文摘
气道重构和肺气肿是主要的结构异常的慢性阻塞性肺病(COPD)。此外,可能发生肺血管重塑和导致肺动脉高压,慢性阻塞性肺病的发病率。胆碱能活性增加慢性阻塞性肺病导致气流限制,可能,炎症和气道重塑。
本研究旨在探讨乙酰胆碱的作用在肺部炎症和重塑使用COPD动物模型。这一目标,豚鼠鼻内灌输与脂多糖(LPS)为12周,每周两次治疗,通过吸入,长效毒蕈碱的受体拮抗剂tiotropium。
重复有限合伙人暴露诱导气道和实质嗜中性,杯状细胞数量增加,肺羟脯氨酸含量、气道壁胶原蛋白和空域的大小。此外,有限合伙人的数量增加微血管肌的动脉外膜软骨航空公司。Tiotropium废除LPS-induced增加中性粒细胞,杯状细胞,胶原沉积和微血管肌,但没有影响肺气肿。
总之,tiotropium抑制改造航空以及肺部炎症的慢性阻塞性肺病的豚鼠模型,表明内源性乙酰胆碱在这种疾病的发病机制中起着重要作用。
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一种炎症性疾病,特点是肺功能进行性下降和不完全可逆的气流限制。慢性阻塞性肺病的结构特点,这导致气流限制,包括肺气肿和气道重塑,以气道粘液细胞增生和纤维化(1]。此外,肺血管重塑已经观察到,即使在轻度慢性阻塞性肺病患者(2,3]。COPD的肺血管重塑的特点是平滑肌增殖,导致动脉的血管壁增厚4,5]。此外,有证据表明muscularisation小型船舶,没有平滑肌层在健康的条件下(5,6]。虽然在慢性阻塞性肺病组织改造的机制在很大程度上是不清楚,慢性肺部炎症,特点是浸润的中性粒细胞,巨噬细胞、CD4和cd8 +淋巴细胞,b细胞,可能是重大的7]。
抗胆碱能类作为支气管扩张剂治疗慢性阻塞性肺病(表示8]。然而,最近的报告显示,抗胆碱能类bronchodilation之外的可能影响。因此,最近的提升研究(理解潜在的长期影响函数与Tiotropium) (9- - - - - -11]表明,使用长效抗胆碱能tiotropium溴化,与急性加重的数量减少,呼吸和心脏慢性阻塞性肺病患者的发病率和死亡率(9,10]。此外,预先确定提升研究的亚组分析显示保护作用的tiotropium post-bronchodilator用力呼气量在1 s (FEV1)下降的全球倡议对慢性阻塞性肺疾病(黄金)II期慢性阻塞性肺病患者11]。
气道主要是受副交感神经支配胆碱能神经元,它调节气道平滑肌收缩和粘液分泌(ASM) (12- - - - - -14]。Bronchomotor语气中增加慢性阻塞性肺病,大概是因为增加神经元释放乙酰胆碱(ACh),这是主要的可逆的气流阻塞在这个疾病的组件(8,12]。越来越多的证据表明,除了神经疼,non-neuronal ACh也可能扮演一个角色在COPD的发病机制12]。因此,ACh-synthesising酶胆碱乙酰转移酶(聊天),以及毒蕈碱的受体,表达结构和肺部炎症细胞(12]。值得注意的是,增加了聊天的表情被发现在吸烟者和COPD患者肺成纤维细胞(15]。毒蕈碱的米3受体刺激已经被证明可以有效的释放由肺泡巨噬细胞(中性粒细胞趋化现象的活动16),诱导白介素8 (IL)释放支气管上皮细胞(17)和单核细胞(18,增加香烟烟雾诱发引发释放ASM细胞(19]。此外,毒蕈碱的受体受体激动剂被证明刺激或加强肺成纤维细胞的增殖20.)和ASM细胞(21),以及肺成纤维细胞胶原合成(22]。总的来说,这些数据表明促炎症和肺pro-remodelling调节作用哦。依据这样的角色也被发现在慢性过敏性哮喘豚鼠模型。在这个模型中,这是证明tiotropium减少气道嗜酸性粒细胞,ASM改造和杯状细胞增生,在反复过敏原接触(23,24]。此外,tiotropium最近被证明能够抑制气道炎症和重塑gastro-oesophageal返流性疾病的小鼠模型(25]。
