抽象的
维生素D刺激可能抑制肿瘤的抗血管生成和凋亡因子的转录,而维生素D结合蛋白(DBP)可以是小鼠肺癌模型的生物标志物。我们试图确定维生素D轴是否在肺癌中改变或影响预后。
148名肺癌患者,68名其他胸腔内癌症患者和33名非癌症对照组进行了长达5年的研究。比较两组间循环舒张压和维生素D水平,并通过Cox回归分析评估其对生存的影响。采用Western blot和免疫组化方法检测DBP和维生素D受体(VDR)在肺癌细胞系及正常和肿瘤肺组织中的表达。
低血清DBP水平预测肺癌特异性死亡(P = 0.04),DBP在Western印迹和免疫组化的肺癌细胞中表达不当。维生素D未预测癌症存活,VDR表达在肿瘤中是可变的。
血清DBP的保存是与经营肺癌患者的更好癌症结果相关的重要独立因素。鉴于DBP在巨噬细胞激活和异常细胞间隙中的既定作用,还有进一步研究其对肺癌的参与。
维生素D是一种脂溶性维生素,以其在钙和磷酸盐平衡中的作用而闻名。越来越明显的是,维生素D对骨骼系统以外的健康也有好处。血清胆钙化醇(维生素D3.)至25-羟基胆妥甲嘧醇(25Ohd3.)是维生素D状态的最佳指标,因为它反映了皮肤生产以及食品和补充剂的摄入量,而1,25-二羟基胆妥甲嘧醇(1,25(OH)2D.3.)有一个短的半衰期,血清浓度严格调节[1].据报道,维生素D状态与癌症风险相关,并在预防结肠,前列腺和乳腺癌中发挥作用[2]但虽然较少是关于其对肺癌的影响。没有任何可用的流行病学作品能够确定维生素D缺乏赋予的风险水平,因为肥胖和阳光照射的肥胖和数量的混淆。
维生素D可以通过降低细胞增殖,侵袭性和血管生成,刺激细胞凋亡来抑制肿瘤进展[2-4.].它还保护各种肿瘤模型中的转移,包括肺部[2-4.].为了使维生素D发挥其细胞内效应,当与其主要载体蛋白质(DBP)结合时,它必须通过扩散或内吞作用进入细胞。在细胞内,维生素D从DBP解离,然后经过一系列反应,使得能够与维生素D受体(VDR)相互作用,这是我们之前的工作中所示的过程[5.].有一些建议,肺癌中VDR表达减少[6.,这意味着维生素D发挥其抗肿瘤作用的能力将减弱,因此维生素D轴的其他方面可能更为重要。
DBP是一种糖基化α-球蛋白,部分白蛋白超家族,是左右的〜58kDa,在肝脏中产生,主要位于血清中。它分为两个大型结构域(I和II)和羧基末端的较短域(结构域III)[7.,并在许多组织中表达[8.[中性粒细胞[9.].它有助于巨噬细胞激活[10.],增强单核细胞和中性粒细胞趋化性至C5衍生的肽,并作为我们最近讨论的讨论的actin清除剂蛋白作用[5.].它可能在恶性肿瘤中发挥作用,因为它对巨噬细胞的影响,这是由于它们潜在地清除异常组织的重要性[11.].事实上,在肺癌中,肿瘤内的细胞毒性巨噬细胞的数量可以预测生存率[12.].维生素D轴可以以两种方式优化巨噬细胞的抗肿瘤作用。首先,DBP可以通过脱糖基化转化为有效的巨噬细胞激活因子(MAF)[10.].因此,在DBP低表达或低转化为DBP- maf的组织中,巨噬细胞的激活将是次优的。尽管我们之前已经证明DBP存在于气道分泌物中,但对肺组织中DBP的表达知之甚少[13.].其次,巨噬细胞可以转换25Ohd3.到1,25(哦)2D.3.[14.],从而优化这些细胞中抗肿瘤基因转录的下游效应。
我们假设维生素D轴可能会在肺癌中改变,并对预后的关系产生不利:这可能是由于维生素D缺乏,无能为力地响应维生素D,或者在和周围的DBP-MAF降低巨噬细胞活化肿瘤。
方法
维生素D轴血清标志物的预后作用
从2006年至2009年期间,从英国NHS基金会信托(HEFT)核心的胸部手术名单连续招募患者。血清样本在几个时间点进行,作为俱乐部(肺生物标志物的癌)研究的一部分,一个前瞻性研究潜在的肺癌生物标志物已被描述[15.].目前的项目是替代的,仅选择剩余术前样品的替代品。这促成了148例肺癌患者,68例患有其他胸腔肿瘤和33例非癌症控制。记录了人口统议特征,肿瘤组织学和病理学期,手术型,切除边缘,烟雾暴露和合并症。病理分期被认为是黄金标准,并已更新,以反映非小细胞肺癌(NSCLC)的最新分期指导[16.].肺癌患者随访,最多5年和使用癌症情报(布里斯托尔,英国)数据评估的存活。该研究得到了当地伦理委员会的批准,所有患者所有患者都提供了知情同意。25Ohd.3.通过串联质谱法测量Heft。DBP是由特定ELISA(Immunodiagnostik,Bensheim,Beraness)测量的。
