摘要
基底样癌是非小细胞肺癌(NSCLC)的一种罕见变异,在许多研究中显示预后不良。虽然它被认为来自于多能性肺干细胞,但在这种变体中干细胞抗原的表达和临床意义尚不清楚。
Stage-specific胚胎antigen-4(SSEA-4)的免疫组化分析38例早期基底样非小细胞肺癌患者,中位随访72.9个月。的表达SSEA-4与临床病理特征、成人干细胞抗原CD117、CD133和CD4的表达有关乳腺癌抗性蛋白1(BCRP1)和预后。
SSEA-437%的标本呈阳性,与临床病理特征或成体干细胞抗原表达无关。Cox比例风险回归分析显示,在乳腺癌中,复发风险增加了6.0倍(p = 0.001),疾病相关死亡率增加了4.2倍(p = 0.017)SSEA-4艾滋病患者,SSEA-4-阴性患者的预后与其他早期NSCLC相当。
SSEA-4在部分类基底细胞非小细胞肺癌中表达,并与不良预后相关。
Basaloid肺癌是肺鳞状细胞癌(SCC)或大细胞癌的一种罕见变异,占所有非小细胞肺癌(NSCLC)病例的4.8-6.3% [1,2].相比整体NSCLC,时间埋葬存活率,平均40 - 60%,中位生存时间∼50个月阶段I / II疾病,分析两个欧洲集体包括38和90名嗜碱性NSCLC患者显示的时间埋葬存活率显著降低10 - 27%和更短的平均生存时间为20 - 29个月1,3.- - - - - -6].这些癌的基底细胞表型以及它们与几乎所有非小细胞肺癌的组织学亚型共同出现,很快就导致了一种假设,即这种变异源自多潜能肺干细胞[1,5,7].近年来,一些在体外和在活的有机体内研究表明非小细胞肺癌中存在干细胞样细胞。其特征是:表达干细胞抗原,如CD117、CD133和/或乳腺癌抗性蛋白1(BCRP1);原发肿瘤再生的能力;转移能力增强;以及耐药性[8- - - - - -10]早期疾病的研究表明CD133和BRCP1预测肺切除术后复发风险和疾病相关死亡率增加[11,12].与成人干细胞抗原相比,胚胎干细胞抗原在肺癌中的表达及其意义尚不清楚。鉴定ESC最常用的标记是糖脂糖表位阶段特异性胚胎抗原(SSEA)-3和-4还有转录因子Oct-4[13].最近的研究表明Oct-4在具有干细胞特性的NSCLC细胞亚群中,这种抗原在具有鳞癌生长模式的腺癌中具有不利的预后意义[14- - - - - -17].相比之下,SSEA-4,是非常早期ESCs的特征,目前还没有在畸胎癌、睾丸生殖细胞肿瘤和卵巢癌的单一研究中进行分析,但在肺癌中没有[18- - - - - -20.].目前还缺乏干细胞抗原表达的分析,特别是在基底样非小细胞肺癌中,它主要被认为与肺干细胞有关。在我们的研究中,我们分析了38例完全切除的I/II期基底样NSCLC患者的肿瘤组织,以了解其表达和预后意义SSEA-4.结果与临床病理特征及成体干细胞抗原CD117、CD133、CD117的表达有关BCRP1.
材料和方法
患者和样本特征
分析了38例未经手术治疗的2002岁至2009岁的基底细胞样非小细胞肺癌患者,他们在Thoraxklinik、海德堡、德国、德国的胸外科手术室进行了分析。组织标本和随访数据是从组织库和肺癌登记处的索拉克利尼克和组织银行的国家肿瘤疾病中心(NCT),海德堡大学。在2000年修订《赫尔辛基宣言》和海德堡医学院当地伦理委员会的指南后,患者已给予知情同意。根据德国呼吸学会2010年发布的指南进行术前和随访评估[21].分期根据第七版TNM恶性肿瘤分类确定[3.].详细的病人特征列于表1.