目前,空调采暖的作用的开发和进展慢性阻塞性肺病是未知的。在目前的研究中,我们使用豚鼠模型解决这个问题的脂多糖(LPS)全身的慢性阻塞性肺病。有限合伙人是一个组件的外墙革兰氏阴性细菌,和有机粉尘的污染,环境污染和烟草烟雾(26),和与慢性阻塞性肺病的发展有关27]。此外,有限合伙人可能扮演重要的角色在细菌侵染诱导的急性加重的慢性阻塞性肺病,有助于疾病的进展(28]。因此,在各种动物模型,有限合伙人的吸入诱导慢性阻塞性肺病的病理特征,如嗜中性,杯状细胞增生,气道纤维化和肺气肿29日- - - - - -32]。在目前的研究中,我们提出证据表明ACh过程中起着重要作用的发展肺部炎症和气道重塑。
方法
动物
远,男,指定无菌邓肯哈特利豚鼠(哈伦,希斯菲尔德,英国)重350 - 400克。本研究中所描述的所有协议格罗宁根大学动物实验委员会批准,格罗宁根,荷兰。
有限合伙人滴注法
有意识的豚鼠在直立位置,而200μL有限合伙人(5毫克·毫升−1在无菌生理盐水)慢慢地灌输鼻内。鼻内灌输的解决方案是吸气后,动物被保存在直立位置为一个额外的2分钟允许足够的传播在整个航空公司的液体。控制动物被灌输200μL无菌生理盐水。
试验协议
豚鼠是受到鼻内滴注法与有限合伙人或盐水每周两次,连续12周。30分钟前每个滴注法、动物收到nebulised溴化剂tiotropium(勃林格殷格翰集团、殷格翰集团、德国)盐水3分钟(0.1毫米)或生理盐水(3分钟),使用DeVilbiss喷雾器(646型;DeVilbiss医疗、萨默塞特、美国宾夕法尼亚州)如前所述33]。这个剂量的tiotropium曾被证明诱导防止吸入乙酰甲胆碱为∼96 h(可测量的34]。24小时后持续滴注法、豚鼠被实验牺牲脑震荡快速放血紧随其后。肺都被立即切除并保持在冰上进行进一步处理。
组织分析
横向冷冻截面(4μm)中间的肺叶用于组织学和免疫组织化学分析。识别平滑肌和杯状细胞,部分染色为平滑肌肌球蛋白重链(sm-MHC)或MUC5AC,分别,如前所述24]。中性粒细胞被染色的部分确认为TNAP(组织非特异性碱性磷酸酶活动)35]。免疫组织化学染色,主要抗体(所有从Neomarkers弗里蒙特、钙、美国)的视觉使用辣根peroxidase-linked二级抗体(σ,圣路易斯,密苏里州,美国),diaminobenzidine·毫升(0.3毫克−1)和硫酸镍铵(25 mg·毫升−1),改编自亚当斯(36]。部分与苏木精复染色。航空公司内部分数码拍摄和归类为软骨或noncartilaginous。所有免疫组织化学进行了数字化测量使用量化软件(ImageJ;美国国家卫生研究院,马里兰州贝塞斯达;http://rsb.info.nih.gov/ij/)。为此,数字照片进行分析的放大40 - 400×。对于每一个动物,两肺部分准备/染色,总共2 - 6航空公司的每个分类进行分析。气道中性粒细胞数在动脉外膜和sub-mucosa,积极,表示为每毫米基底膜染色细胞长度。实质中性粒细胞计数,积极染色细胞数在5个随机微观领域使用目镜方格图,表示总细胞数的比例。MUC5AC-positive细胞在上皮细胞层数和长度表示为每毫米基底膜的细胞数量。微血管sm-MHC的彩色正面是计算动脉外膜软骨的航空公司,表示为每平方毫米动脉外膜血管的数量。
