制EC分化在体外和防止EC死亡体内。EndoMT也被牵连在特发性肺动脉高压的发病机制和SSc-PH [31日,32),通过促进血管重塑和血管收缩。因此,通过抑制endoMT从细胞凋亡和保护ECs, macitentan保护AdTGF-β1老鼠从PH值和可以保护AdTGF-β1老鼠从随后的纤维化,而pirfenidone只作用于肝纤维化进程。不过,虽然endoMT已被证实能促进动物模型的肺纤维化,的具体贡献人类IPF endoMT仍然难以捉摸,macitentan的确切作用在IPF EC分化需要进一步调查。已经证明,EC死亡诱发潜在TGF-β1释放细胞外室和刺激其激活(33]。在我们的模型中,macitentan阻止TGF-β1释放和激活ECs,从而限制AdTGF-β1-induced纤维化进展。
VEGF是一个重要的因素,多环芳烃和纤维化。我们先前已经表明,VEGF ECs减少细胞凋亡和血管稀疏,从而提高PH值(10]。然而,VEGF表达的增加还可以加重肝纤维化(10]。它已经表明,macitentan抑制VEGF在2型糖尿病的一个模型34]。在我们的研究中,VEGF表达整个肺调节AdTGF-β1后,确认一个假定的pro-fibrotic VEGF的影响。VEGF macitentan但不是pirfenidone大幅减少。不过,VEGF表达的减少似乎与macitentan提供的血管保护之间的冲突。VEGF是一个强大的细胞因子,只有一个小局部的VEGF可能足以发挥angiogenetic属性。有趣的是,在AdTGF-β1 VEGF的表达主要是增加在肺实质而抑制ECs。相比之下,macitentan废除实质VEGF表达增强其表达在内皮细胞层,这是值得注意的考虑,VEGF是一个重要的生存信号ECs。
我们将演示这里pirfenidone施加anti-fibrotic行动减少ECM / TGF-β1生产,主要通过抑制fibroblast-to-myofibroblast分化和促进myofibroblast细胞凋亡。相比之下,anti-fibrotic macitentan并不局限的能力对成纤维细胞的作用。
我们的研究也证实了先前的结果表明循环ET-1调节IPF患者(35随着ETRA)。此外,我们能够证明IPF严重性和ET-1血清水平之间的相关性。这支持先进IPF ET-1阻滞剂的潜在作用,但是这些研究结果需要确认。我们坚信,这个观点是正确的,即使考虑到音乐试验报道,macitentan没有有效治疗IPF (12]。在我们的临床前模型,肺纤维化与血管重塑包括欧共体死亡和博士信号发送的EC损伤,如潜伏TGF-β1释放和激活,可能恶化纤维化过程被macitentan老鼠。结果在临床前模型并不总是转座的人类,我们相信我们的AdTGF-β1模型可能代表人口的IPF患者肺纤维化和PH值没有专门研究在以往临床试验。音乐的审判,就像早期试验调查应用波生坦的影响,另一个ETRA / ETRB拮抗剂,是进行轻到中度IPF患者可能没有(还)有明显的肺血管重塑和PH值(36,37]。最近的阿耳特弥斯试验得出结论,ambrisentan,拮抗剂ETRA选择性,并没有有效地治疗IPF与风险增加相关,甚至可能是疾病进展(38]。不过,阿尔忒弥斯是提前终止,这意味着暴露于药物可能没有足够的时间去看效益和只有一小部分研究对象组3 PH值(14%)(39]。很可能macitentan可能有利影响只有在限制人口IPF晚期疾病患者和PH值的发展,可能没有被突出显示在以前的临床试验。
总之,我们将演示一个固体anti-fibrotic macitentan对肺纤维化的影响在non-inflammation-driven实验模型的肺纤维化。pirfenidone类似的影响,两种anti-fibrotic批准药物之一。此外,macitentan,孤独和结合pirfenidone, PH值显著提高和降低肺血管重塑与先进的纤维化动物+博士这些发现强烈支持的调查人员阿耳特弥斯试验的总结提出声明(39):“这个数量有限的观察(世界卫生组织)的患者组3 PH值值得进一步的研究来理解pathophysiogical方面和临床结果与IPF的肺血管病变相关。”
补充材料
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补充的方法erj - 01857 - 2017 - _supplement
图S1.A。血管计数(小< 50μm;大> 50μm)上执行马森三色的彩色肺部分AdTGF-β1 (AdDL控制),AdTGF-β1 + macitentan AdTGF-β1 + pirfenidone或AdTGF-β1 + macitentan + pirfenidone老鼠D28;中位数和四分位范围,* * *:p < 0.001, * *: p < 0.01, *: p < 0.05, n = 6 /组。b代表图像的肺血管马森沾色AdTGF-β1 (AdDL控制),AdTGF-β1 + macitentan AdTGF-β1 + pirfenidone或AdTGF-β1 + macitentan + pirfenidone D28老鼠。c .内侧壁厚(MWT、小< 50μm;大> 50μm)测量与ImageJ肺部分AdTGF-β1 (AdDL控制),AdTGF-β1 + macitentan AdTGF-β1 + pirfenidone或AdTGF-β1 + macitentan + pirfenidone老鼠D28;中位数和四分位范围;*:* * *:p < 0.001, p < 0.05, n = 6 /组。erj - 01857 - 2017 - _figure_s1