肺癌和正常肺组织VDR和DBP的评估
从2009年和2010年在25名患者中获得肿瘤和Nontumour肺组织。在切除切除后,肺部立即携带到病理系中,以10%的福尔马林在25 cmh的恒定压力下进行通货膨胀。2O.通过主要气道的插管,一旦充气,浸入福尔马林24小时。通过单个病理学家选择来自肿瘤和肿瘤嵌段的正常肺部的代表性块用于随后的染色。VDR和DBP都使用具有Ultraview Technology(Ventana,Tucson,AZ,USA)的基准XT系统染色。使用的主要小鼠单克隆抗体是反VDR(D-6; Santa Cruz Biotechnology Inc.,Santa Cruz,CA,USA)和抗DBP(A0021;达科,英国,英国)。两种抗体染色涉及30分钟的抗体检索步骤,然后孵育32分钟。VDR抗体稀释1:100和DBP抗体1:10,000。在抗DBP协议中使用另外4分钟的血红素宿主。VDR协议改编自用于肺组织的发表[6.]和DBP协议来自于肾组织的发表[17.].阳性对照是肾组织(VDR)和肝脏(DBP);使用标准的半定量技术通过染色强度的标准半定量技术确定阳性染色[18.].
肺癌细胞系VDR和DBP评估和正常肺组织
在我们之前的工作中描述了癌细胞系,并如其中所示培养[19.].NCI-231最初是由Y. Shimosata(日本东京国家癌症研究所)于2003年送给I. Tachibana的礼物。A549, NCI-H292和NCI-H69购自美国类型文化收藏(Manassas, VA, USA),并于2003年获得认证。Lu65和Lu99购自理研生物资源细胞中心(日本茨城县),2003年经源头鉴定。HARA也是在2003年从保健科学研究资源中心(日本东京)购买。所有细胞在实验前均通过流式细胞术检测神经细胞粘附分子表达(阳性或阴性;数据未显示)和支原体感染(均为阴性),如我们之前的工作所述[19.].
将细胞溶解在含有:1%Triton X-100的缓冲液中;0.1%十二烷基硫酸钠(SDS);1 mm EDTA;10 mm tris / hcl,pH 7.5;150mM氯化钠;0.01%叠氮化物;和蛋白酶抑制剂鸡尾酒(西格玛,普尔,英国)。使用洗涤剂相容的蛋白质测定(Bio-rad,Hemel Hempstead,UK)测定裂解物的蛋白质浓度,并在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离45-μg还原样品。将蛋白质转移到聚偏二乙烯基氟化物膜中并用鸡抗DBP,兔抗VDR或小鼠抗微管蛋白抗体(所有SIGMA)探测。对于DBP和管蛋白印迹,二次抗体是使用奥德赛红外成像系统(Li-Cor,Lincoln,Ne,USA)的可视化的IRDYE 800CW-缀合。 For VDR blots, the secondary antibody was horseradish peroxidase-conjugated (Thermo Scientific, Erembodegem, Belgium) for visualisation using Pierce ECL chemiluminescence reagents (Thermo Scientific) and Hyperfilm (Amersham Biosciences, Amersham, UK), which was developed using a film processor (Curix 60; AGFA, Brentford, UK).