右上肺叶切除,膨胀和福尔马林固定的恒压25而言不啻2O 24 h,嵌入在石蜡。4-μm粗石蜡部分被削减。评估的肺气肿,石蜡切片苏木精和伊红染色。均值线性拦截(多层互连)是决定测量的肺泡领空大小,使用20 - 25显微照相机图像(放大200×)/动物,像前面描述的那样37]。评估气道壁的胶原蛋白、石蜡切片与天狼星红染色与苏木精复染色。Noncartilaginous航空数码拍照(放大100 - 200×)和个人彩色图像被分为红、绿、蓝通道。使用ImageJ,绿色通道的黑白图像被转换为二进制图像使用阈值函数。在气道壁积极染色区域,从基底膜的外膜边界,确定每个动物的2 - 6的航空公司。气道壁胶原面积是正常基底膜的长度的平方。评价肺血管重塑,石蜡切片是沾染了Weigert弹性蛋白(间苯二酚/碱性品红)和Van Gieson污渍。根据van Suylen进行了测量et al。(38]。船面积肺动脉被定义为该地区板内弹力外,和腔区域被定义为该地区板内弹力interna。内侧区之间的区域板弹力interna和板弹力答辩。内侧区域是正常腔区域。肺动脉与外部直径30 - 100μm进行分析。肺小动脉壁地区之间的区域被定义为板弹力外腔,并正常腔区域。只有船舶最短与最长/直径比< 2进行分析。
羟脯氨酸测定
肺进行分析对羟脯氨酸是胶原蛋白含量的估计39,如前所述40]。肺组织匀浆是由粉碎在液态氮,其次是sonification PBS。随后又孵化匀浆,v / v 5%三氯乙酸在冰上20分钟。样本离心机和颗粒在10毫升的12 N resuspended盐酸和加热一夜之间在110°C。2毫升水的样本重组孵化72 h在室温下,采用间歇涡流。5-μL样本与100年孵化μL氯胺T(1.4%氯胺T 0.5 / 10%异丙醇乙酸钠)在96孔板,在室温下为30分钟。接下来,100年μL埃利希的解决方案(1.0米4-dimethylaminobenzaldehyde 70%异丙醇/ 30%高氯酸)添加和样本孵化为30分钟65°C。样品冷却到室温和量化了羟脯氨酸的含量比色测量(550海里;Biorad 680板的读者;Biorad,赫拉克勒斯、钙、美国)的吡咯衍生物羟脯氨酸,这形成了一个发色团Erlich设计的试剂。浓度计算使用标准曲线。数据表示为钾的羟脯氨酸/肺。
统计分析
数据意味着±扫描电镜。除非另有规定,统计差异意味着使用单向方差分析计算,其次是Boniferroni或Newman-Keuls多重比较检验,是适当的。差异被认为是显著p < 0.05。
结果
炎症
中性粒细胞是一个主要的炎性细胞参与了COPD的发病机制。重复有限合伙人滴剂诱导中性粒细胞的数量显著增加软骨(2.0倍)和noncartilaginous(1.9倍)航空公司以及薄壁组织(2.1倍)(图1)。Tiotropium治疗完全抑制LPS-induced嗜中性在这些隔间。中性粒细胞数量不受tiotropium saline-challenged航空或实质的动物。这些数据表明,tiotropium有深远的长期抗炎活动LPS-instilled几内亚猪。
MUC5AC表达
为了调查有限合伙人的影响和tiotropium食用杯状细胞,部分沾MUC5AC抗体。重复有限合伙人滴剂诱导显著增加3.1倍数量的MUC5AC-positive上皮细胞的豚鼠的软骨航空公司(图2)。Tiotropium治疗完全抑制LPS-induced增加,而在saline-challenged动物没有影响。
气道纤维化
评估纤维化改变,肺进行分析对羟脯氨酸是胶原蛋白含量的估计。重复有限合伙人滴剂诱导肺总羟脯氨酸含量的显著增长了1.3倍(图3)。确认胶原沉积确实增加气道隔间,天狼星红染色评估noncartilaginous气道壁的航空公司。LPS诱导气道壁胶原蛋白含量增加1.7倍。Tiotropium完全抑制羟脯氨酸和气道壁胶原沉积引起的重复LPS滴剂,在saline-challenged动物而没有效果。
