文摘
保护和不利影响的室内微生物暴露在哮喘已报告,但主要是在孩子。到目前为止,还没有研究成人一道方法用于检测室内细菌定量确认紧随其后。
横断面研究198哮喘和199名对照是在欧洲共同体进行呼吸道健康调查(ECRHS) II。DNA提取床垫灰尘细菌分析使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)。选定的乐队与哮喘测序和协会证实有四个定量PCR (qPCR)化验。
15与DGGE 37乐队发现,至少有一个暗示协会(p < 0.25)与哮喘、测序。的四个目标qPCRs,梭状芽胞杆菌集群XI确认保护协会与哮喘。协会是剂量依赖性(aOR 0.43 (95% CI 0.22 - -0.84)的第四位与第一四分位数,趋势p 0.009)和独立于其他微生物标记。一些重大协会观察其他三个qPCRs使用。
在这个大型国际研究的水平梭状芽胞杆菌集群XI是独立与哮喘的风险普遍较低。结果表明环境细菌也在成人哮喘的重要性,但是需要在将来的研究中得到证实。
文摘
微生物暴露在家里也可以从成人哮喘的保护,不仅在孩子http://ow.ly/7cnI30hzSox
介绍
目前的证据表明人类微生物组的重要性,在肠道和呼吸道,在免疫系统的发展和保护从系统性疾病,包括哮喘和过敏1,2]。人类微生物群源于我们的环境,由于城市化以来发生了巨大的变化。这使得环境微生物的变化有前途的候选人解释哮喘和过敏性疾病的发病率上升1]。
完善,环境微生物暴露可能导致呼吸道的不良效应。除了特定的微生物病原体引起呼吸道感染,这些影响包括呼吸道刺激和炎症和哮喘的发展从内毒素和真菌暴露在职业环境3)或湿气损坏住宅(4]。另一方面,生活在农场与股票或生活在家庭的孩子与狗1,2)降低哮喘和过敏症的风险比其他孩子,可能是因为接触环境微生物的定性和定量差异在室内。
环境微生物群的特点确定暴露导致不良或保护健康的影响在很大程度上仍是未知的1]。最近的研究强调微生物多样性的重要性(5- - - - - -7),但微生物暴露的数量和类型,以及可能的来源和生存能力仍可能是主要的重要性(8,9]。
这里我们报告之间的联系室内灰尘和细菌接触床垫普遍哮喘在一个大的国际成人ECRHS二人口中病例对照研究。我们使用变性梯度凝胶电泳(DGGE)作为一道DNA指纹图谱检测方法中含量最丰富的细菌组房子尘埃样本和发达qPCR定量的分析结果的确认。这是第一个研究成人哮喘使用一道检测方法相关的细菌暴露定量一起确认。
材料和方法
研究设计
欧洲共同体呼吸道健康调查(ECRHS)发起的多中心横断面研究成人哮喘和过敏(10]。后,受试者随访队列在ECRHS II 29-55岁22中心同意参与(完整的协议,请参阅http://www.ecrhs.org)。从所有参与者获得书面知情同意。这项研究是在每个地区经当地伦理委员会批准:雷克雅未克,冰岛(全国生物伦理委员会,雷克雅未克,冰岛);于默奥,乌普萨拉,哥德堡,瑞典(区域伦理委员会在乌普萨拉,瑞典);爱尔福特,汉堡,德国(伦理委员会的巴伐利亚州商会医师、德国);英国诺维奇(诺维奇地区伦理委员会);英国伊普斯维奇(Ipswich-East萨福克郡当地的研究伦理委员会);法国格勒诺布尔巴黎Bichat-Claude伯纳德(伦理委员会);西班牙巴塞罗那(拉西Etico de Investigacion我们德尔研究院市政de Asistencia疗养地,巴塞罗那,西班牙);阿尔瓦塞特省、西班牙(拉西德Etica e Investigacion de维生素Hospitalario族德阿尔瓦塞特省,西班牙); Oviedo, Spain (Comité Ético de Investigación Clínica Regional, Hospital Universitario Central de Asturias, Oviedo, Spain); Galdakao, Spain (Comité Ético de Investigación del Hospital de Galdakao, Spain); and Basel, Switzerland (Swiss Academy of Medical Sciences and the ethics committee of Basel).
