文摘
中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)是一个关键风险因素的严重程度囊性纤维化肺病(CF)。最近的研究发现表面不活动增加气道中性粒细胞从CF-like老鼠和CF患者。然而,在CF表面束缚NE肺病的作用仍然是未知的。我们确定之间的关系在CF表面束缚不活动和肺部疾病的严重程度。
表面束缚不活动测定痰中性粒细胞从35 CF患者和8个健康对照组使用小说lipidated福斯特共振能量转移与自由记者和相关活动,中性粒细胞计数,interleukin-8,髓过氧物酶和antiproteases痰上层清液,肺功能参数。
表面束缚不活动增加与健康对照组相比,CF (p < 0.01),与自由不活动(p < 0.05)和其他炎症标记物(p < 0.001)。表面束缚和自由活动不与用力呼气量在1 s %预测(p < 0.01和p < 0.05),但只是表面束缚不活动与plethysmographic功能余气量% pred CF患者(p < 0.01)。
我们表明,气道中性粒细胞表面束缚不活动与CF患者肺部疾病的严重程度。我们的研究结果表明,表面束缚不活动可能发病机制中发挥重要作用,作为小说在CF肺部疾病生物标志物。
文摘
表面束缚痰中性粒细胞弹性蛋白酶活动与囊性纤维化肺病的严重性http://ow.ly/SRcT30iziHe
介绍
活动增加中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)激活中性粒细胞的主要产品,已被确定为一个关键风险因素的发病和进展支气管扩张和囊性纤维化患者肺功能下降(CF)和non-CF支气管扩张(1- - - - - -5]。除了气道壁结构破坏,不牵连粘液分泌过多的发病机制(6,7,气道炎症8- - - - - -11)和受损的防御铜绿假单胞菌感染(11- - - - - -14]。此外,东北活动增加了禁用CF跨膜电导调节器氯通道和上皮钠通道激活(钠),从而加重基本阴离子分泌缺陷和钠离子的吸收在CF航空公司(15- - - - - -17]。这些发现表明东北活动在痰或支气管肺泡灌洗(BAL)流体是一种很有前途的生物标志物的中性粒细胞炎症CF肺部疾病(2- - - - - -4]。到目前为止,测量集中在自由不落下帷幕流体活动的检测和痰上层清液2- - - - - -4,18]。自东北是一个高度阳离子分子,很大一部分的分泌不绑定到中性粒细胞膜通过静电相互作用[19,20.]。使用小说福斯特共振能量转移(FRET)的测定[NE记者21),我们证明了不活动增加气道中性粒细胞表面的CF患者(22]。此外,我们表明,升高表面束缚活动与气道炎症,粘液分泌过多和结构与CF-like肺损伤小鼠的肺部疾病,甚至在气道嗜中性温和的背景下,不能有效地抑制发布一个完整的antiprotease盾牌,没有免费的不活动落下帷幕液中检测到(22]。然而,不活动的作用在中性粒细胞表面CF肺部疾病仍然是未知的。基于这些小鼠的前期研究结果CF-like肺部疾病(22),我们假设,表面束缚不活动是与CF患者肺部疾病的严重程度相关。为了验证这个假设,我们收集了一群35 CF患者的痰和八个健康不吸烟者和担心记者用来量化痰中性粒细胞表面束缚不活动和自由活动痰上层清液。确定这些不同的关系与气道炎症和蛋白水解池不活动的负担,我们相关的表面束缚和自由活动与痰中性粒细胞计数,白介素8 (IL)、髓过氧化物酶(MPO)和antiproteases如α1-antitrypsin-NE复合物(AAT-NE)和分泌白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)痰上层清液。此外,我们进行配对肺量测定法和身体体积描记法及相关表面束缚和自由不活动在1 s (FEV用力呼气量1)作为全球参数的肺部疾病严重程度和plethysmographic功能余气量(FRC)pleth)作为参数困气的CF患者。
方法
研究人群
这个观察研究伦理委员会批准的海德堡大学的(德国海德堡)和知情同意书是获得所有科目。CF的诊断是验证了建立诊断标准(23]。自发咯血(n = 36)或诱导痰(n = 3)足够的量(> 60 000总炎症细胞)收集从35临床稳定的CF患者在常规去海德堡大学医院(CF中心表1和在线辅助表S1)。殖民与铜绿假单胞菌被定义为负,间歇和慢性时0%,≤50%和> 50%的气道文化,分别是积极的在之前的12个月。作为对照组,我们收集了诱导痰从八个年龄,身体健康,不吸烟的志愿者(五个女性和三个男性;中位数(范围)31.1(22.0 - -45.0)岁)食盐水吸入如前所述[22,24]。在CF患者,我们进行肺量测定法来确定FEV1作为一个全球性的参数确定FRC的肺功能和身体体积描记法pleth作为参数的空气滞留在同一天的痰收集,根据美国胸科学会/欧洲呼吸学会指南(188bet官网地址25,26]。