肺气肿
为了评价肺泡空域的大小,确定多层互连在石蜡包埋肺部分。增加7.3%多层互连观察12周后每周有限合伙人灌注物(图4)。Tiotropium大小没有影响空域有限合伙人(或saline-instilled动物。
血管重塑
评估肺血管重塑,肺动脉内侧区和肺小动脉壁区测定formalin-fixed,石蜡包埋豚鼠肺部分沾Weigert的弹性蛋白和Van Gieson污渍。重复的有限合伙人滴剂和tiotropium治疗影响肺动脉或墙的内侧区域面积肺小动脉(图5)。除此之外,没有证据表明肺血管的内膜的增殖的分类。然而,重复有限合伙人滴剂的数量增加肌的动脉外膜微血管(sm-MHC-positive)软骨航空(2.4倍)(图6)。增加被tiotropium完全抑制。
讨论
在这项研究中,我们首次展示,tiotropium吸入抑制嗜中性,MUC5AC表达和气道纤维化动物模型重复LPS引起的慢性阻塞性肺病的风险。此外,我们表明,重复有限合伙人滴剂诱导改造气道血管外膜的在这个模型中,由tiotropium抑制。总的来说,这些数据表明,内生,代理通过毒蕈碱的受体,在肺部炎症中起着重要作用,以及在COPD气道重塑。
中性粒细胞数量增加痰及支气管肺泡灌洗液的COPD患者(41]。此外,慢性阻塞性肺病严重程度之间的相关性和嗜中性粒细胞数量的大型航空公司和百分比neutrophil-containing小航空公司据报道(41]。哦可能导致嗜中性刺激释放指示从孤立的肺泡巨噬细胞(中性粒细胞趋化现象的活动16和孤立的痰液细胞的慢性阻塞性肺病患者42]。此外,激活毒蕈碱的受体表达的气道结构细胞,包括支气管上皮细胞(17)和ASM细胞(19),也可能导致中性粒细胞封存在肺部通过诱导或增加引发由这些细胞释放。此外,高容量的中性粒细胞合成乙酰胆碱(43]意味着嗜中性可能导致增加non-neuronal ACh释放在肺。在我们的研究中,重复有限合伙人暴露增加中性粒细胞数量在航空公司和实质。因为这个LPS-induced tiotropium吸入完全抑制中性粒细胞炎症、空调采暖的主要作用是被推断出来的。
粘液分泌过多是慢性阻塞性肺病的特征,导致气流阻塞的重要原因。MUC5AC表达可以调节各种各样的刺激,包括香烟、有限合伙人和中性粒细胞弹性蛋白酶,增加在慢性阻塞性肺病患者的气道上皮细胞44]。目前的研究表明,内生ACh也起着至关重要的作用在LPS-induced MUC5AC表达。有趣的是,早在1973年,杯状细胞增生一直观察后重复毒蕈碱的受体激动剂在实验动物管理45]。
气道纤维化导致小气道增厚和气流限制在慢性阻塞性肺病46]。乙酰胆碱的作用在COPD气道纤维化目前未知。然而,在体外研究表明,乙酰胆碱能诱导肺成纤维细胞的增殖20.由这些细胞[],胶原蛋白合成22]。此外,最近增加了聊天的表情中发现肺成纤维细胞健康的吸烟者和慢性阻塞性肺病患者(15),这表明non-neuronal ACh可以调节成纤维细胞功能以自分泌的方式在这些条件下。我们的研究结果表明,tiotropium抑制LPS-induced胶原蛋白积聚在肺部和气道壁,表明ACh可能是气道纤维化的主要监管机构。除了可能直接影响空调采暖的成纤维细胞在此过程中,它对中性粒细胞也可以发挥作用的影响。因此,增加中性粒细胞弹性蛋白酶活性,观察慢性阻塞性肺病(41),也与肺纤维化疾病有关,如特发性肺纤维化(47]。潜在的中性粒细胞弹性蛋白酶在肝纤维化中的作用得到老鼠的研究,表明嗜中性粒细胞弹性蛋白酶抑制(48)或基因删除(49在这些动物)抑制bleomycin-induced肺纤维化。