统计分析
所有分析都在SPSS版16.0(芝加哥,IL,USA)中进行。使用Kolmogorov-Smirnov试验评估临床数据正常性(正常,P> 0.05);参数数据报告为平均值±SEM.和非参数数据作为中值(范围)。组间参数数据均数比较采用未配对t检验,非参数数据采用Mann Whitney或Kruskal-Wallis检验。频率变量的比较采用卡方检验。这些分析使用了多次检验的Bonferroni校正,意味着未经调整的总体显著性p值为0.01。采用年龄、性别、烟雾暴露、组织学类型和癌症分期、DBP或维生素D水平作为预测因素,对切缘明确的非小细胞肺癌患者进行多因素Cox回归分析。舒张压以四分位数评估,而不是作为一个连续变量。所有维生素D的比较都考虑到了收集季节,正如我们之前的工作所描述的[13.].在没有Bonferroni校正的情况下,P <0.05假定统计学显着性。
结果
维生素D轴血清标志物的预后作用
显示患者的特征表格1。没有在录取手术时服用规定的维生素D补充剂。两种癌症组之间没有显着差异(所有P> 0.05)。非癌症控制较年轻,更可能是男性,并且已经跟进较少的较少(p = 0.03,p <0.01和p = 0.02)。
显示肺肿瘤的组织学和其他患者组的病理学图1。鳞状细胞癌是最常见的肺肿瘤,而Oesophageal癌症形成了大多数其他癌症。六名患者有小细胞肺癌,并被排除在进一步的分析之外。在NSCLC病例中,病理阶段分布如下:27例患者;IB,45名患者;IIA,11名患者;IIB,10名患者;IIIA,22名患者;和IIIB,七名患者。20例,由于给出的详细程度,无法从病理学报告中确定新分期。 Among the other cancers, all oesophageal patients were stage IIa or IIb, all mesothelioma patients were stage II, and of the two lymphoma patients, one was stage II and one stage III.
如预期的那样,胆总霉素随着收集季节而变化,尽管这种差异是边缘的,并且不太可能具有临床意义(在线补充材料)。调整后,肺癌往往比非癌性肺病更高,虽然这在统计学上没有统计学意义(38.5相对30.8 ng·ml-1,p = 0.06)。在其他癌症中,维生素D较低(15.7 ng·ml-1,p <0.01)。这显示在图2A。肺癌患者中三种常规类维生素D水平的频率显示在图2B.。肺癌患者的DBP低于非癌症肺病(33.7相对45.5 mg·dl-1,p = 0.02)但与其他癌症没有差异(35.9 mg·dl-1,p = 0.72)。这也显示在图2A。DBP和Cholecalciferol并未与彼此相关(P = 0.62)。白蛋白在组之间没有显着变化(P> 0.32);在胆碱之间没有显着的相关性(p = 0.72)或dbp(p = 0.24)。
在数据分析时,所有患者均经历了≥12个月的随访。1-YR存活率为79.1%。在他们在随访期间死亡的人,中位数致死的时间为0.93岁(范围0-3.54 YRS);when only cancer-related deaths were selected, mean time to death was 1.04 yrs (range 0–3.45 yrs).在协变量的平均值,排除DBP和维生素D的平均值的存活率图3A并为DBP的四分位数进行次数图3B.。舞台,年龄和包装较少年烟熏是所有显着的死亡预测因子(p = 0.039,p = 0.005分别分别分别),而性别没有(p = 0.96)。在全因死亡率分析中,既不是DBP也没有25OHD3.预测死亡(P> 0.30)。当考虑肺癌中的死亡时,DBP成为预测的因子(P = 0.041),每单位下降至0.95(95%CI 0.91-0.98)的死亡的差率比为DBP。为了使其进入上下文,肺癌患者表现出与我们的健康队列中的DBP水平相当的DBP水平将对与在我们的队列中看到的平均DBP水平的患者相比,死亡率为0.59。显示了DBP分析的进一步细节表2.;广泛的置信区间反映了少数死亡人数。
白蛋白也被评估为预测因子,以确定DBP效应是否具体;白蛋白不显着(p = 0.38)。Cholecalciferol没有预测肺癌死亡(p = 0.52)。
肺癌和正常肺组织VDR和DBP的评估
在正常的肺组织中,VDR在支气管上皮中最强烈表达,肺炎肺细胞染色较小(无花果。4A和B.).只有一个肿瘤没有表现出VDR表达;然而,一半表现出比来自该个人的正常肺组织更不强烈的染色(无花果。4C.和d)。在正常的肺组织中,DBP主要存在于血液和气道分泌物中,巨噬细胞较小染色(无花果。4E和F.).一般来说,肿瘤组织仅染色阳性的坏死区域和相关巨噬细胞的DBP;在其他地方,它表现出气道分泌物的一半强度(无花果。4G和H.).16%的肿瘤显示没有DBP表达。与肺肿瘤的VDR和DBP表达相对较低,通过蛋白质印迹表现出八种肺癌细胞系,与四个正常肺样品的阳性对照印迹相比,这些蛋白质的表达低或没有表达这些蛋白质(无花果。5.).使用正常肺组织作为阳性对照,因为在肺切片中检测到这些蛋白(无花果。4.).