图S2。a代表的形象包含IHC VEGF的AdTGF-β1 (AdDL控制),AdTGF-β1 + macitentan AdTGF-β1 + pirfenidone或AdTGF-β1 + macitentan + pirfenidone D28老鼠。上面板显示代表实质区域。较低的面板显示代表血管。erj - 01857 - 2017 - _figure_s2
图S3。a代表图像的VEGF和CD31免疫荧光AdTGF-β1 (AdDL控制),AdTGF-β1 + macitentan AdTGF-β1 + pirfenidone或AdTGF-β1 + macitentan + pirfenidone D28老鼠。面板显示代表实质区域。CD31绿色VEGF红,DAPI蓝。b代表图像的VEGF和CD31免疫荧光AdTGF-β1 (AdDL控制),AdTGF-β1 + macitentan AdTGF-β1 + pirfenidone或AdTGF-β1 + macitentan + pirfenidone D28老鼠。面板显示代表血管。CD31绿色VEGF红,DAPI蓝。erj - 01857 - 2017 - _figure_s3
图S4。答:由Flexivent肺功能测量。提出了压力-容积循环AdTGF-β1 (AdDL控制),AdTGF-β1 + macitentan AdTGF-β1 + pirfenidone或AdTGF-β1 + macitentan + pirfenidone D28老鼠。*:* *:p < 0.01, p < 0.05, n = 4 /组。b的量化和代表图像CT扫描三维重建纤维化区域(蓝色)和健康的实质(红色)的AdTGF-β1 (AdDL控制),AdTGF-β1 + macitentan AdTGF-β1 + pirfenidone或AdTGF-β1 + macitentan + pirfenidone D28老鼠,*:p < 0.05, n = 3 /组。erj - 01857 - 2017 - _figure_s4
图S5。答:人类肺动脉内皮细胞(上半部分)或控制人类成纤维细胞在胶原凝胶(下图)混合培养12小时的24孔板中没有的边后卫。12小时后细胞治疗ET-1(10μM)和macitentan(100μM), pirfenidone(100μM)或24小时的组合。24小时后凝胶被释放的边缘和凝胶收缩是测量每2小时。图表显示收缩指数(mm)在36小时和收缩的进化从0到36小时后凝胶释放;中位数和四分位范围;*:p < 0.05, n = 5。图片显示代表凝胶收缩在0 h和36 h。b细胞凋亡测定使用AnnexinV / PI染色。可行的细胞的百分比(AnnexinV - /π),早期凋亡细胞(AnnexinV + / PI)和晚期凋亡细胞(AnnexinV + / PI +)通过流式细胞仪测定;中位数和四分位范围; **: p<0.01, *: p<0.05, n=5. C. Total and active TGF-β1 protein level measured by ELISA in EC supernantants after ET-1, ET-1 + macitentan, ET-1 + pirfenidone or ET-1 + macitentan + pirfenidone; median with interquartile range; *: p<0.05, **: p<0.01, n=5 per group.erj - 01857 - 2017 - _figure_s5
图S6。a代表图像的免疫化学染色裂解caspase-3(布朗)从大鼠肺部分处理AdTGF-β1 (AdDL控制),AdTGF-β1 + macitentan AdTGF-β1 + pirfenidone或AdTGF-β1 + macitentan + pirfenidone D28。上面板显示代表实质区域。较低的面板显示血管区域代表。黑色的箭头显示caspase-3 +细胞。erj - 01857 - 2017 - _figure_s6
确认
作者感谢段Fuqin她优秀的技术帮助。我们感谢詹妮弗Wattie和杆Rhem帮助啮齿动物CT扫描实验。我们感谢安娜Dvorkin-Gheva她有效的技术帮助Nanostring分析。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
利益冲突:m . Iglarz Actelion股价制药有限公司的一名雇员,macitentan的制造商。
利益冲突:m·科尔布报告赠款从罗氏公司和个人费用,勃林格殷格翰的发言,葛兰素史克,基列,Prometic Alkermes公司Actelion股价赠款,Respivert Synairgen,从阿斯利康和热那亚和个人费用,在提交工作。
支持声明:本研究经费是颁发Actelion股价制药有限公司P-S。Bellaye由le昏聩de赠与“矫揉造作的en桑特Respiratoire et de la基金会嘟蛋奶酥”,加拿大肺纤维化基金会(CPFF)和圣约瑟夫医院的研究所,汉密尔顿,加拿大(FSORC奖)。c . Shimbori肺纤维化基金会资助的年轻调查员奖(贝聿铭Rosenzweig)和神达加拿大。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
- 收到了2017年9月12日。
- 接受2018年6月24日。
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