LPS诱导显著增加肺泡领空的大小,这是表明肺气肿。观察增加多层互连后12周的每周有限合伙人滴注法是与前面描述的类似规模的16周后小鼠暴露于香烟烟雾中(37]。在我们的研究中,没有证据表明发展的参与的ACh LPS-induced肺气肿。因此,tiotropium没有显著影响空域大小有限合伙人(或saline-instilled动物。这可能意味着中性粒细胞炎症不是必不可少的LPS-induced肺气肿的发展,对应与先前的观察在COPD患者41]。导致LPS-induced肺气肿的发展机制并不完全清楚,但可能从中性粒细胞释放elastolytic酶发挥作用。虽然慢性LPS-induced实质嗜中性在我们的模型中被tiotropium抑制,这并不一定意味着中性粒细胞没有导致肺泡的破坏。最近对老鼠的研究表明,急性LPS-induced支气管肺泡灌洗嗜中性(4 h post-LPS暴露)是不受tiotropium预处理[50]。这一发现表明,tiotropium并不抑制急性LPS-induced信号,从而导致neutrophil-attracting趋化因子的释放,导致急性嗜中性。自从短暂暴露于中性粒细胞弹性蛋白酶可能已经导致肺气肿,急性tiotropium-resistant中性反应后每个有限合伙人滴剂可能足以引发肺气肿的发展。此外,其他类型的炎症细胞如巨噬细胞、cd8 + t淋巴球和b细胞,也可能贡献(37,41]。
肺血管重塑发生在COPD患者和可能导致这些患者的肺动脉高压(51]。在COPD肺血管重塑的特点是血管壁的增厚以及muscularisation没有的微血管平滑肌层在健康的条件下(4,6]。COPD的肺血管重塑的精确机制不清楚,但可能包括缺氧、炎症和香烟烟雾成分,导致内皮功能障碍和释放生长因子(52]。血管壁厚度的增加主要是由于在内膜平滑肌细胞增殖(4)以及媒体的增厚(6]。有趣的是,肺动脉增厚和小型船舶数量的增加有利于平滑肌肌动蛋白被发现在3或6个月后豚鼠暴露于香烟烟雾中(53]。相比之下,在目前的研究中,任何有限合伙人对肺动脉或小动脉厚度被发现。同样,有限合伙人并不影响ASM质量在同等条件下(数据没有显示)。然而,有限合伙人并增加微血管肌的动脉外膜软骨航空公司。tiotropium强抑制作用的增加表明在这一过程中内源性乙酰胆碱的主要角色。虽然这些变化机制目前未知,气道炎症可能会扮演一个角色(54]。这是支持的观察其抑制中性粒细胞浸润和tiotropium尤其观察外膜间的航空公司(数据没有显示)。
最近,提高试验的结果表明,tiotropium治疗COPD患者减少发作,呼吸和心脏不良事件的发生率和死亡率(9,10]。一个预先确定的亚组分析还表明,在黄金阶段II慢性阻塞性肺病,tiotropium治疗减少post-bronchodilator FEV的下降速度1(11]。虽然这些影响的机制仍有待建立,数据从我们的动物模型表明,抗炎和anti-remodelling属性的药物可能会涉及。
总之,我们的研究表明,吸入tiotropium抑制肺部炎症和气道重构在慢性阻塞性肺病的豚鼠模型,表明内生ACh可能这种疾病的发病机制中发挥重要作用。
脚注
支持声明
本研究在经济上支持勃林格殷格翰集团制药GmbH & Co .公斤,行为和认知神经科学研究生院,格罗宁根,荷兰格罗宁根大学。
感兴趣的语句
语句对r . Gosens j . Zaagsma h·穆尔,研究本身可以找到www.www.qdcxjkg.com/site/misc/statements.xhtml
- 收到了2010年9月15日。
- 接受2011年2月9日。
- ©2011人队