组织学分类
基底样NSCLC变异的组织学分类基于2004年修订的世界卫生组织肿瘤分类标准,包括:1)从支气管和/或腺管内衬以手指状侵袭性生长的实性小叶或吻合小梁模式;2)细胞小,平均直径12-15 μm,立方到纺锤形,胞浆少,但可见,核中度深染,无核形或核仁突出;3)肿瘤小叶周围呈栅栏状排列,细胞呈放射状排列;4)每10个高倍场有丝分裂指数≥15-44 [22].苏木精染色组织切片用于组织学分类和分级。鳞状变异体的诊断是基于肿瘤区域<50%的基底细胞成分中存在细胞间桥或单个细胞角化。此外,分析了神经内分泌(NE)标记物神经元特异性烯醇化酶、突触素、嗜铬粒素A、CD56和高分子量细胞角蛋白(HMWCKs) 1、5、10和14的表达,以排除大细胞神经内分泌或小细胞癌。当hmwck表达,且缺乏至少一个特定NE标记的清晰染色时,基底样癌的诊断得以维持。
免疫组化和免疫细胞化学分析
如前所述,由NCT组织库制备福尔马林固定的石蜡包埋肺切除组织的组织微阵列(TMA)[23].对于每个病人,肿瘤中心的两个1.2 mm直径的组织中心,侵袭前部和组织学上正常的肺组织被发现。另外,在一半的病例中,还制备了整个组织切片。用二甲苯对TMA或整个组织的2 μm切片进行脱链,并在分级醇系中复水。为了提取抗原,切片在pH为6的靶向提取缓冲液(Dako, Glostrup, Denmark)中煮沸15分钟BCRP1此外,染色被亲和素-生物素处理阻断。随后的步骤在免疫染色装置(Autostainer;Dako)。简单地说,切片与一抗共孵育30分钟,用PBS/Tween 20洗涤,与二抗共孵育20分钟,再洗涤。用过氧化物酶阻断液(Dako)孵育5分钟阻断内源性过氧化物酶。以AEC为显色原,基于亲和素-生物素过氧化物酶原理进行检测(Dako REAL Detection System peroxidase /AEC, Rabbit/Mouse)。切片用Mayer's苏木精反染色5分钟,并用盖片在Aquatex安装介质(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)中安装。使用了以下一抗、克隆抗体和稀释剂:SSEA-4(克隆mc - 813 - 70, 1:10 0;Millipore, Billerica, MA, USA), CD117(多克隆,1:50,Dako), CD133(多克隆(ab19898), 1:100;Abcam plc, Cambridge, MA, USA),BCRP1(克隆BXP-21, 1:10 0;Abcam), Ki67(克隆MiB1, 1:200;克隆1B6, 1:50;Novocastra, A. Menarini Diagnostics Deutschland, Berlin, Germany), synaptophysin(克隆27G12, 1:40 00;Novocastra),神经元特异性烯醇化酶(克隆米格- n3, 1:10 000;DCS Innovative diagnostics - systeme Dr. Christian Sartori GmbH & Co. KG, Hamburg, Germany), synaptophysin(克隆LK2H10, 1:10;Abcam)和HMWCK (34βE12克隆,1:100,Abcam)识别细胞角蛋白(CK) 1,5,10和14。阴性对照省略一抗。来自NCT组织库的畸胎瘤组织作为阳性对照SSEA-4. 分析SSEA-4在非肿瘤条件下的表达,使用有自发性气胸的健康受试者的肺组织,由NCT的组织库提供。分析由两位独立观察者(E. Herpel和P.A. Schnabel)进行。如果有分散表达或至少有一个明显染色的病灶存在,则认为样本为阳性。使用Aperio ImageScope v10.1.3.2028软件(Aperio Technologies Inc., Vista, CA, USA)对TMA进行400倍放大扫描。
人胚胎癌细胞系NTERA-2(Deutsche Sammlung für mikro有机体und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany)和类基底NSCLC细胞系2427吨分别按供应商指示或以前公布的标准培养[24,25].免疫细胞化学分析,每100万个细胞旋NTERA-2或2427吨细胞在Shandon CytoSpin III细胞离心机(Fisher Scientific GmbH,Schwerte,德国)中制备。用中性缓冲10%福尔马林固定细胞5分钟,在pH值为6的目标提取缓冲液(Dako)中煮沸15分钟,并用Triton X-100渗透10分钟。所有后续步骤如上所述进行。
统计分析