痰液自由表面束缚的加工和测量活动,细胞因子和antiproteases
痰是唾液和单一化分开使用10% sputolysin (Calbiochem,达姆施塔特,德国)。痰炎症细胞分离和免疫细胞总数量进行。自由不活动量化痰上层清液使用烦恼探针NEmo-1并与活动水平决定的显色底物MeO-Suc-AAPV-pNA(σ,圣路易斯,密苏里州,美国)(1- - - - - -3]。痰中性粒细胞表面束缚不活动测量使用lipidated担心记者NEmo-2 [21,22),决定从供体与受体荧光比率如前所述和详细的在线补充材料(22]。引发、MPO、SLPI AAT-NE用ELISA测定。微分进行细胞计数May-Grunwald-Giemsa-stained cytospin准备。三个CF和一个控制主题,微分细胞数量不能确定,因为cytospins质量很差。值低于检出限报告为0。附加信息的提供在线补充材料。
统计分析
数据分析使用R (R统计计算的基础,维也纳,奥地利)或SigmaPlot (Systat软件、Erkrath德国),并作为中位数(25 - 75)。统计分析是使用Shapiro-Wilk执行测试,Wilcoxon等级和测试,单向方差分析和克鲁斯卡尔-沃利斯测试。相关分析采用斯皮尔曼等级次序法。被认为具有统计显著性p值< 0.05。在多重比较的情况下,个体逐行扫描只表示如果不是被Bonferroni-Holm方法。
结果
表面不活动增加痰中性粒细胞在CF,即使在低水平的患者痰浮在表面的自由不活动
确定气道中性粒细胞表面束缚不活动及其与自由的关系活动CF气道炎症,我们评估的痰样本35 CF患者临床稳定的成人(表1)和八个健康不吸烟者使用高度敏感NE-specific担心记者发达量化(NEmo-1)和自由表面束缚(NEmo-2)不活动(21,22]。正如预期的那样,绝对中性粒细胞计数(p < 0.001)和中性粒细胞的百分比在痰液(p < 0.001)显著增加在我们的成人CF患者相比,控制(图1一个和b)。自由不被NEmo-1活动显著增加控制相比,CF痰(p < 0.01),完全由NE抑制剂抑制sivelestat (图1 d),表现出很强的相关性与自由不活动建立了检测到的显色底物MeO-Suc-AAPV-pNA (r = 0.91, p < 0.001;在线辅助图S1)。类似于自由活动,表面束缚NE CF相比,控制活动显著增加中性粒细胞(p < 0.01),完全被sivelestat (图1 c和1 e)。表面束缚和自由不活动在CF样本呈中度相关(p < 0.05;图1 f)。值得注意的是,CF样本分组根据自由不活动的水平(四分位数)痰液浮层显示表面束缚不活动显著增加了CF控制中性粒细胞相比,患者即使在低水平(≤25百分位)免费不活动(p < 0.01;图1 g)。总的来说,这些结果说明,除了自由活动气道分泌物,气道中性粒细胞表面束缚不活动增加,导致蛋白酶在肺部的CF患者负担。
表面束缚和自由不活动的关系与中性粒细胞炎症和antiproteases的标志
接下来,我们确定自由表面束缚不活动的关系在痰中性粒细胞炎症的标志包括中性粒细胞计数、引发和MPO antiproteases抑制气道腔的活动。自由不活动痰上层清液与绝对中性粒细胞计数,引发和MPO整个人口研究,以及只在CF组(图2一个,c和e)。这些标记表面束缚不活动与中性粒细胞炎症在整个研究人口(图2 bd和f)。在CF组,更高水平的表面束缚不活动往往与更高水平的中性粒细胞,引发和MPO;然而,这些弱关联尚不具备统计学意义纳入本研究的患者数量(图2b、d和f)。无论是免费还是表面束缚不活动的比例与CF患者痰中性粒细胞(在线辅助图S2)。调查与antiproteases自由表面束缚不活动的关系,我们测量水平的SLPI AAT-NE,两个主要的内源性抑制剂的东北航空公司(27在痰上层清液)。像预期的那样(12,28),AAT-NE显著增加(p < 0.001),而SLPI降低(p < 0.001)相比,CF控制痰(表2)。自由活动不与AAT-NE整个人口研究,以及CF组(图3一)。此外,表面束缚不活动与AAT-NE整个研究人口和显示弱关联CF组(图3 b)。自由和表面束缚不活动相关的反向SLPI整个研究人口和显示类似的趋势尚不具备统计学意义的CF组(图3 c和d)。