本研究人群的选择ECRHS II用病例对照设计为中心频率匹配;198当前哮喘患者中心位于欧洲和199年不同的气候区域控制选择(表1)和床垫的尘埃样本199哮喘患者和198名对照为微生物内容进行分析。这样选择是基于以下标准:对“哮喘”ECRHS II,是的,“医生诊断”和“喘息”或“胸闷”或“活动后呼吸困难或静止的攻击”或“哮喘”或“当前药物”或“气短吵醒攻击”在过去的12个月。控制被定义为个人,他回答说没有“哮喘”ECRHS二世并没有“医生诊断”和“喘息”和“胸闷”和“活动后呼吸困难或静止的攻击”和“哮喘”和“当前药物”和“气短吵醒攻击”在过去的12个月。
尘埃样本
床垫尘埃样本收集在家访ECRHS II如前所述[11]。短暂、灰尘样本收集的80厘米×125厘米的参与者通常睡的床上。一个碱性集尘过滤器(ALK-Abello、Hørsholm、丹麦)附加到一个伊莱克斯绝对的真空吸尘器(1300 W),和地区是2分钟用吸尘器吸尘。尘埃是冻结在−20°C存储在帝国理工学院,伦敦,在这项研究中一个整除被派在干冰分析研究所国家健康和福利,Kuopio,芬兰。
微生物分析
床垫尘埃样本约20毫克首次精确加权和DNA提取使用bead-beating和内部标准,如前所述[12,13]。DGGE分析,一个大约200个基点片段的16 s rRNA使用普遍的细菌基因扩增引物,其中一个包含一个GC夹(14]。PCR产物分离为8% (v / v)聚丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺:bisacrylamide 37.5: 1, Sigma-Aldrich Schnelldorf,德国)。DGGE乐队模式被SYBR金染色和黑暗的读者呈现透照器(Dolores,克莱尔化学研究有限公司,美国)。数字图像捕获与佳能博秀G9和照片进行分析使用Bionumerics 4.7软件(应用数学、Sint-Martens-Latem、比利时)。
选择DGGE乐队被切除的聚丙烯酰胺凝胶使用PCR和放大。序列预处理包括质量检查和向量和引物序列排除了使用Pregap和Gap4 Staden包的项目(15]。焦磷酸测序管道分类器和Seqmatch核糖体数据库项目(RDP)包的工具16)被用来分配序列的细菌类群物种以上并选择参考序列进行系统发育分析。测序产品重新运行DGGE凝胶检查纯度和确定凝胶中的正确位置。
分析了梭状芽胞杆菌种虫害集群XI(早些时候发表17),但远期底漆略修改(表S1re-optimised)和试验。的葡萄球菌(金黄色葡萄球菌)试验(早些时候发表的18]。化验Corynebacterineae / Pseudonocardianeae集团(科里/ Pseu)棒状杆菌属amycolatum (Camy)集群是小说,是在开发这个项目。所有的引物、探针和qPCR条件提出了补充材料和表S1。
尘埃样本也分析了微生物的细胞壁标记:麦角固醇,真菌生物量的一个标志,3-hydroxy脂肪酸(3-OHFA)和胞壁酸,分别标记的革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌(19]。样品准备的麦角固醇和3-OHFAs19)和胞壁酸(20.)进行了早些时候与轻微的修改协议,并通过气相色谱串联质谱进行分析。的脂多糖(LPS)计算的总和的10到16链长3-OHFAs除以四(21]。
其他健康状况
血清特异性免疫球蛋白(Ig) E屋尘螨,盖草、猫枝孢属以及总IgE,测量使用淀粉微球帽系统(法玛西亚诊断,乌普萨拉,瑞典)。异位性被定义为至少一个特定的IgE水平> 0.35 kU·L−1(22]。
支气管hyper-responsiveness醋甲胆碱(BHR)进行23]。吸入时停止用力呼气量在1 s (FEV1)已经下降了20%或之后的最大累积剂量乙酰甲胆碱2.0毫克。醋甲胆碱的挑战进行了使用Mefar MB3剂量计(Mefar srl、Bovezzo、意大利)。剂量反应的斜率计算(22,24]。