随访被定义为带有反向状态指标的Kaplan-Meier估计。死亡截尾了真实但未知的观测时间,截尾被解释为终点。因此,对死亡患者不可观察的随访时间被解释为如果患者没有死亡,可能获得的随访时间。生存时间确定从第一次诊断到最后一次随访或报告的死亡。非疾病相关死亡被审查。无病生存期从首次诊断之日起至诊断复发或疾病相关死亡之日止。生存时间采用Kaplan-Meier法和log-rank检验。多因素分析采用χ 2检验和Wilcoxon秩和检验评价组间差异。p值<0.05被认为有统计学意义。采用SAS®9.2版(SAS Institute, Cary, NC, USA)进行统计分析。
后果
表达SSEA-4在碱性非小细胞肺癌
对38例I/II期基底样NSCLC患者的组织标本进行分析SSEA-4.标本包括24个纯基底样癌,13个带有鳞状细胞癌成分的基底样癌和1个带有腺癌成分的基底样癌。在所有标本中,基底样成分占肿瘤体积的≥60%。SSEA-438例标本中有14例(37%)表现弥漫性膜质/细胞质表达(图1a和2).阳性对照是畸胎癌,同样显示弥漫性胞浆/膜质,在一些细胞中还显示核染色(图2 b).在NSCLC标本中,阳性染色仅限于基底样成分,而分化良好的腺癌(AC)或SCC成分为阴性SSEA-4(图2 c和二维).患者和健康受试者的肺泡上皮均为阴性SSEA-4(图1i和2 e),而气管支气管上皮基底细胞呈膜质/胞质染色,纤毛细胞顶端细胞极呈胞质积聚(图1e和2 f).所有标本对HMWCK均表现出反应性,但没有明确表达特定的NE标记(图3).值得注意的是,基底样NSCLC细胞系2427吨显示了与干细胞相关的特性,即在动物模型中具有较高的致瘤性和重组原肿瘤组织形态,并表现出表达SSEA-4.同样,阳性对照,胚胎癌细胞系NTERA-2膜质/细胞质染色明显(图4).
SSEA-4、临床病理特征及成体干细胞抗原
的表达SSEA-4与临床病理特征及成体干细胞抗原表达无相关性(表1和2).47%的人CD117阳性,BCRP150%的肿瘤中有CD133, 5%的肿瘤中有CD133。CD117显示弥漫性膜质和/或细胞质染色(图1b, f和j),而BCRP1另外显示核染色和主要灶性表达(图1d、h、l).患者肺泡上皮成体干细胞抗原阴性(图1我),而气管支气管上皮基底细胞和部分纤毛细胞胞质表达CD117,核表达CD117BCRP1在大多数纤毛细胞中(图1情况).
预后的意义SSEA-4
中位随访时间为91.4个月SSEA-4-阳性和70.2个月SSEA-4-阴性的患者,明显更多的个体SSEA-4-积极的SSEA-4-阴性肿瘤复发(79%)与21%, p = 0.0005)。除一次复发外,所有复发均为远处复发(表1).5年生存率SSEA-4-阳性患者占35%SSEA-4负80%的病人。Cox比例回归分析显示,复发风险增加了6.0倍(风险比(HR) 6.0, 95% CI 2.1-17.4;p = 0.001),疾病相关死亡风险增加4.2倍(HR 4.2, 95% CI 1.3-13.7;P = 0.017)SSEA-4阳性的肿瘤(图5a和5 b).这些患者中位无病生存期为11.1个月,中位总生存期为45.0个月,而中位无病生存期和总生存期为SSEA-4-未发现阴性肿瘤。
讨论
Basaloid肺癌是一种罕见的NSCLC变异,在许多研究中显示预后不良[1,5,6].Brambillaet al。[5他是第一个描述这种变异的人,早在1992年就推测基底样非小细胞肺癌可能来源于多能肺干细胞。虽然少数研究表明,胚胎和成体干细胞抗原的表达和不利的预后意义,如SSEA-1,Oct-4、CD133和BCRP1在非小细胞肺癌中,特别是基底样肺癌的分析目前还缺乏[11,12,16,17,26,27]在我们分析38例早期基底样非小细胞肺癌患者的研究中,我们发现早期ESC抗原表达SSEA-4在37%的标本中,与复发风险增加6倍和疾病相关死亡率增加4.2倍相关。而患者SSEA-4-阴性肿瘤的复发率为21%,5年生存率为80%SSEA-4-阳性肿瘤复发率为79%,5年生存率为35%。不分层SSEA-4,整个群体的复发率(42%)和5年生存率(62%)与整体早期NSCLC或低分化SCC (PDSC)的报告相似[1- - - - - -6].这与B的结果形成了对比rambilla和同事(1,5,6,他们报道了基底样癌的预后明显差于其他NSCLC或PDSC:后者在I/II期的5年生存率分别为44%和47-55%,而早期基底样NSCLC的5年生存率为10-27% [1,5,6].相反,前人对K即时通讯et al。[2)和W盎et al。[28]在两个亚洲组中同样显示了相似的基底样癌和PDSC复发率(33-55%)和5年生存率(50-57%)。我们的研究结果可能是以往研究结果不一致的原因之一,因为患者的随机积累SSEA-4-阳性肿瘤可能导致整个研究人群基底样NSCLC的预后更差。然而,这些研究之间的差异还需要考虑其他几个因素,包括技术方面、研究者在鉴别基底样非小细胞肺癌时的可变性、分期系统的变化、手术过程和术后治疗阶段的差异、临床评估的间隔和类型的差异,以及被分析对象的数量、随访时间和研究人群的临床病理特征的差异。此外,在最近的K即时通讯et al。[2), W盎et al。[28)和Waechteret al。[29].