讨论
这是第一份研究膜结合的角色不活动气道中性粒细胞表面CF肺部疾病。慢性中性粒细胞在CF与气道炎症水平的提高免费NE细胞外活动气道腔室,以及增加气道表面膜结合的表达不激活中性粒细胞(2,3,22,29日,30.]。尽管不活动的检测这两个截然不同的隔间,先前的研究检查NE在CF肺部疾病的作用仅限于免费不活动的测量气道分泌物和表面束缚不活动的发病的相关性是未知的(2- - - - - -4]。在这项研究中,我们使用NE-specific担心记者设计本土化和量化细胞膜[NE活动21,31日痰中性粒细胞)和测量表面束缚不活动从临床稳定成人CF患者广泛的肺部疾病的严重程度(表1)。我们发现表面束缚不活动一直增加痰中性粒细胞的CF患者与健康对照组相比,即使在低水平的患者免费痰上层清液(不活动图1 gydF4y2Ba)。自由和表面束缚不活动与其他标记的气道炎症,如痰中性粒细胞计数、引发、MPO、AAT-NE在我们的研究人群(图2和3)和FEV反向相关1% pred CF患者(图4)。此外,表面束缚NE,但不是免费的活动,与FRC相关pleth% pred (图4)。这些结果表明,增加表面的膜结合NE活动可行和气道中性粒细胞激活与气道炎症有关,因此,肺功能下降和困气,可能扮演一个重要的CF肺病和先前未被发现的作用。
我们的研究提供了新的信息来源的高架活动CF肺部疾病。到目前为止,快速的细胞死亡和细胞溶解的中性粒细胞招募到CF航空公司,导致无法控制的被动释放到细胞外室,被认为是主要的机制增加了CF肺病(NE负担32]。然而,先前的研究发现的一个子集可行的中性粒细胞在CF航空公司(29日,32]。在归航的航空公司,这些激活中性粒细胞获得传统的表型,意外,动员的证据NE-rich颗粒细胞表面(29日,32]。我们的结果与烦恼传感器用来检测膜结合东北活动确认增加表面的表达不CF痰中性粒细胞和证明该池NE的蛋白水解活性在CF航空公司(图1 gydF4y2Ba)。值得注意的是,表面束缚不活动一直在CF中性粒细胞增加,即使免费痰上层清液不活动很低(图1 gydF4y2Ba)。这些结果表明,在CF航空公司的微环境,中性粒细胞收购这个激活配置增加表面束缚不活动即使在低水平的气道炎症,当自由不活动仍然包含内生antiproteases如α1抗胰蛋白酶和细胞外室(SLPI12,27]。
值得注意的是,表面束缚不了主要由内源性抑制剂抗抑制包括α1抗胰蛋白酶和SLPI33]。这表明该池表面束缚不活动可能在早期肺部疾病的特殊的意义与CF,年幼的孩子可能由于仍然完好无损antiprotease盾牌,经常显示没有检测到东北活动落下帷幕流体结构在胸部CT肺部疾病(尽管证据1,2]。的病理生理相关性增加表面束缚不活动的背景下,早期的CF肺部疾病是由以前的研究在βENaC-overexpressing老鼠CF-like肺病与早发性粘液堵塞、气道炎症和结构性肺损伤(22,34,35]。在小鼠模型中,水平气道嗜中性的范围∼5 - 30%的总细胞,因此类似的婴幼儿CF和远低于成人CF患者通常表现出≥90%中性粒细胞(1,2,22,24]。我们表明,antiprotease盾依然完好无损,没有免费的不活动是可检测BAL流体从βENaC-overexpressing老鼠,而气道中性粒细胞表面束缚不活动不断增加,类似于CF患者[我们的发现22]。此外,我们表明,基因删除不减少气道炎症,粘液分泌过多和结构性βENaC-overexpressing小鼠肺损伤(22,30.]。总的来说,这些研究表明,表面束缚NE活动可能是一个重要的球员在早期CF肺部疾病的发病机制,并可能解释为什么婴幼儿的子群与CF展示胸部CT肺部异常,即使没有免费的不活动落下帷幕流体(1,2]。