讨论
我们已经表明,手术前的低血清DBP可能是从肺癌的后续死亡的预测因子,并且DBP的表达在肺癌组织中低或不存在。这支持肺癌中DBP的病原作用,这是基于其在正常肺和肿瘤中坏死区域的巨噬细胞的位置,最有可能将其作为DBP-MAF的前体中的作用。似乎没有通过肺组织广泛产生的DBP,但从血液中扩散到气道分泌物和组织液中,鉴于在正常肺样品中的任何初级肺部细胞中观察到少量染色,并且来自细胞系的蛋白质斑点显示出没有表达。这可以解释为什么血清标记能够预测肺特异性结果。正常肺和肿瘤的少量DBP表达仍然是一种可能性。肺癌中的预后标志物包括Ercc1,表皮生长因子受体,RRM1和KRA,但大多数这些优于循环血液的肿瘤中的标记更好地验证[20.].最近对肺癌生物标志物的综述指出,已经回顾性地对临床试验收集的样品进行了许多正在寻呼这些生物标志物和生存的研究,使其在预测对治疗的反应而不是结果中的作用本身更了解[20.].DBP最低四分位数的危险比与高水平的循环癌细胞赋予的最近循环癌细胞,在最近的101例III阶段或IV NSCLC患者[21.].
尚未详细研究DBP和肺癌之间的联系;循环DBP水平的一项研究显示癌症和健康个体之间没有差异[22.].然而,用于测量本研究中使用的DBP的技术比目前的ELISA敏感得多,并且研究本身并不特异于肺癌,共有100例在肺,前列腺和胃肠恶性肿瘤之间分裂。最近,肺癌小鼠模型中的蛋白质组学作品表明DBP作为疾病生物标志物[23.].DBP通过促炎细胞因子和类固醇进行转录水平调节[24.,可能与营养和分解代谢状态有关,就像白蛋白一样,因为它属于蛋白质家族。我们没有显示生存与白蛋白水平的任何关系,但不能排除舒张压与影响我们的舒张压死亡率分析的另一个未测量的不良预后因素有关的附带现象。
以前的作品表明,由于α-的动作,恶性肿瘤转换为DBP-MAF的转化可能会减少恶性肿瘤N- 乙酰甘油酰胺氨基氨基酶[25.].在肿瘤侵袭过程中,癌组织中的各种细胞产生外喹啉酶[26.],如果后者进入血液,它们能够进行脱糖基化循环DBP,这是似乎与鼠模型中肿瘤负担有关的过程[27.].我们的数据显示,肺癌患者的血液中DBP浓度低。因此,即使没有涉及DBP脱糖基化,巨噬细胞活化可能会较低,影响预后不利。由于这些原因,已经提出了DBP-MAF的增强作为手术癌症的辅助治疗;实际上,在结肠癌和前列腺癌中,以这种方式使用的DBP-MAF免疫疗法在早期试验中使用和良好耐受[28.那29.].DBP-MAF还对乳腺癌细胞显示有益效果体外[30.].这些概念需要在DBP-MAF试验之前进一步跟进,在肺癌中适用,但为研究提供了令人兴奋的新途径。具体地,将来需要对DBP-MAF的表达和肺组织中的脱糖基化机制的更广泛分析。
Cholecalciferol在我们的生存分析中没有预测结果。已经在肺癌中检测维生素D状态少数研究。Z.侯等。[31.[456款早期NSCLC患者,调查了手术季节和维生素D摄入的联系和维生素D摄入量。他们得出结论,季节和摄入的关节效果相关,更高25Ohd3.水平与完善的总体和复发的存活率相关[31.].在我们的研究中,夏季水平较高,虽然差异不太可能是临床意义;由于这个原因没有进行手术季节的特定存活分析。