哮喘的分数计算基于哮喘症状在过去12个月(25]。序数得分,范围从0到5项积极回应关于以下问卷中“是”的答案:喘息和呼吸困难,胸闷、气短的攻击休息,运动后呼吸急促和被吵醒气短。
统计分析
对分类结果分析(哮喘、特异反应性、喘息)进行使用多元逻辑回归模型,BHR使用线性回归和哮喘分数使用负二项模型。模型对特异反应性、BHR和喘息被逆抽样加权分数的情况下,控制,每个中心分开计算。哮喘得分分析了减重,调整状态(哮喘)。
密度的DGGE分析了乐队在三个类别(没有乐队,低于和高于平均密度)。
我们重复使用二分分析数据(带检测/ nondetected)但这导致小改变选中的乐队。QPCR标记分析的四分位数,除了QPCRc . amycolatum在三个类别(不是发现,低于和高于中位数)由于高患病率的检测。细菌多样性估计随着DGGE数量的乐队。
回归模型总是调整的中心和以下先验选择混杂因素:年龄、性别、父母的过敏,目前的吸烟和家庭密度。结果梭状芽胞杆菌集群习多年来进一步调整目前住在家里,床垫,潮湿的地方在家里,任何表面或发霉,有过敏证明盖上床垫,让一只猫或狗,让它进入卧室,和职业接触物质与哮喘相关的风险26]。这些进一步调整对观察到的效应估计几乎没有影响。
研究可能的关联的区域差异,中心被分成三个气候区:北部欧洲(雷克雅未克,哥德堡,乌米亚和乌普萨拉中心),欧洲中部(汉堡,爱尔福特,格勒诺布尔、伊普斯维奇诺维奇和巴塞尔中心)和欧洲南部(巴塞罗那,Galdakao,阿尔瓦塞特省和奥维耶多中心)。
大多数与SAS 9.3软件进行统计分析(SAS研究所Inc .卡里,数控,美国)。评估研究协会的形状,一个添加剂与利用薄板样条回归模型应用于普遍添加剂混合模型与集成平滑估计包(mgcv) [27在R 3.3.0版本。
结果
这项研究包括198名哮喘和199名对照29-55从14岁欧洲中心(表1)。情况下显然更特异反应性、支气管代和父母比控制过敏,而不同年龄、吸烟和拥挤是较小的。
DGGE分析,发现了37个不同的乐队在397年的床垫尘埃样本代表最主要的细菌种类或组。三个乐队被排除在进一步的分析,因为低的样品检测。所有其他的乐队都检测到至少在33个样本。15个乐队的存在至少有一个暗示协会(p < 0.25)与哮喘和选择排序(表2)。
根据测序结果,四个qPCRs床垫尘埃被开发或优化(表3)。
浓度的Corynebacterineae / Pseudonocardianeae集团和葡萄球菌0.47组的等级相关。所有其他qPCRs低于0.24之间的相关性。
qPCRs发达的定量分析梭状芽胞杆菌集群XI确认保护协会与哮喘观察分析DGGE的乐队。协会是剂量依赖和统计学意义(表4,图1)。图1显示了协会样条模型有四个自由度,但线性模型达到了最适合标准(低Akaike信息)。
没有证据表明改性效果的特异反应性(p = 0.9测试特异反应性和相互作用梭状芽胞杆菌集群XI)或时间住在当前家庭互动(p = 0.6)。也没有证据表明协会的梭状芽胞杆菌集群与哮喘XI北之间的不同,欧洲中部和南部表5,p = 0.89的测试与区域互动)。
观察到的优势比和哮喘假定值变化很小在进一步调整其他三个细菌组与qPCRs决定,细菌多样性或普通细菌和真菌生物量标记胞壁酸浓度,有限合伙人和麦角固醇(表6)。在这项研究中微生物多样性与哮喘的风险无关,第二tertile调整优势比为0.72 (95% CI 0.42 - -1.24)和第三tertile为1.34 (95% CI 0.78 - -2.29)相比tertile最低。
的浓度梭状芽胞杆菌集群XI也显著和剂量依赖性喘息(成负相关表S3)。没有明确的协会与其他次要观察结果,即。特异反应性、支气管代或哮喘的分数(表4和表S3)。
浓度Corynebacterineae / Pseudonocardianeae集团决定qPCR哮喘(没有显著相关性表3),但有一个倾向于保护协会(测试趋势p = 0.15)。虽然测试与区域互动并不显著(p = 0.23),该协会被认为只有在欧洲北部(表5),达到统计学意义。保护协会与喘息明显和剂量依赖的(表S3)。特异反应性的优势比显著低于最高四分位数,但协会不是线性(表3)。这些建议为保护协会Corynebacterineae / Pseudonocardianeae组有些的浓度与哮喘的风险增加与DGGE的乐队,在那里棒状杆菌属物种被发现(表2)。