重要的是,我们的数据表明,高表面束缚不活动与成人CF患者肺部疾病严重程度表现出高水平的中性气道炎症和自由活动。像预期的那样(4,24,36),中性粒细胞计数,引发和MPO中性气道炎症标志物显著升高和自由不活动容易检测到在我们成年病人的痰样本群(图2和表2)。自由不活动增加与水平的提高不能绑定到α1抗胰蛋白酶和SLPI水平降低(表2)。由于自由NE (SLPI裂解和灭活12),这种模式表明antiprotease破损的盾牌。慢性CF气道炎症的在这种情况下,我们发现,包括免费的和表面束缚NE FEV反向相关的活动1% pred,使用最广泛的肺功能测试来评估气流限制和CF疾病进展(2- - - - - -4)(图4)。此外,我们的数据表明,表面束缚不活动,但不是免费的活动,显示与FRC直接相关pleth% pred肺恶性通货膨胀作为替代措施(图4)。这表明表面束缚不活动可能导致CF肺部疾病的严重性独立自由NE细胞外室。我们推测,这种差异可能与表面束缚不活动的直接影响,可能是介导集中的方式通过直接接触与气道上皮细胞激活中性粒细胞,其他结构或免疫细胞或细胞外基质。从高架FRC肺恶性通货膨胀,所确定的pleth% pred,可能反映了困气由于气流阻塞的小航空公司,或恶性通货膨胀由于肺气肿与远端空域结构肺损伤有关。先前的研究在βENaC-overexpressing老鼠表现出表面束缚不活动的作用在活的有机体内发病机理的粘液分泌过多,气道炎症和emphysema-like结构性肺损伤(22),和最近的胸部CT研究发现肺气肿形成成人CF患者(37,38]。基于这些研究,我们推测,CF气道中性粒细胞表面束缚不活动增加可能诱发疾病在小气道和肺实质的影响。此外,我们目前的数据表明,这cell-bound NE池活动可能是一个有前途的生物标志物的疾病严重程度和治疗策略的一个重要目标旨在抑制肺的CF患者的活动。
我们的研究也有一些局限性。首先,这个横断面研究没有提供信息之间的长期关系表面束缚不活动和CF患者肺功能下降。因此,未来更大的患者群纵向研究需要确定表面束缚NE的预测价值活动的生物标志物疾病严重程度和进展。确定表面束缚不活动预测肺急性加重和对治疗的反应,这样的研究应该包括测量之前,在发病和治疗后肺恶化。其次,本研究受限于缺乏胸部影像学研究。未来的研究包括胸部CT或磁共振成像结果的措施(39,40]来指定将起到至关重要的作用,本土化与表面束缚不相关联的结构异常,确定肺功能下降和肺恶性通货膨胀。第三,建立监测项目在婴幼儿CF,包括年度落下帷幕的角色将提供机会,以确定这cell-bound NE CF肺病年初,池结构肺病甚至可以发生在缺乏自由不落下帷幕流体活动(1,2]。我们希望协议捕获气道中性粒细胞表面束缚不活动建立和使用在目前的研究将有助于实现这些未来的研究。
总的来说,这项研究首次表明,东北活动痰中性粒细胞与CF患者肺部疾病的严重程度。我们发现东北活动持续CF表面痰中性粒细胞增加,即使在低水平的免费痰上层清液不活动。此外,我们表明,表面束缚不活动与肺功能指标的气流限制和肺恶性通货膨胀。这些结果表明,表面束缚不活动,可能反映出新鲜分泌池不抑制内源性antiproteases的东北,可能发挥重要作用的发病机理和作为一种新型生物标志物CF患者的疾病严重程度和潜在的其他慢性中性粒细胞肺疾病。
补充材料
确认
作者感谢所有的囊性纤维化患者的参与这项研究;伊冯·科赫和Susanne Korsten (Thoraxklinik海德堡大学医院,海德堡,德国)协助样本集合;和妮可•希思,弗兰克•斯坦Aliaksandr Halavatyi和Marko兰佩(TLRC显微镜实验室,海德堡)专家协助显微镜和数据分析。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:部分由德国教育与研究(82年FKZ dzl00401 FKZ 82 dzl004a1硕士商场和c·舒尔茨),欧盟委员会(European Commission)(第七框架计划项目603038号CFMatters硕士商城)和德国囊胞性纤维症协会Mukoviszidose汽车。(项目编号1605 A.S. >)。A.S. >被HRCMM支持(海德堡分子医学研究中心)职业发展奖学金。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
利益冲突:A.S. >报告从德国囊胞性纤维症协会授予Mukoviszidose汽车。海德堡(编号为1605)和分子医学研究中心的职业发展奖学金,在进行这项研究的。
利益冲突:f . Herth已收到拨款,个人费用和非金融支持诺华,基耶西,勃林格,阿斯特拉,吸收,Broncus, Pulmonx,奥林巴斯,BTG Ethicon,在提交工作。
利益冲突:c·舒尔茨2001年联合创立示剑,仍拥有该公司的一部分。示剑是唯一生产商担心探测器使用的手稿。
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- 收到了2017年9月20日。
- 接受2018年2月14日。
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