由于维生素D的主要来源是在阳光照射后皮肤的合成,几项研究已经研究了癌症风险和生存的季节性和地理变异[32.那33.].其中一个研究调查了诊断和住宅区季节对挪威肺癌患者肺癌死亡风险的影响[34.].结果表明,肺癌诊断的维生素D状况具有预后价值,并且随着阳光照射的增加而降低癌症死亡率[34.].我们的结果与这些研究截然相反,这可能是因为研究队列的不同。首先,我们的患者中不足20%的人缺乏维生素D (无花果。2B.).其次,我们表明大多数肿瘤表现出比普通上皮组织更低的VDR表达。这意味着肿瘤对维生素D的反应不太敏感,从而防止其抗肿瘤活动。我们的免疫组织化学结果同意对正常,美化和恶性支气管组织中VDR表达的更大研究[6.].此外,它们也与遗传流行病学作品一致,表明这一点VDR.导致VDR功能减少的多态性与恶性有关[35.].这种观察结果回应了表现出较小的肺癌研究VDR FOK.我多态性与NSCLC中的存活率更严重[36.那37.虽然了Taq我多态性影响肺癌风险,其效果通过年龄,性和吸烟习惯来修改[38.].也可能是未测量的混淆,如体重,可能对我们的结果产生影响。
我们的研究仅限于手术切除的病例,这导致生存分析的数量相对较少;尽管如此,这一群体在规模和特征方面仍具有竞争力。女性患者的比例高于平均水平,许多病例的病理分期相当晚期(IIIa或b期),这可能会降低结果推广到其他患者队列的能力。在我们的分析中,我们没有正式说明辅助治疗的使用,因为只有3名患者接受了辅助治疗;考虑到这个数字很低,我们认为这样做是没有信息的,但承认这有很小的机会影响结果。该研究也是第一个报道肺内DBP免疫组化的研究。我们无法证实类似的位置在巨噬细胞由菲律宾colocalisation和CD68污渍由于高水平的背景染色的双重染色图像(数据没有显示,可以在请求),虽然很多幻灯片展示形态染色的细胞类型。我们修正了对多个测试的分析,并承认只有未调整的DBP值达到显著性,因为测试了四个四分位数。然而,考虑到这组患者生存率的显著差异,以及我们提供的支持我们研究结果的功能数据,仍有可能具有临床意义。
综上所述,我们已经证明低循环DBP浓度可能预测非小细胞肺癌的不良预后,我们假设这是因为它是DBP- maf的前体。在确定DBP作为预后指标的有效性之前,需要在更大的队列中进行独立的复制和评估。如果我们的结果被其他组验证,进一步的研究来确定DBP-MAF是否在未来可能是一种有用的治疗可能是值得的。
致谢
作者谨慎感谢胸部外科部的员工(英国NHS Trust,英国伯明翰伯明翰的心脏),他们为组织收集做出了贡献。我们也感谢J. Yang和V. Novitskaya(伯明翰大学,伯明翰大学)的帮助,以帮助肺细胞系文化。
脚注
这篇文章有补充资料可从www.www.qdcxjkg.com.
支持声明
是。Turner由西米德兰兹胸基金和癌症研究英国支持。L. McGowan由内分泌学会提供支持。M.G.Tomlinson由英国心脏基金会的高级奖学金支持。F. Berditechevski由癌症研究英国支持。B. Naidu由健康基金会和中兰斯肺组织协同支持。没有资助者对工作的设计,行为或分析有任何贡献。
感兴趣的语句
没有宣布。
- 收到了2012年1月6日。
- 公认2012年4月14日。
- ©2013年