的浓度c . amycolatum与哮喘相关的集群没有显著(表3),但有建议的风险增加特异反应性(p = 0.07,表3)和BHR (p = 0.07,表S3中间)组。的浓度葡萄球菌集团并没有与任何相关的研究结果。
讨论
在这个成人哮喘的研究首次使用一道检测方法相关的室内细菌与qPCR定量确认,梭状芽胞杆菌集群ξ与成人哮喘保护协会。协会是非常重要的,剂量依赖和独立的其他标记的微生物暴露的影响。一些协会观察其他细菌组与qPCR决定,但有一些建议与Corynebacterineae / Pseudonocardianeae组保护协会。
越来越多的证据表明,环境微生物暴露,尤其是在儿童早期,可能在怀孕期间可以保护从过敏疾病1,2]。最早期的流行病学研究都依赖间接标记增加微生物接触,如住在一个农场和家里有狗2),但是一些研究也测量标记细菌和真菌含量的灰尘。从这些研究结果倾向于支持保护作用的假设室内微生物接触,但是结果是矛盾的,可能是由于在这些研究中使用的有限数量的标记,他们的特异性差异1,28)和高组间关联不同标记(29日]。最近许多研究把重点放在了细菌的多样性(5- - - - - -7),或环境(30.)接触,但大量的曝光似乎仍然发挥作用(9),只有选择细菌的多样性对哮喘(可能是有益的8]。很少有研究进行了一次没有针对性寻找微生物室内灰尘含量的差异,目的是探索哮喘的关系(7,31日- - - - - -34),目前的研究是我们的知识首先表现在成人。
我们确定了然后确认使用定量PCR逆之间存在剂量依赖的相关性联系梭状芽胞杆菌集群XI浓度床垫尘埃和普遍的哮喘。梭状芽胞杆菌是革兰氏阳性细菌,无处不在的环境。他们发现在土壤、污水、海洋沉积物和粪便35,36]。梭状芽胞杆菌物种也同桌的肠道菌群的一部分,从女性生殖道孤立和口腔黏膜35]。梭状芽胞杆菌集群XIVa和IV占了很大一部分(10 - 40%)总细菌的肠道微生物群,在动物实验中被证明能够促进抗炎免疫反应通过激活调控t细胞(37]。大多数梭状芽胞杆菌和宿主共生的关系。的唯一疾病一个清晰的因果作用的dysbiotic肠道微生物群已经证明的情况下梭状芽孢杆菌感染。浓度的增加梭状芽孢杆菌在肠道被报道与剖腹产分娩和儿童哮喘的风险增加(38]。儿童在早期研究中使用微生物方法与本研究相同,高水平的梭状芽胞杆菌习集群在床垫尘埃与更少的特异反应性有关,但不是哮喘(39]。
虽然人类的粪便是梭状芽胞杆菌的重要来源,几行推理表明观察之间的联系梭状芽胞杆菌集群XI和哮喘在当下横断面研究与反向因果关系,如。更好的卫生实践在哮喘患者(40]。首先,我们观察到小哮喘与qPCRs协会葡萄球菌和Corynebacteriales/Pseudonocardiales,从人体皮肤重要来源和粪便。此外,之间的关系梭状芽胞杆菌集群XI和哮喘没有受到调整为其他微生物标记床垫尘埃,这也应该受到更好的卫生。
梭状芽胞杆菌集群习也重要的环境资源。在我们以前的研究39更高水平的),我们观察到几次梭状芽胞杆菌集群XI床垫尘埃的生活在农业家庭的孩子比那些生活在城市家园。这是进一步探索一个新的接触研究重复尘埃样本从五个城市住宅和四个家庭在活跃的农场牲畜,我们发现几次更高水平的梭状芽胞杆菌集群XI农业家庭不仅在床垫尘埃样本,而且在地板上灰尘和个人空气样本(未公开的数据)。本研究城乡差异是Corynebacterineae / Pseudonocardianeae组小得多。
综合这些结果表明环境中接触的重要性梭状芽胞杆菌集群XI细菌。这些细菌是否发挥他们的潜力影响哮喘和过敏通过殖民的肠道37)或呼吸道(41或通过短暂的刺激,需要在将来的研究中确认的。