除临床意义外,早期ESC抗原的表达SSEA-4基底样癌和气管支气管上皮的基底细胞是一个重要的病理生理学方面,支持Brambilla等.[5].与胚胎癌细胞系中这种糖脂抗原的快速下调一致2102 ep,BG01V,NTERA-2而在囊胚来源的ESC分化时,我们没有发现表达SSEA-4基底样NSCLC中分化良好的肿瘤成分[30.- - - - - -34].此外,最近建立的类基底NSCLC细胞系显示了与干细胞相关的特性,即在动物模型中具有较高的致瘤性和重组原肿瘤组织形态,并表现出表达SSEA-4[25].然而,由于目前尚缺乏明确的模型系统和条件来评估肺细胞的多系分化能力,因此,肺细胞多系分化能力的性质尚不明确SSEA-4-阳性细胞在气管支气管上皮和一些基底样NSCLC中仍有待阐明。就目前的研究而言,结果表明部分基底样癌保留了其假定来源细胞的胚胎抗原表达,而其他的要么缺乏任何干细胞抗原,要么只表达成体干细胞标记。我们可以推测这些癌是来自更多的(干细胞)细胞还是在肿瘤生长过程中发生分化。CD133和BCRP1在气管支气管上皮基底细胞中,但局灶性表达BCRP1在一些SSEA-4-阳性肿瘤提示有瘤内分化的能力。
TMA的代表性在局部表达抗原中起着至关重要的作用,如BCRP1, TMA是根据最近肺癌和间皮瘤的验证数据制备的,该数据表明,每个样本3至4个组织芯足以产生可靠的结果[35- - - - - -37].此外,半数病例的TMA结果与相应的全组织切片进行了比较,结果显示完全一致。
有早期ESC抗原的表达SSEA-4在基底样癌和气管支气管上皮的基底细胞中,转录因子和原癌基因原癌基因必须作为这种非小细胞肺癌变异的潜在分子驱动因素进行讨论。原癌基因代表与体细胞重编程早期步骤密切相关的因素之一,是诱导胚胎基因表达谱的调控网络的中心,尽管在癌细胞中没有多能性[38,39].根据方法的不同,5.6-80%的nsclc显示该基因的扩增,48-58%的nsclc显示过表达[40- - - - - -42].值得注意的是,在正常的气管支气管上皮中,基底细胞的表达值最高,由这些自然祖细胞产生的肿瘤可能本身显示ESC功能[42]到目前为止,作者尚不清楚基底样肺癌的研究或亚组分析会对患者的病情进行分析原癌基因或者这种变异的基因图谱。我们自己的比较基因组杂交和多重荧光原位在细胞系建立的背景下,对基底样NSCLC的两个原发肿瘤和一个淋巴结转移进行杂交分析,发现8q24基因位点的扩增一致原癌基因[25].
尽管如此,具有ESC特征的肿瘤细胞的存在可能为非小细胞肺癌提供新的治疗选择和靶点:糖脂抗原,如SSEA-4而胚胎信号通路,如Wnt/β-catenin、hedgehog或notch,可能是小分子抑制剂的靶点[43,44].
结论
本研究证实了ESC抗原的表达SSEA-4在少量基底样非小细胞肺癌和气管支气管上皮基底细胞中。患者SSEA -4阳性肿瘤显示复发风险和疾病相关死亡率显著增加。由于本研究的样本量有限,因此无法给出明确的结论,SSEA-4可能代表了一个很有前途的候选者,用于识别将受益于术后辅助治疗的基底样非小细胞肺癌患者。
致谢
作者感谢B.Walter(组织银行,德国海德堡国家肿瘤疾病中心)提供的出色技术援助。
脚注
利益陈述书
没有人申报。
- 收到了2011年12月23日。
- 接受2012年5月30日。
- ©2013人队