正如上面所讨论的,我们的研究的主要限制是它的横断面的本性。潜在的方法论的限制是有限的解决DGGE用于细菌指纹与下一代测序(上天)方法。上天得方法,或更具体地说扩增子测序或宏基因组鸟枪测序,检测微生物多样性比DGGE,这或许可以解释为什么没有明确的多样性和哮喘之间的关系是目前研究中发现。另一方面,指纹识别方法,如DGGE、显示丰富的样品中细菌种类越多,同样应被视为力量,这些更丰富的类群可能也代表了更多的相关组织对干扰人类健康。指纹识别方法也被成功地应用在哮喘和过敏症(最近的研究5- - - - - -7,34,39]。大量的丰富的类群少被上天也复杂意义的统计分析和识别个体,相关风险敞口。无论是上天还是DGGE完全量化。这强调了使用qPCRs确认结果的重要性,这不是常见的做法,但在这里完成。一般来说,基于DNA的方法,包括PCR,包括DGGE和扩增子测序,比较容易受到期间推出的偏见中提取DNA的DNA提取、PCR扩增,这可能导致优先检测微生物物种或组。然而,这样的偏见可能会影响房屋的哮喘病患者样本和non-asthmatics同样,所以几乎没有假阳性结果的关注,而未能检测到其他相关微生物类群的可能性不能排除。
虽然中心包括都是欧洲主要城市的研究中,本研究的力量,它涵盖了大量的中心与不同类型的气候和其他条件。然而,没有迹象表明协会梭状芽胞杆菌习集群与哮喘不同地区的欧洲,这表明好观察协会generalisability高收入城市地区。另一方面,目前的设计可能不够力量来检测微生物的重要性只有在更具体的领域或条件。这是观察到的重要协会建议的Corynebacterineae / Pseudonocardianeae组哮喘在欧洲北部,当没有协会被认为在欧洲的其他地方,但是测试这个地区之间的差异没有达到统计学意义。
在这种大的国际流行成人哮喘病例对照研究,梭状芽胞杆菌习集群被确认为可能哮喘保护细菌组基于一道寻找细菌床垫尘埃。结果证实了使用目标定量PCR分析梭状芽胞杆菌集群。与哮喘的关系是非常重要的,剂量依赖和独立的其他标记的微生物暴露的影响。结果需要重复在前瞻性研究,但研究结果表明环境中接触的重要性梭状芽胞杆菌集群XI细菌哮喘。
补充材料
披露的信息
确认
作者要感谢阿伊努人Nevalainen, Asko Vepsalainen和实验室人员生活环境研究所国家单位的健康和福利。我们感谢Miia Pitkaranta DNA测序和赫尔辛基大学的基因组学实验室执行DGGE乐队的测序。
作者的贡献:j . Pekkanen m . Valkonen m . Taubel d·贾维斯j·海因里希和a . Hyvarinen设计研究;c . tisch J.P. Zock l·卡萨斯,n . Probst-Hensch b . Forsberg销,c·延森·m·霍尔姆(t . Gislason d·贾维斯和j·海因里希提供数据库和尘埃样本;m . Valkonen m . Taubel h . Leppanen点Karkkainen和h Rintala监督并进行了实验室分析;Pekkanen和m . Valkonen监督统计分析;j . Pekkanen m . Valkonen和m . Taubel写的手稿,并主要负责最后的内容;所有作者阅读、编辑和批准最终的手稿。
脚注
可以从本文的补充材料www.qdcxjkg.com
支持声明:这项工作是由欧盟委员会(European Commission)的一部分HITEA(室内污染对健康的影响:集微生物、毒理学和流行病学方法),授权协议。211488年第七框架计划。ECRHS内灰尘样本集合是由欧洲委员会资助,作为他们的生活质量计划的一部分,(授予代码:qlk4 - ct - 1999 - 01237)。玛丽亚Valkonen芬兰东部经济的工作是由大学的博士学校和Yrjo Jahnsson基础。莉迪亚卡萨斯是收件人研究基金会博士后奖学金的弗兰德斯(FWO),格兰特12号i1517n。ISGlobal CERCA项目的一员,Generalitat de加泰罗尼亚。资金信息,本文已沉积的Crossref资助者注册表。
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- 收到了2017年6月22日。
- 接受2017年11月18日。
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